Evaluarea aerogelului de alginat de calciu administrat oral asupra modificărilor microbiotei intestinale și a funcției hepatice și renale la șobolanii Wistar

Contact:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar et al

Abstract

Prezentul studiu evaluează efectul aerogelului de alginat de calciu ca potențial purtător de droguri asupra ficatului șifuncțiile rinichilorși asupra microbiotei intestinale a șobolanilor Wistar. Aerogelul de alginat din studii a fost preparat sub formă de nanoparticule folosind tehnica de tăiere cu jet și au fost caracterizate în termeni de suprafețe specifice, morfologie exterioară și distribuție a dimensiunii particulelor. Pentru studiul in vivo, aerogelul cu alginat de calciu a fost administrat pe cale orală, iar ficatul șifuncțiile rinichilorau fost testate timp de o săptămână și patru săptămâni în două studii distincte. În timpul studiului in vivo pe termen scurt, au fost colectate probe de fecale pentru extracția ADN-ului bacterian, urmate de analize de secvențiere a genei ARNr 16S pentru a detecta modificări în microbiota intestinală. Rezultatele au arătat că aerogelul de alginat preparat are o suprafață medie specifică BET de aproximativ 540 m2/g, cu un volum al porilor de 7,4 cc/g și o lățime a porilor de 30-50 nm. Studiul in vivo a relevat că nivelurile studiaterinichiiar enzimele hepatice nu au depășit cel mai înalt nivel din intervalul normal. Studiul microbiotei intestinale a arătat modele diferite; anumite grupuri de bacterii, cum ar fi Clostridia și Bacteriodia, au crescut în timpulaerogeluriregim şi a continuat să crească după ce aerogelul a fost oprit. În timp ce alte grupuri, cum ar fi Erysipeltrichia, și bacteriile Candidatus Sacha au crescut în timpulaerogeluritratament și apoi a scăzut din nou după o lună. Membrii clasei Bacili au arătat o tendință unică, adică după ce au fost grupul cel mai abundent (63 la sută) la momentul 0, abundența lor relativă a scăzut dramatic până a ajuns la < 5="" la="" sută;="" ceea="" ce="" a="" fost="" și="" după="" oprirea="" tratamentului="" cu="">

Cistanchetubulosa previnerinichiboala, efecte secundare cistanche, click.

Introducere

Aerogeluriterminologia a apărut pentru prima dată în 1931 de către Samuel Kistler, care le-a definit ca fiind materialele care își păstrează intactă structura porilor și rețelei la schimbul lichidului de pori cu gaz [1]. După 60 de ani de la descoperirea lor, organiceaerogeluriau fost propuse pentru aplicații biomedicale și de livrare a medicamentelor datorită suprafeței lor mari și structurii porilor deschisi [2]. Caracteristicile remarcabile ale acestei clase de materiale permit nu doar creșterea eficienței de încărcare, ci și îmbunătățirea biodisponibilității, stabilității și cineticii de eliberare a moleculelor încărcate.

Cercetare asupraaerogeluripentru administrarea orală de medicamente concentrată inițial pe utilizarea siliceiaerogeluridatorită chimiei sol-gel flexibile și binecunoscute, precum și posibilităților de derivatizare [3]. Cu toate acestea, utilizarea aerogelurilor de silice în formulările farmaceutice concepute pentru administrare orală ridică încă anumite preocupări din cauza biodegradabilității lor limitate. Prin urmare, apare o nevoie suplimentară de a dezvolta un suport de aerogel care să fie atât biocompatibil, cât și biodegradabil. Acest lucru poate fi posibil prin utilizarea de materiale organice naturale sau polimeri biodegradabili, cum ar fi alginatul [4] acidul hialuronic [5], chitosanul, celuloza [6] și proteinele [7].

Alginatul (Alg), extras din algele brune, este un copolimer liniar compus din monomeri ß-1,4-acidului D-manuronic și acidului -L-guluronic, care sunt intercalate modele asemănătoare blocurilor omogene sau eterogene. . Alginații au fost utilizați în industria alimentară și farmaceutică deoarece sunt netoxici, ieftini, biodegradabili și biocompatibili [8, 9]. Cationii polivalenți, cum ar fi Ca2 plus, Ba2 plus sau Sr2 plus, pot induce reticulare ionică a Alg, transformându-l dintr-o formă solubilă într-o formă insolubilă (gel).

Alg a fost utilizat pe scară largă în produsele alimentare și ca aditiv farmaceutic, cum ar fi un agent de gelifiere și un dezintegrant al tabletelor [10, 11]. A fost, de asemenea, utilizat în aplicații biomedicale, inclusiv livrarea de medicamente și ingineria țesuturilor [12]. Ca și alte fibre alimentare comestibile, Alg și derivații săi oligomeri sunt rezistenți la digestia de către enzimele endogene umane. Cu toate acestea, poate fi digerat semnificativ de microbiota intestinală umană [13]. În ciuda importanței sale, se știe puțin despre microbiota intestinală, care este responsabilă pentru degradarea Alg.

Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară (EFSA) a declarat siguranța acidului alginic și a sărurilor acestuia, precum și a produselor de fermentație ale acestora. Testele in vivo pentru absorbția și excreția soluțiilor și suspensiilor apoase de acid alginic și sărurile acestuia la animale au arătat incapacitatea acestora de a fi absorbite sau metabolizate de enzimele prezente în tractul gastrointestinal indiferent de forma utilizată în timpul administrării. Cu toate acestea, ele ar fi parțial degradate prin fermentație în timpul trecerii lor prin intestinul gros prin acțiunea microbiotei intestinale anaerobe, provocând mărirea cecală care a fost considerată de EFSA ca un proces adaptativ legat de dozele mari testate ca aditivi alimentari [14] . Cu toate acestea, niciun studiu anterior in vivo nu a examinat efectul alginatului de calciu (Ca-Alg) sub formă de aerogel asupraficat, rinichi,sau comunitatea bacteriană din intestine.

Microbiota intestinală este o componentă esențială a sistemului digestiv uman, deoarece ajută la degradarea alimentelor ingerate, în special a celor pentru care organismul uman nu are enzimele necesare [15, 16]. De asemenea, microbiota intestinală poate inhiba înflorirea microorganismelor patogene, concurând cu acestea pe resursele de nutrienți, sau prin producerea de substanțe chimice care să le inhibe creșterea. Cu toate acestea, s-a demonstrat că degradarea fibrelor digerabile ingerate, cum ar fi Alg, are loc în principal prin bacterii fermentate din colon [17]. Produsele acestui proces sunt acizii grași cu lanț scurt (SCFA), care sunt benefice pentru inflamația colonului și acționează ca anticancer. Brownlee şi colab. a raportat că incubarea Alg și a microflorei fecale umane a demonstrat că cea mai mare parte a degradării Alg este însoțită de o modificare a microbiotei intestinale. De asemenea, o astfel de incubare duce la producerea de SCFA și gaz după 24 de ore [17].

Materiale și metode

Materiale

Sarea de sodiu a acidului alginic a fost furnizată de BASF, Germania. Clorura de calciu (CaCl2) a fost achiziționată de la Th. Geyer GmbH & Co. KG, Germania. Dioxidul de carbon (puritate 99,5 la sută) a fost furnizat de Praxair (Germania), etanolul 99,8 la sută a fost obținut de la Carl Roth (Germania). Toate substanțele chimice au fost utilizate așa cum au fost primite. Trusele de diagnosticare comerciale au fost folosite pentru a măsura ALP, iar trusele de creatinină au fost achiziționate de la Biostsystems SA, Spania. Kitul de izolare PowerMax SoilDNA MO BIO a fost achiziționat de la MO BIO Laboratories, SUA. Pe tot parcursul studiului a fost folosită apă deionizată.

Metode

Prepararea particulelor de aerogel.

Primul pas în prepararea particulelor de aerogel a fost pregătirea soluției stoc; pentru acea pulbere de alginat de sodiu (Alg) a fost adăugată la apă distilată într-o concentrație de 1 procent g/g și a fost menținută sub agitare magnetică peste noapte la temperatura camerei. Pentru a prepara particulele de hidrogel, abordarea descrisă de Preibisch și colab. [18] a fost urmat, folosind Jet Cutter Type S de la Genia Lab, Braunschweig (Germania). În procesul de tăiere cu jet, soluția de alginat a fost aruncată printr-o duză (350 μm diametru) cu aer comprimat (1–3 bar) pentru a forma un jet (debit de masă de 1 g/s). Jetul a fost tăiat în particule separate cu un disc rotativ (40 de fire cu un diametru de sârmă de 100 μm al discurilor de tăiere, raportul cilindrilor de 5). După trecerea prin disc, soluția de polimer a căzut în jos în baia de gelificare cu o soluție de CaCl2 de 5 g/L. Pentru a evita aglomerarea particulelor de gel, volumul băii de gelificare a fost de cel puțin patru ori volumul total al soluției de biopolimer prelucrat, iar conținutul băilor a fost agitat cu o bară magnetică (60 rpm). Distanța de separare dintre duză și baia de gelificare a fost menținută la 50–70 cm. După colectarea particulelor de gel, agitarea a fost continuată timp de 60 de minute pentru a asigura gelificarea completă și pentru a evita aglomerarea. Particulele gelificate au fost apoi separate din baia de gelificare prin filtrare și au fost efectuate pentru schimbul de solvent.

Schimbul de solvent (apă la etanol) a fost efectuat pe particulele colectate treptat (30, 60, 90, 100 procente v/v etanol). Pentru a asigura schimbul complet, densitatea lichidului de înmuiere după ultima etapă de schimb de solvent a fost măsurată folosind un densimetru (DMA4500, Anton PaarCompany, Austria). Densitatea a fost apoi recalculată în conținutul de etanol. Particulele de alcogel rezultate au fost în cele din urmă împachetate într-o hârtie de filtru și uscate cu CO2 supercritic într-o autoclavă la o temperatură constantă de 50°C și o presiune de 120 bar. Fluxul continuu de CO2 (20-80 g/min) a fost setat până când s-a făcut extracția completă a etanolului (2-4 ore). Ulterior, s-a efectuat depresurizarea lentă a autoclavei (1–3 bar/min). Odată ce presiunea ambiantă a fost atinsă, autoclavul a fost deschis și microsfere de aerogel de alginat de calciu (denumite în continuare Ca-Alg) au fost colectate și depozitate în recipiente bine sigilate în condiții uscate.

Caracterizarea particulelor de aerogel

suprafețele specifice ale particulelor de aerogel au fost măsurate prin adsorbție/desorbție de azot la temperatură joasă (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Germania și Micromeritics TriStar II 3020, Germania). Înainte de măsurători, probele au fost uscate timp de 20 de ani sub vid (< 1="" mpa)="" at="">

Investigarea morfologiei exterioare a particulelor de aerogel preparate a fost efectuată printr-o analiză cu microscop electronic cu scanare (SEM) (Zeiss Supra VP55, Jena, Germania) la o tensiune de accelerație de 3 kV și o distanță de lucru de 9.0– 9,4 mm. Probele au fost pulverizate cu aur (grosime de 10 nm) înainte de imagistică pentru a minimiza încărcarea și pentru a îmbunătăți contrastul imaginii.

Măsurătorile distribuției mărimii particulelor au fost efectuate de trei ori pentru fiecare probă constând din aproximativ 10,000 particule. Analiza dinamică a imaginii a fost efectuată utilizând un Camsizer XT cu modul X-Jet (Retsch GmbH, Germania) cu aer presurizat la 50 kPa.

Studii ale funcției hepatice și renale și ale microbiotei intestinale

A fost efectuat un studiu pilot pe un număr mic de animale împărțite în diferite grupuri pentru a acoperi patru niveluri de doză de substanțe de tratament. Ea a fost efectuată pentru o perioadă scurtă de timp (1 săptămână) pentru a vedea doza maximă posibilă de aerogeluri Ca-Alg care nu are efecte majore asupra funcțiilor renale sau hepatice și care nu prezintă semne de morbiditate sau mortalitate. Dozele au fost selectate atent luând în considerare DL50 orală raportată de alginat (mai mult de 5,000 mg/kg greutate corporală) [19]. Cu toate acestea, doza maximă fezabilă atinsă cu agitare minimă a animalelor a fost de 2,000mg/Kg greutate corporală.

În a doua parte a studiului, animalele au fost expuse la un nivel de doză fixă ​​timp de două săptămâni. În ceea ce privește variațiile de vârstă și greutate și condițiile de creștere în timpul acestui studiu, s-au respectat liniile directoare ale Organizației pentru Cooperare și Dezvoltare Economică (OCDE) (cod nr. 206). Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul de etică (IRB, Număr de aprobare: 2019-PHA{-12, atașat în fișierul S1) al Applied Science Private University (ASU), Iordania. Toți membrii personalului din adăpostul animalelor de la ASU sunt bine instruiți pentru a monitoriza orice modificări care ar putea apărea asupra animalului ca urmare a intervenției. Mai exact, ei monitorizează parametri precum modificările de greutate, comportamentele anormale, blana ciufulită, mobilitate redusă, postura corporală sau expresia unor markeri specifici de fluide corporale. În cazul oricăror modificări anormale grave în starea animalului, li se permite să utilizeze protocolul final uman care este aprobat de comitetul de etică de la ASU. La sfârșitul experimentelor, șobolanii au fost eutanasiați prin exsanguinare sub anestezie generală folosind 2,5% tiopental sodiu (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) la 20 mg/kg intravenos.

Animal

Atât în ​​studiile in vivo pe termen scurt, cât și pe termen lung, șobolani Wistar, sănătoși, de zece săptămâni, cu o greutate medie de 240 ± 37 g, au fost găzduiți la o temperatură de 21–23 ˚C și o umiditate de 35% –70% în încăperi controlate, cu cicluri de 12 ore lumină – 12 ore întuneric. Șobolanii au fost identificați și așezați individual în cuști cu laturi clare pentru ușurință de observare fără a le perturba comportamentul. Așchii de lemn au fost folosiți ca așternut. Șobolanii au fost hrăniți cu o dietă disponibilă în comerț (furnizor local, Iordania) și apă dulce a fost oferită gratuit.

Numărul de șobolani per grup în diferitele experimente a fost selectat în funcție de lucrările publicate anterior (exemple; [20–22]) și în funcție de reglementările stricte privind „îngrijirea și utilizarea animalelor” la nivel național și internațional, care pun accentul pe minimizarea numărul de animale utilizate în studiile de cercetare. Acestea includ, dar nu se limitează la, „Programul de îngrijire și utilizare a animalelor” de la Universitatea din California, Berkeley (https://acuc.berkeley.edu/about.html) și ghidul norvegian pentru utilizarea animalelor (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

Studiu pilot in vivo (doze repetate de 7 zile)

A fost efectuată o doză orală repetată pentru o durată de o săptămână pentru a defini doza maximă posibilă de aerogeluri care demonstrează siguranța la șobolanii Wistar. Aerogelul Ca-Alg a fost administrat oral la patru niveluri de doză de 50, 100, 250 și 500 mg corespunzătoare unei doze medii de 200, 400,1000 și, respectiv, 2000 mg/Kg (greutate corporală). Rezultatele au fost comparate cu două grupuri de control pozitiv cărora li sa administrat 50 și 500 mg de alginat de sodiu pur (Na-Alg) corespunzând nivelurilor medii ale dozei de 200 și, respectiv, 2000 mg/Kg greutate corporală. În cele din urmă, toate grupurile anterioare de tratamente cu aerogel Ca-Alg și Na-Alg au fost raportate la un grup de control (placebo). Ultimul grup a primit tampon fosfat într-o doză echivalentă cu doza maximă atunci când este administrat ca sistem vehicul pentru substanțele de testat. Grupurile de control și tratament pentru studiul pilot au constat din 4 șobolani/grup (două femele și doi masculi/grup). Pulberile solide de aerogel Ca-Alg și respectiv Na-Alg au fost suspendate în tampon fosfat (pH 7,4) și amestecate bine direct înainte de administrarea orală, deoarece șobolanii au refuzat să le mănânce în stare uscată. Pentru toate grupurile, administrarea la șobolani a fost inițiată la aceeași oră în fiecare zi folosind gavaj oral.

Studiu de expunere in vivo pe termen lung (studiu cu doze repetate de 15 zile)

Pe baza rezultatelor din secțiunea anterioară, doza de 250 mg de aerogel Ca-Alg a fost selectată pentru a fi evaluată în continuare pentru studiul de expunere pe termen lung (15 zile) Șobolanii Wistar au fost observați pentru orice reacții adverse renale și/sau hepatice imediate sau întârziate. efecte care pot apărea atunci când sunt expuse la aerogel Ca-Alg sau, respectiv, atunci când sunt expuse la Na-Alg. de. Pentru fiecare substanță testată, au fost utilizate trei grupuri de animale care au inclus un grup de control, un tratament și un grup satelit. Grupul de control a constat din 6 șobolani Wistar/grup (3 masculi și 3 femele), în timp ce grupurile de tratament și satelit au constat din 10 șobolani Wistar/grup (5 masculi și 5 femele). Șobolanii Wistar din grupurile de tratament au primit doza zilnică de 250 mg de substanțe de testat (aergel Ca-Alg sau Na-Alg) timp de 15 zile și au fost sacrificați în ziua 16. În timp ce grupurile satelit au fost tratate pentru aceeași durată ca și pentru grupurile de tratament, dar au fost mai degrabă ținute sub observație pentru încă 15 zile după tratament și au fost sacrificate în ziua 30.

De menționat că nu au fost posibile cele două studii ale aerogelului Ca-Alg și Na-Alg în paralel. Din acest motiv, nu a fost convenabil să se folosească un grup de control pentru ambele. Aceste grupuri de control au primit tampon fosfat oral doar timp de 15 zile și au fost ulterior monitorizate timp de 14 zile în continuare. Fiind un experiment pe termen scurt, pulberile solide de aerogel Ca-Alg și Na-Alg au fost de asemenea suspendate într-un tampon fosfat (pH 7,4) și amestecate bine direct înainte de administrarea orală. Pentru toate grupurile, administrarea la șobolani a fost inițiată la aceeași oră în fiecare zi folosind gavaj oral.

Observație clinică și comportamentală

În conformitate cu ghidurile OCDE 407, animalele au fost monitorizate zilnic pentru orice semne clinice anormale sau modificări ale comportamentului pe durata perioadei de studiu, cu o atenție deosebită în primele patru ore după administrarea substanței de testat. Animalele din grupurile satelit și de control au fost observate în continuare timp de încă 15 zile fără administrare de tratament. Grupul satelit permite detectarea oricăror semne clinice tardive care indică impactul hepatic și/sau renal prin măsurarea nivelurilor de fosfatazei alcaline (ALP) și creatininei.

Biochimia serului și analizele fecale

Spania. Probele de sânge au fost colectate din venele sinusurilor orbitale ale șobolanilor Wistar, care au fost apoi folosite pentru a diviza serul. Acest ser colectat din probe a fost apoi transferat în tuburi Eppendorf sterile și depozitat în congelator pentru testarea ulterioară a parametrilor biochimici. Probele de fecale au fost, de asemenea, colectate la fiecare două zile pentru a investiga modificarea structurii comunității microbiene. Fecalele au fost adunate în tuburi sterile curate de 15 ml cu capac cu șurub și au fost ținute direct la -20˚C până când toate probele au fost colectate. Pentru studiul cu doze repetate de 15-zile, s-au recoltat săptămânal numai probe de sânge pentru a măsura nivelurile de fosfatază alcalină (ALP) și creatinina, adică în ziua 0, ziua 7, ziua 14, ziua 21 și ziua 30 (ziua 21 și ziua 30 aplicate numai pentru grupurile de control și satelit).

Analiza comunității microbiene intestinale

Extracția ADN din probele de fecale colectate a fost efectuată utilizând kitul de izolare ADN PowerMaxSoil MO BIO (MO BIO Laboratories, SUA), urmând instrucțiunile producătorului. Purificarea prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) și secvențierea ADN-ului genomic (gDNA) au fost apoi efectuate utilizând Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, SUA). Amplificarea prin PCR a genei ARNr 16S și secvențierea sa ulterioară a fost realizată folosind Illumina. Primerii PCR cu regiune variabilă genei 16SrRNA V4 ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R și mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) cu un cod de bare pe primerul direct au fost utilizați în 30 de cicluri folosind Kit-ul HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, SUA). După amplificare, produsele PCR au fost verificate în gel de agaroză 2% pentru a determina succesul amplificării și intensitatea relativă a benzilor.

Apoi, produsul PCR reunit și purificat a fost utilizat pentru a pregăti biblioteca ADN Illumina. Secvențierea a fost efectuată cu ADN MR pe o secvențiere a microbiomului (MiSeq) urmând instrucțiunile producătorului. Datele secvențiate au fost procesate folosind conducta de analiză MR ADN. Pe scurt, secvențele au fost unite, apoi au fost epuizate de codurile de bare, după aceea, secvențele < 150="" bpas,="" precum="" și="" secvențele="" cu="" apeluri="" de="" bază="" ambigue="" au="" fost="" eliminate.="" secvențele="" au="" fost="" scoase="" din="" zgomot="" și="" au="" fost="" generate="" unități="" taxonomice="" operaționale="" (out)="" și="" himerele="" eliminate.="" otu-urile="" au="" fost="" definite="" prin="" gruparea="" la="" o="" divergență="" de="" 3%="" (asemănare="" de="" 97%).="" otu-urile="" finale="" au="" fost="" clasificate="" taxonomic="" folosind="" blastn="" față="" de="" o="" bază="" de="" date="" gestionată="" derivată="" din="" rdp-ii="" și="" ncbi.="" pentru="" gruparea="" ierarhică="" a="" fost="" utilizat="" un="" pachet="" de="" analize="" statistice="" diferite="" incluse="" în="" software-ul="" „r”="" (versiunea="" 3.5.1,="" pachet="">