Experimentul 3 Efectul glicozidei feniletanolului Cistanche Deserticola asupra modelului de perimenopauză la șobolan Ⅲ

Experimentul 3 Efectul glicozidei feniletanolului Cistanche deserticola asupra modelului de perimenopauză la șobolan

1 Materiale experimentale

1.1 Animale experimentale

Șobolani Wistar, grad SPF, femele, furnizați de Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., numărul certificatului de șobolan pentru acest lot: 0017216; numărul certificatului de laborator SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Medicamente experimentale

Cistanche deserticola feniletanol glicozida fost preparată conform metodei Experimentului 1, iar conținutul a ajuns la 66,47%. Gengnian'an Capsule, ingrediente: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, scoarță de bujor, Poria cocos, sidef, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, polygonum wflorheatum, flotant . Funcții și indicații:Hrănește yin-ul și supune yang-ul, ameliorează necazurilesi calmeaza mintea. Folosit pentru bufeuri și transpirații la menopauză, amețeli, tinitus, iritabilitate și insomnie. Specificații: 0,3 g per capsulă. Mod de utilizare și dozare: Oral, câte 3 capsule o dată, de 3 ori pe zi. Producător: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Număr lot de producție: 121104. Număr de aprobare: Nr. de aprobare națională pentru medicamente: Z14021848.

Izoflavone de soia și capsule moi de vitamina E, lista de ingrediente: pudră de izoflavone de soia, vitamina E, ulei de floarea soarelui, gelatină, glicerină, apă, tartrazină, dioxid de titan. Ingrediente si continut emblematice: Fiecare 100g contine 55,2 mg de izoflavone de soia (calculate ca genisteina) si 608,5 mg de vitamina E. Functii de sanatate: Creste densitatea osoasa. Instrucțiuni și doze: Luați 1 capsulă de 2 ori pe zi cu apă caldă. Specificatii: 500mg×100 capsule. Producător: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Număr lot de producție: 13070302. Număr de aprobare: National Food Health G20080032.

CÂT TIMP TREBUIE PENTRU CISTANCHEA?

1.3 Reactivi experimentali

Carboximetilceluloză de sodiu, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., număr lot: 20120418; penicilină de sodiu pentru injecție, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specificație: 4 milioane de unități, număr lot de producție: c1206807;

Soluție de formaldehidă (pură analitic), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., numărul lotului de producție: 20130902; 0,9% injecție de clorură de sodiu, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specificație: 250ml, număr lot de producție: 13082405B;

Hidrat de cloral, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, numărul de lot 20120827; Kit de detectare ELISA Rat E2, R&D Company, număr lot: 20140101A; Kit de detectare ELISA Rat T, Companie R&D, număr lot: 20140101A; Kit de detectare ELISA Rat LH, Companie de cercetare și dezvoltare, număr lot: 20140101A; Kit de detectare ELISA FSH pentru șobolani, Companie de cercetare și dezvoltare, număr lot: 20140101A;

2 Metode experimentale

2.1 Modelare și administrare a medicamentelor

Metoda de modelare: luați 100 femele de șobolan Wistar cu o greutate corporală de 210 ~ 230 g, selectați aleatoriu 12 șobolani ca grup necomplet și supuși unei intervenții chirurgicale simulate, iar șobolanii rămași vor fi utilizați pentru a crea menopauză. modele. După ce șobolanii au fost cântăriți, șobolanii au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală de hidrat de clor 10% (0,3 ml/100 g) și poziția abdominală a fost fixată. Apoi, șobolanii au fost tăiați de sub ultima coastă pe spate la intersecția liniei medii axilare și la aproximativ 2 cm de partea laterală a coloanei vertebrale și apoi dezinfectați. Pielea și mușchii spatelui sunt incizati aproximativ 1 cm, iar în câmpul vizual al inciziei se poate observa o masă de grăsime lucioasă, albă lăptoasă, iar ovarul este înglobat în acesta. Folosiți o pensetă mică pentru a prinde ușor masa de grăsime și trageți-o din incizie, separați masa de grăsime și veți vedea un grup de ovare subțiri, neregulate, galben-roșii. Când tăiați, mai întâi ligați trompa (inclusiv grăsimea) sub ovar cu un fir subțire, îndepărtați complet ovarul stâng și îndepărtați 80% din ovarul drept. După operație, coarnele uterine au fost repuse în cavitatea abdominală, mușchii și pielea au fost suturate și ambele ovare au fost îndepărtate în același mod. După operație, animalele au fost crescute cu grijă și injectate intramuscular cu 200,000 u/kg penicilină (0,1 ml fiecare) pentru a preveni infecția, o dată pe zi, timp de 3 zile consecutive. La 5 zile după operație, examinarea frotiului vaginal la șobolani a fost începută unul câte unul, o dată pe zi, timp de 5 zile consecutive. Șobolanii cu reacții estruale în frotiu au fost îndepărtați. Au fost selectați 72 de șobolani complet castrați și împărțiți aleatoriu în 6 grupuri. În scopuri experimentale, acestea sunt grupul model, grupul Gengnianan, grupul izoflavonelor din soia și grupul glicozidelor feniletanolului Cistanche deserticola în doze mari, medii și mici.

Metoda de preparare: Metoda de preparare: {{0}}.5% CMC Metoda de preparare: Se cântăresc 4 g de carboximetil celuloză de sodiu și se amestecă cu apă distilată pentru a obține 800ml. Dozele de doze mari, medii și mici de grupa de glicozide feniletanol Cistanche deserticola au fost 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg și, respectiv, 33,33 mg/kg (volum de administrare 1 ml/100 g). Metoda de preparare: Se cântăresc 1333,3mg, 666,7mg, respectiv 333,3mg flavonoide totale de zmeură, se dizolvă cu o cantitate mică de 0,5% CMC, apoi se reglează volumul la 100ml, se amestecă bine și gata. Gengniangan Capsule (450mg/kg, amestecat cu apă distilată la 45 mg/ml, 1ml/100g, echivalent cu de 10 ori doza clinică); Mod de preparare: Luați 15 capsule de Gengniangan, mai întâi dizolvați-le cu o cantitate mică de 0,5% CMC, apoi reglați volumul la 100 ml și amestecați bine, care este doza de suspensie de capsule de Gengnianan (450 mg/kg). Izoflavonă de soia Vitamina E capsule moi (166,67 mg/kg, utilizați apă distilată pentru a obține 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, echivalent cu de 10 ori doza clinică); Mod de preparare: Luați 4 capsule moi de izoflavone din soia vitamina E, mai întâi se dizolvă cu o cantitate mică de 0,5% CMC, apoi se reglează volumul la 120 ml și se amestecă bine pentru a obține doza de suspensie de capsule moi de vitamina E izoflavone din soia (16,67 mg/kg). ).

Metoda de administrare: animalelor din fiecare grup li sa administrat medicamentele corespunzătoare în a 10zi după operație. Grupul martor și grupul model au fost gavage cu același volum de soluție CMC 0,5% (volumul gavajului a fost de 1 ml/100 g), iar grupul Gengnianan a fost gavage cu suspensie de capsule Gengnianan (450 mg/kg, echivalent cu 10 ori doza clinică). ). ), grupului cu izoflavone din soia i sa administrat oral izoflavonă din soia suspensie de capsule moi de vitamina E (166,67 mg/kg, echivalent cu de 10 ori doza clinică), iar doza mare, medie și micăCistanche deserticola feniletanol glicozidgrupurile au fost administrate oral în funcție de grup. Doze mari, medii și mici de glicozidă feniletanol Cistanche deserticola (dozele sunt 133,33mg/kg, 66,67mg/kg, respectiv 33,33mg/kg, volumul dozei este de 1ml/100g), administrate o dată pe zi prin administrare intragastrică, continuu . medicament timp de 30 de zile.

2.2 Elemente de observare și metode de detectare

Scorurile de mișcare orizontal-verticală ale șobolanilor din fiecare grup au fost măsurate la 29 de zile după administrare. La 2 ore după ultima administrare gastrică (post timp de 15 ore), îndepărtați globii oculari pentru a colecta sânge, separați serul șiplasmăși măsurați conținutul de E2, T, LH, FSH, GnRH și BGP în ser și conținutul de -EP în plasmă; sobolanii au fost disecati. Îndepărtați timusul, splina, uterul și restul de 20% din țesutul ovarian, cântăriți greutățile umede ale acestora și calculați indicele de organ al timusului, splinei și uterului (indicele de organe=greutatea umedă a organului mg/greutatea șobolanului g) , și apoi îndepărtați creierul Pentru hipotalamus și glanda pituitară, s-au preparat omogenate de țesut din hipotalamus, glanda pituitară și 1/2 din uter, iar conținutul de receptori de estrogeni din hipotalamus, glanda pituitară și omogenate de țesut uterin și androgeni a fost determinat conținutul de receptor în omogenații de țesut hipotalamic. Timusul, splina, uterul și ovarul au fost fixate în soluție de formaldehidă 10%, încorporate în parafină, seccționate și colorate cu HE. Themodificări histomorfologiceîn fiecare grup au fost observate la microscop optic.

2.2.1 Testul metodei în câmp deschis

Dispozitivul experimental este o cutie deschisă cubică cu o înălțime de 40 cm și o lungime și o lățime de 80 cm. Pereții din jur și fundul sunt negre. Partea de jos este compusă din 25 de blocuri de suprafață egală, împărțite prin linii albe. În timpul experimentului, șobolanul a fost plasat în pătratul din centrul cutiei deschise, iar scorul de activitate orizontal al numărului de blocuri pe care șobolanul le-a traversat pe partea de jos în 5 minute (pot fi numărate pătratele cu toate cele patru labe introduse), și de câte ori membrele posterioare au stat în picioare (două labe din față erau în aer). (sau agățat de un perete) scor activitate verticală. Fecalele trebuie îndepărtate complet după fiecare experiment și fiecare șobolan este măsurat o dată la 2 ore după administrare. Acest experiment a fost efectuat într-o cameră liniștită.

2.2.2 Metoda de determinare a trusei

Obțineți probe de ser: utilizați eprubete care nu conțin pirogeni și endotoxine. Evitați orice stimulare celulară în timpul operației. După colectarea sângelui, centrifugă-l la 3000 rpm timp de 10 minute pentru a separa rapid și cu grijă serul și globulele roșii. Se obține probe de plasmă: anticoagulate cu tuburi de anticoagulant cu heparină. Se centrifugă la 3000 rpm timp de 30 de minute și se ia supernatantul. Obțineți specimene omogenate de țesut: adăugați o cantitate adecvată de soluție salină fiziologică în țesut și zdrobiți-o. Se centrifugă la 3000 rpm timp de 10 minute și se ia supernatantul.

Metoda de determinare a trusei ELISA de estradiol (E2) de șobolan (Șobolan) este aceeași ca și în Experimentul 2. Concentrațiile standardelor (S0-S5) sunt 0, 4, 8, 16, 32 și 64 pmol/L.

Metoda de testare a trusei ELISA de testosteron (T) pentru șobolan (șobolan) este aceeași cu metoda de testare a trusei ELISA de estradiol. Concentrațiile standardelor (S{{0}}S5) sunt {{10}}, 2{{2{0}}, 40, 80, 160 și 320 pg /mL. Metoda de determinare a trusei de detectare ELISA a hormonului luteinizant (LH) de șobolan (Șobolan) este aceeași cu metoda de determinare a trusei de detecție ELISA cu estradiol. Concentrațiile standardelor (S0-S5) sunt 0, 3, 6, 12, 24 și 48 ml/ml. Metoda de testare a trusei ELISA de hormon foliculostimulant (FSH) de șobolan (Șobolan) este aceeași cu metoda de testare a trusei ELISA de estradiol. Concentrațiile standardelor (S0-S5) sunt 0, 0,75, 1,5, 3, 6 și 12 UI/L. Metoda de determinare a trusei de detectare ELISA a hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH) de șobolan (Șobolan) este aceeași cu metoda de determinare a trusei de detectare ELISA cu estradiol. Concentrațiile standardelor (S0-S5) sunt 0, 5, 10, 20, 40 și 80 mlU/ml.

Metoda de determinare a trusei de detectare ELISA a osteocalcinei de șobolan (șobolan) (BGP/OCN) este aceeași cu metoda de determinare a trusei de detecție ELISA cu estradiol. Concentrațiile standardelor (S{{0}}S5) sunt 0, 0,75, 1,5, 3, 6 și 12 ng/ml. Metoda de determinare a trusei de detecție ELISA pentru șobolan (Șobolan) -endorfină (-EP) este aceeași cu metoda de determinare a trusei de detectare ELISA cu estradiol. Concentrațiile standardelor (S0-S5) sunt 0, 3, 6, 12, 24 și 48 pg/mL. Metoda de determinare a trusei de detectare ELISA receptorului de estrogen (ER) de șobolan (șobolan) este aceeași cu metoda de determinare a trusei de detectare ELISA cu estradiol. Concentrațiile standardelor (S{{20}}S5) sunt 0, 4, 8, 16, 32 și 64 pg/mL. Metoda de determinare a trusei de detectare ELISA receptorului de androgeni (AR) de șobolan (șobolan) este aceeași cu metoda de determinare a trusei de detectare ELISA cu estradiol. Concentrațiile standardelor (S0-S5) sunt 0, 25, 50, 100, 200 și 400 pg/mL.

2.3 Metode de prelucrare statistică

Pentru analiza datelor, a fost utilizat pachetul de statistici medicale SPSS17.0 pentru prelucrarea statistică a datelor. Datele de măsurare au fost exprimate ca medie ± abatere standard (-x±s). Analiza unidirecțională a varianței a fost utilizată pentru compararea între grupuri. Metoda LSD a fost utilizată pentru a testa omogenitatea variațiilor. , testul Games-Howell a fost folosit pentru variațiile inegale, iar testul Ridit a fost folosit pentru datele de calificare.

Se poate observa din Tabelul 11 ​​și Figura 14 că, în comparație cu grupul martor, indicele timusului, indicele splinei și indicele uterin al șobolanilor din grupul model au fost semnificativ scăzute (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Efecte asupra nivelurilor indicelui biochimic din sânge la șobolani model în perimenopauză

Conținutul de ser E2, T, LH, FSH, GnRH și BGP și conținutul de plasmă -EP la șobolani din fiecare grup sunt prezentate în tabelele 12-13 și figurile 15-17.

Se poate observa din tabelele 12~13 și figurile 15~18 că, în comparație cu grupul martor, nivelurile serice de E2 și T la șobolani din grupul model au fost semnificativ scăzute (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabelul 14 Efectul glicozidei feniletanol Cistanche deserticola asupra nivelurilor serice de GnRH și plasma -EP la modelul de perimenopauză la șobolan (-x±s)

Se poate observa din tabelul 14 și figurile 19-20 că, în comparație cu grupul martor, nivelul seric de GnRH la șobolani din grupul model a fost semnificativ crescut și nivelul plasmatic -EP a fost semnificativ scăzut (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Efecte asupra conținutului ER și AR în țesuturile șobolanilor model perimenopauză

Conținutul de ER și AR în țesuturile relevante de șobolani din fiecare grup este prezentat în tabelele 16-17 și figurile 22-23.

Se poate observa din Tabelul 17 și Figura 23 că, în comparație cu grupul martor, nivelul AR în hipotalamus al grupului model a fost semnificativ mai scăzut (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Efecte asupra morfologiei țesutului de organ la șobolani model în perimenopauză

Rezultatele observației patologice și histologice ale uterului, timusului și splinei la șobolani din fiecare grup experimental sunt următoarele. Fotografiile patologice sunt prezentate în Anexa 1 pentru fotografiile patologice ale șobolanilor model în perimenopauză.

5.1 Efectul asupra morfologiei țesutului uterin la șobolani model în perimenopauză

În funcție de diferitele grade de modificări ale endometrului, glandelor și miometrului șobolanilor din fiecare grup experimental, au fost utilizate standarde semi-cantitative pentru a împărți morfologia țesutului patologic în patru niveluri, iar uterul șobolanilor din fiecare grup experimental a fost măsurat. Rezultatele observației sunt prezentate în Tabelul 18.

"-" Celulele epiteliale endometriale, glandele, miometrul și serosa sunt toate normale; „+” celulele epiteliale și glandele endometriale sunt atrofiate, iar miometrul și serosa sunt normale; „++” epiteliul endometrial Celulele și glandele sunt parțial atrofiate, stratul muscular este ușor atrofiat, iar seroasa este normală; Celulele și glandele epiteliale endometriale „+++” sunt semnificativ atrofiate, iar seroasa este normală.

După testul Ridit, se poate observa din tabelul 18 că, în comparație cu grupul martor, uterul șobolanilor din grupul model a prezentat leziuni tisulare patologice semnificative (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Efectul asupra morfologiei țesutului ovarian la șobolani model în perimenopauză

În funcție de diferitele grade de modificări ale foliculilor, corpului galben, celulelor granuloasei și vaselor de sânge în ovarele șobolanilor din fiecare grup de experimente, standardele semi-cantitative au fost utilizate pentru a împărți morfologia țesutului patologic în patru niveluri. Ovarele de șobolani din fiecare grup de experimente au fost măsurate și observate. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 19.

Tabelul 19 Efectul glicozidei feniletanol Cistanche deserticola asupra modificărilor patologice ovariene la șobolani model în perimenopauză Unitate: numai

„-” poate prezenta foliculi în creștere, foliculi maturi și corpul galben la toate nivelurile. Corpul galben este bine dezvoltat, cu multe straturi de celule granuloase, lichid folicular bogat și vase de sânge bogate; „+” poate prezenta foliculi în creștere, foliculi maturi și corpul galben, dar numărul foliculilor maturi și al corpului galben este mic. , foliculii sunt mai mici, iar celulele granuloasei sunt mai puțin stratificate; „++” poate prezenta foliculi maturi și corpul galben, cu mai mult corp galben, mai puține celule granuloase și mai puține vase de sânge; „+++” nu are foliculi, mai mult corp galben, iar ovarul atrofic, avascular.

După testul Ridit, se poate observa din Tabelul 19 că, în comparație cu grupul martor, ovarele de șobolani din grupul model au prezentat leziuni tisulare patologice semnificative (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Efecte asupra timusului și morfologiei țesutului splinei la șobolani model în perimenopauză

Folosind un micrometru, măsurați grosimea părților cele mai groase și înguste ale cortexului timic al fiecărui șobolan din fiecare grup experimental pentru a obține media; Folosiți linia de bază a micrometrului pentru a cădea pe nodulii splenici, măsurați grosimea nodulilor splenici de ambele părți cu artera centrală ca centru și calculați media. Rezultatele măsurate sunt prezentate în Tabelul 20 și Figura 24.

Se poate observa din Tabelul 20 și Figura 24 că, în comparație cu grupul martor, grosimea cortexului timusului și volumul nodulilor splenici din grupul model au fost semnificativ reduse (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).