Studiu experimental al mecanismelor efectului oboselii anti-sport ale Cistanche Deserticola

Contact: emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Departamentul de Citobiologie, Colegiul Medical al Mongoliei Interioare, Hohhot 010059, China; 2. Departamentul de Oncologie, Spitalul Regiunii Autonome Mongolia Interioară, Huhhot 010017, China)

Abstract:Obiectiv Studierea efectuluicistanche deserticolaasupra izoenzimei lactat dehidrogenazei (LDH), glicogenului și oxidului nitric sintetaza 3 (NOS3) a ficatului la șoareci, înotul încarcă și explorează mecanismele moleculare relevante ale oboselii anti-sport. Metode Șoarecii au fost împărțiți în grupul de control normal, grupul de control sportiv și grupul de controlcistanche deserticolagrup experimental. Fiecărui șoareci din grupul de control oral și grupul de control sportiv li sa administrat soluție salină 0,2 ml pe zi. Fiecărui șoareci din grupul experimental de cistanche deserticola li sa dat decoct de apăcistanche deserticola0,2 ml (3 g/kg) pe zi. Administrațiile au fost timp de 15 zile. Înotul de sarcină timp de 90 de minute a fost efectuat la șoareci din lotul de control sportiv și grupul experimental de cistanche deserticola la 1 oră după ultima administrare. Ficatii șoarecilor au fost îndepărtați după 10 ore de înot. O parte de ficat a fost fixată în lichidul neutru de formol pentru a pregăti secțiunile de parafină, iar celelalte au fost folosite pentru măsurarea activității LDH. Structura ficatului a fost observată prin colorarea HE, iar glicogenul hepatic a fost măsurat prin colorarea glicogenului. NOS3 a fost examinat prin metoda imunohistochimică SP. Rezultate Structura hepatică a grupului de control sportiv a fost grav afectată, izoenzimele LDH4 și LDH5 au fost mai mari, glicogenul hepatic a fost scăzut, NOS3 a fost scăzut comparativ cu grupul de control normal (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolaar putea să scadă LDH5, să protejeze ficatul șoarecilor care înoată și să accelereze acumularea de glicogen prin creșterea expresiei NOS3 pentru a proteja ficatul și îmbunătățirea recuperării capacității fizice.

Cuvinte cheie:cistanche deserticola;glicogen hepatic; oxid nitric sintetaza 3; șoareci.

Poza Cistanche

Cistanche,cunoscută și sub numele de Dayun, este o plantă parazită de doi ani a Ledanaceae. Are tulpini uscate cărnoase cu solzi. Este produs în principal în soluri nisipoase și pajiști seminisipoase din Mongolia Interioară, Gansu, Xinjiang, Qinghai și alte locuri. Mongolia InterioarăCistancheare cea mai bună calitate dintre toate zonele producătoare.Cistancheeste dulce, sărat și cald în natură. Intră înrinichisi meridianul intestinului gros. Principalele sale funcții sunt hrănirea rinichilor și întărirea yangului, hrănirea esenței și sângelui și hidratarea intestinelor. Este adesea folosit pentru a trata impotența, infertilitatea, talia și genunchii slabi, slăbiciunea mușchilor și a oaselor, intestinele uscate și constipația. Acest studiu își propune să observe efecteleCistanchepe șoareci care înot cu sarcină, lactat dehidrogenază hepatică (LDH), glicogen hepatic și oxid nitric sintetaza 3 (NOS3) printr-un test de înot cu sarcină la șoareci și pentru a explora mecanismul său de protecție asupra ficatului. Prin urmare, poate oferi o bază teoretică pentru cercetarea aprofundată, dezvoltarea și utilizareaCistanche în sport hrană sănătoasă.

1 Materiale experimentale

1.1 Animale

30 șobolani masculi Kunming, grad curat, greutate corporală (20±0,5) g, furnizați de Centrul pentru animale al Universității din Mongolia Interioară.

1.2 Medicamente

Cistanche deserticolaYCMa, produs în Ejina Banner, Mongolia Interioară și a fost identificat. Conform materialului medicinal original: apă=100 g: 400 ml, mai întâi se înmoaie timp de 30 de minute, se încălzește și se fierbe, apoi se decocește la foc cald timp de 30 de minute. Turnați medicamentul lichid și re-decoctați în raport de 100 g: 200 ml. Cele două decocturi au fost amestecate împreună și filtrate cu două straturi de tifon, apoi concentrate până la echivalentul a 1 g de material medicinal inițial per mililitru de soluție stoc de apă pentru decoct, păstrată la frigider la 4 grade.

1.3 Reactivi și instrumente

Anticorpul policlonal NOS3 a fost achiziționat de la Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. Setul SP a fost achiziționat de la Fujian Maixin Reagent Company. Trusa de izoenzime lactat dehidrogenază a fost achiziționată de la Inner Mongolia Tongri Reagent Company (deținută exclusiv de Nissan). Analizor de imagini color Nanjing JD-80. Sistem american de analiză a imaginii cu gel UVP.

2 Metoda experimentală

2.1 Gruparea și dozarea

Șoarecii Kunming au fost împărțiți aleatoriu în grup de control normal, grup de control pentru exerciții fizice șiCistanchegrup experimental, cu 10 șoareci în fiecare grup. Grupului de control normal și grupului de control cu ​​exerciții fizice li sa administrat soluție salină normală o dată pe zi, 0,2 ml/timp; celCistanchea fost dat grup experimentalcistanchedecoct (luați 3 ml din decoct de apă original și adăugați apă la 10 ml). O dată pe zi, 0,2 ml/timp, doza zilnică este de 3 g/kg și 15 zile la rând. La o oră după ultima dozare, șoarecii din grupul de control al exercițiilor fizice șiCistanchegrupul de experiment a fost încărcat cu o greutate de plumb de 1 g pe coadă și au fost plasați într-o piscină de 50 cm înălțime, 50 cm lungime și 35 cm lățime pentru a înota sub temperatura (30±0,5) grade. , Observați șoarecii în mod constant, dacă se constată că aceștia se opresc din înotat, folosiți un băț de lemn pentru a le stimula mișcarea timp de 90 de minute. După exerciții fizice, mâncați o dietă normală, odihniți-vă timp de 10 ore și apoi eutanasiați șoarecii cu șoareci obișnuiți din grupul de control. Scoateți ficatul, fixați o parte cu 10% formaldehidă neutră și faceți-o o grosime de 4 µm după deshidratare, transparență, imersare cu ceară și încorporare. Utilizați metoda de colorare HE pentru a observa structura țesutului hepatic a fiecărui grup. Cealaltă parte a fost spălată cu soluție salină normală și păstrată congelată la -20 grade și dezghețată la temperatura camerei în timpul măsurării. Se usucă cu hârtie de filtru și se cântărește, apoi se prepară omogenatul de ficat cu soluție salină normală, se centrifughează la 3 500 r/min timp de 15 min. Se ia supernatantul și se măsoară activitatea izoenzimei lactat dehidrogenazei prin electroforeză.

2.2 Determinarea activității lactat dehidrogenazei

Folosind electroforeza pe gel de poliacrilamidă, izoenzimele LDH sunt separate în funcție de diferențele lor de mobilitate electroforetică. Concentrația gelului de separare a probei este de 7 procente, pH 8,9, iar concentrația de gel concentrat este de 4 procente, pH 6,8. 10 µL proba este amestecată cu 1 picătură de glicerol și indicator de albastru de bromofenol. Tamponul electrodului este Tris-glicină (pH 8,7), începeți să stabilizeze tensiunea la 100-150 V, adăugați la 200-250 V după 30 de minute și electroforeza timp de 4 ore. După electroforeză, a fost colorat cu trusa de izoenzime lactat dehidrogenază și colorat la 37 de grade timp de 30 de minute, arătând o bandă albastră de izoenzimă de lactat dehidrogenază, apoi clătit cu apă, fixat cu acid acetic glacial. În cele din urmă, utilizați sistemul de analiză a imaginii cu gel UVP pentru analiza datelor.

2.3 Colorarea cu glicogen

Secțiunile seriale cu grosimea de 4 um sunt deparafinizate în mod obișnuit în apă. se pune în soluție de acid periodic 1% la 37 de grade timp de 15 minute. clătită cu apă curentă. se pune in solutie Schiff timp de 60 min. clătită cu apă curentă, deshidratată cu etanol gradient, xilen transparent și montată cu gumă neutră. Apoi observați rezultatele colorării la microscop.

2.4 Colorarea imunohistochimică

Feliile sunt deparafinizate în mod obișnuit în apă, iar antigenul este reparat cu tampon citrat cu microunde. Se acționează cu soluția A timp de 10 minute pentru a elimina peroxidaza endogenă și se blochează cu soluția B (ser de capră diluat) timp de 10 minute. Se adaugă anticorpul primar într-o cutie umidificată la 4 grade peste noapte și se spală cu soluție de PBS pH 7,4 timp de 5 min x 3 ori în a doua zi. Apoi se adaugă soluție C marcată cu biotină (soluție secundară de lucru cu anticorpi) și se incubează timp de 10 minute, se spală cu soluție PBS timp de 5 min × 3 ori. Se adaugă soluție marcată D cu peroxidază de hrean și se incubează timp de 10 minute, se spală cu soluție PBS de 5 min x 3 ori. În cele din urmă, a fost dezvoltat în soluție DAB timp de 5 minute, spălat cu apă de la robinet, contracolorat cu HE, deshidratat cu etanol gradient, transparent cu xilen și montat cu gumă neutră. Observați la microscop cu lumină după montarea filmului. În fiecare lot de experimente, soluția salină tamponată cu fosfat (PBS) a fost utilizată ca martor negativ în locul anticorpului primar.

2.5 Analiza expresiei sintezei de oxid nitric 3

Observație preliminară prin metoda vizuală semi-cantitativă la microscop cu lumină, produsul pozitiv NOS3 este maro închis sau maro. Produsul pozitiv este situat în citoplasma hepatocitelor sau a celulelor endoteliale între hepatocite, iar fundalul albastru este negativ. Apoi utilizați sistemul de analiză a imaginilor color pentru a măsura valoarea gri a reactantului pozitiv. Sub un obiectiv de 40x, parametrii a 4 câmpuri vizuale sunt măsurați aleatoriu pentru fiecare film și se ia valoarea medie. Acest parametru este utilizat pentru a reflecta modificarea intensității colorării NOS3.

2.6 Metode statistice

Toate datele sunt exprimate ca x-±s, iar SPSS11.0 Pachetul software statistic este utilizat pentru testul t și P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3. Rezultate

3.1 Observarea structurii țesuturilor la microscop optic

Structura lobulilor hepatici din grupul normal este clară, cordoanele celulare sunt aranjate ordonat, sinusoidele hepatice sunt normale, celulele hepatice nu au leziuni evidente, iar structura nucleară este clară. Structura tisulară normală a grupului de control al efortului a dispărut, limitele lobulilor au fost neclare, iar cordonul celular a fost dezordonat, majoritatea sinusoidelor hepatice au dispărut și degenerarea vacuolară extinsă a hepatocitelor se manifestă prin creșterea volumului celular. Citoplasma este laxă, ușor colorată, chiar limpede și transparentă, iar unele celule hepatice prezintă o modificare tipică cu balon, cu o cantitate mică de necroză focală sau punctată. Celulele hepatice aleCistanchegrupul experimental au fost ușor tulburi, dar au fost aranjați în mod regulat. Nu existau vacuole și slăbiri evidente în celule, cordoanele celulare erau aranjate ordonat și structura nucleului era clară.

3.2 Efecte asupra activității izoenzimelor lactat dehidrogenazei hepatice la șoareci sub efort de sarcină (vezi tabelul 1)

3.3 Observarea colorării cu glicogen hepatic la microscop optic

Deși conținutul de glicogen în grupul normal de control nu este mare, există glicogen în fiecare celulă hepatică, distribuția este uniformă și nu există un fenomen vacuol. Grupul de control al exercițiilor a avut mai puțin glicogen, împrăștiat în celulele hepatice și au apărut vacuole în unele zone; grupul experimental Cistanche era bogat în glicogen, dar a adunat mult pe o parte a celulei.

3.4 Observarea expresiei oxidului nitric sintetazei 3 la microscop optic și analiza cantitativă a imaginii

Există o expresie pozitivă puternică în citoplasma hepatocitelor din grupul normal de control, care este distribuită difuz, în special în celulele binucleare, și expresie pozitivă în celulele endoteliale. Expresia în citoplasmă a hepatocitelor și a celulelor endoteliale din grupul de control a fost slăbită.Cistanchegrupul experimental a avut expresie pozitivă în citoplasma hepatocitelor și expresie pozitivă puternică în celulele endoteliale. Rezultatele analizei analizorului de imagini color sunt prezentate în Tabelul 2.

4. Discutie

Mișcarea corpului uman are nevoie de energie, iar corpul are nevoie și de energie în procesul de metabolism. Metabolismul celular utilizează direct energia din descompunerea adenozin trifospat (ATP), iar energia necesară pentru sinteza ATP este în cele din urmă furnizată în principal de catabolismul zahărului. . Studiile au arătat că, după exerciții fizice intense, organismul va produce o cantitate mare de H plus, radicali liberi, acid lactic și alte substanțe care afectează metabolismul normal al celulelor. În același timp, lipsa de glucoză în celule duce la oboseală la efort și la deteriorarea celulelor. Rezultatele acestui studiu arată că deteriorarea structurii țesutului hepatic este foarte gravă după mult exercițiu și afectează, de asemenea, anabolismul celular, cum ar fi reducerea sintezei de glicogen hepatic. Se poate observa că șoarecii care iau Cistanche reduc leziunile hepatice după mult exercițiu fizic, în principal datorită reducerii LDH5, iar conținutul de glicogen hepatic este semnificativ mai mare decât cel al grupului de control al exercițiilor fizice, sugerând căCistanchepoate obține protecția ficatului și menține fiziologia normală prin reducerea funcției LDH5. Din rezultatele colorării cu glicogen, conținutul de glicogen alCistanchegrupul experimental este mai mare decât cel al grupului normal de control. FaceCistanchecrește rezervele hepatice de glicogen înainte de exercițiu sau accelerează sinteza glicogenului sub stres după efort? Nu se poate trage nicio concluzie pentru că nu există un grup de control care să nu exerciteCistancheîn experiment. Încă nu a fost confirmat în pasul următor, dar efectul protector al Cistanche asupra ficatului și promovarea sintezei glicogenului după multă mișcare sunt evidente.

NO este o substanță cu moleculă mică care a fost foarte apreciată de comunitatea sportivă în ultimii ani. NOS este principalul factor de limitare a ratei pentru producția de NO. S-a confirmat că NOS are 3 tipuri de izoenzime. NOS1 se numește oxid nitric sintază neuronală. Există în celulele neuronale, celulele musculare scheletice etc. și este implicat în principal în procesele de neurodezvoltare, neurosecreție, învățare și memorie. NOS2 este o sintază de oxid nitric inductibilă, care se găsește în principal în celulele musculare netede, macrofage și limfocite. Odată ce această enzimă este indusă, poate continua să sintetizeze NO până când substratul este epuizat sau celula moare. În prezent se crede că este implicat în deteriorarea celulelor; NOS3 este o sintază endotelială de oxid nitric, care este distribuită în principal în celulele endoteliale și hepatocite. NO produs este implicat în principal în funcțiile fiziologice. Rezultatele acestui studiu arată că expresia NOS3 în celulele endoteliale și hepatocite este slăbită după mult exercițiu, iar NO rezultat este redus, astfel încât vasele de sânge nu pot fi extinse în mod eficient, fluxul sanguin este redus și materiile prime pentru glicogenul sintetic nu poate fi transportat către celulele hepatice, astfel încât sinteza glicogenului este redusă.

Cistanche functie anti-oboseala

Cistanchepoate supraregla expresia NOS3 în celulele endoteliale și celulele hepatice. Expand reactiv vasele de sânge. Creșterea fluxului sanguin, accelerarea capacității de a transporta materii prime pentru sinteza glicogenului. Accelerează sinteza glicogenului și menține organismul la un nivel metabolic fiziologic normal. Prin urmare, reducerea LDH5 pentru a proteja ficatul și reglarea în sus a expresiei NOS3 pentru a promova gluconeogeneza acidului lactic poate fi un mecanism important pentruCistanchepentru a proteja ficatul și pentru a promova recuperarea fizică. Această cercetare oferă o bază experimentală științifică pentru dezvoltarea și utilizarea ulterioară aCistancheîn domeniul medicinei sportive și, de asemenea, pune bazele dezvoltării și epurăriiefectul lui Cistanchesubstante.

Articol din: „Studiul experimental al mecanismelor de efect anti-oboseală sportivă din Cistanche Deserticola” de YANG Hong-xin1 etc.

-----Jurnalul chinezesc de informații despre TCM Apr.2008 Vol.15 Nr.4