Modelul de expresie al tubulinei, inversinei și țintei sale dezordonate-1 și morfologia cililor primari în dezvoltarea normală a rinichilor umani și boli

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract:Expresia spațio-temporală a -tubulinei, inversarea și proteinele dezordonate-1 (DVL{-1) asociate cu calea de semnalizare Wnt și morfologia cililor primari au fost analizate în dezvoltarearinichi(săptămânile 14-38 de dezvoltare), sănătoși postnatale (1,5- și 7-ani) și oameni modificați patologicrinichi,inclusiv displazicul multichisticrinichi(MCDK), glomeruloscleroza segmentară focală (FSGS) și sindromul nefrotic de tip finlandez (CNF). Analiza a fost efectuată prin imunofluorescență dublă, microscopie electronică, metode semicantitative și statistice. Co-expresia citoplasmatică a -tubulinei, inversarea și DVL-1 a fost observată în tubii contorți proximali (pct), tubulii contorți distali (dct) și glomerulii (g) ai țesuturilor analizate. Pe parcursulrinichidezvoltare, expresia generală a -tubulinei, inversiune și DVL-1a scăzut, în timp ce în perioada postnatală a crescut ușor. Cele mai înalte expresii ale -tubulinei și inversării au caracterizat dct și g, în timp ce DVL-1 mare a caracterizat pct. -tubulină, inversare și modele de expresie DVL-1 în MCDK, FSGS și CNFrinichidiferă semnificativ de controlul sănătos. În comparație cu sănătosrinichi, schimbat patologicrinichiavea cili primari dismorfi. Dinamica de expresie diferită a -tubulinei, inversării și DVL-1 în timpulrinichidezvoltarea ar putea indica faptul că comutarea între semnalizarea Wnt canonică și necanonică este esențială pentru normalrinichimorfogeneza. În schimb, exprimarea lor tulburată în patologicrinichiar putea fi asociat cu cili primari anormali, ducând la cronicizareboli de rinichi.

Cuvinte cheie:dezvoltarea rinichilor umani; -tubulina; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; rinichi, rinichi

CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR

Introducere 

Dezvoltarea definitivă sau metanefricărinichiîncepe în timpul celei de-a cincea săptămâni de gestație (GW), care apoi se diferențiază continuu pentru a forma rinichii permanenți [1,2]. Interacțiunile de semnalizare dintre mezenchimul metanefric și mugurele ureter asigură corectrinichidezvoltarea în timpul nefrogenezei. Pe scurt, mugurele ureter induce tranziția mezenchimal-epitelială (MET) în mezenchimul metanefric, care se condensează și formeazărenalvezicule, urmate de corpi în formă de virgulă și în formă de S și, în final, duc la formarea glomerulilor [3]. În schimb, mezenchimul induce ramificarea suplimentară a mugurelui ureteral. Rinichii metanefrici devin unități excretoare funcționale în a 11-a săptămână de dezvoltare umană. Cu toate acestea, nefrogeneza este finalizată în a 34-a până la a 36-a săptămână de dezvoltare fetală, când evenimentele multiple de ramificare sunt încheiate, dar procesul de diferențiere suplimentară a rinichilor continuă în perioada postnatală [4,5]. Întreruperea acestor interacțiuni complexe duboală de rinichi(MCDK), conducând în consecință la cronicizareboală de rinichi(CKD) [6].

În acest studiu, ne-am concentrat pe aspectul cililor primari și pe calea de semnalizare Wnt, care joacă un rol important în timpul nefrogenezei normale și înrinichiproces de reparare, în urma acută sau cronicăboală de rinichi[7]. Existența cililor primari în timpul nefrogenezei și numărul mare de dezvoltarerinichidefectele care apar la pacienții cu boală ciliară evidențiază faptul că funcția ciliară primară autentică este necesară pentru normalrinichiorganogeneza [8,9]. Ciliul primar este un organel pe bază de microtubuli important pentru homeostazia țesuturilor, unde -tubulina este componenta de bază [10]. Pierderea acetilării tubulinei în celulele imortalizate declanșează tranziția epitelial-mezenchimală (EMT), implicând astfel că tubulina acetilată este importantă în stabilizarea microtubulilor [11]. În timpul dezvoltării umane, calea Wnt primară mediată de cili permite proliferarea celulelor, diferențierea și morfogeneza țesuturilor [12]. Un număr semnificativ de copii cu funcționarea afectată a cililor primari și calea de semnalizare Wnt întreruptă dezvoltă CKD, în cazul în care congenitalrenaltulburările sunt responsabile pentru aproape jumătate din cazuri [13]. Cea mai frecventă boală chistică congenitală la copii este displazia multichisticăboală de rinichi(MCDK) [14]. Chisturi multiple care nu comunică [15] și lipsesc normalrenalparenchimul sunt descoperiri microscopice caracteristice pentru MCDK. Glomeruloscleroza segmentară focală (FSGS) este una dintre cele mai frecvente boli glomerulare care duc la stadiul terminal.boală de rinichi[16]. La început, FSGS este caracteristic de a fi focală, implicând doar o minoritate din glomeruli și segmentară, implicând modificări doar într-un segment al cercului glomerular [17]. Sindromul nefrotic congenital de tip finlandez (CNF) este un autosomal recesiv moștenit mai puțin frecvent.boală de rinichireprezentat printr-un focar prenatal de pierdere extinsă de proteine ​​[18], asociat cu cistogenia tubilor proximali [19]. Multe forme de boli glomerulare primare dezvoltă proteinurie ca urmare a deteriorarii barierei de filtrare glomerulară [20]. O cantitate considerabilă de studii implică faptul că leziunea și disfuncția podocitelor au roluri intrinseci în patogenia proteinuriei CKD [21]. Studiul lui Vukojevic et al. prezintă un număr crescut de podocite ciliate și slab diferențiate în CNF [22]. Studiile anterioare au indicat că calea de semnalizare Wnt/-catenina are un rol fundamental în moderarea disfuncției podocitelor cu proteinurie [23]. Există două căi principale de semnalizare Wnt, una cunoscută drept dependentă de -catenina canonică și alta necanonică, independentă de -catenina. În timpul mouse-uluirinichidezvoltare, semnalizarea Wnt canonică este activă pe vârfurile mugurilor ureterelor și în corpurile în formă de S [24]. În plus, Wnt prin semnalizare canonică are relevanță în menținerea MET în timpul nefrogenezei [25]. Și anume, legarea complexului proteic care conține Dvl la receptorul membranar este obligatorie pentru activarea căii Wnt, în timp ce dezactivarea componentelor cheie ale acestei căi are ca rezultat o mortalitate perinatală precoce datorită absenței zonei nefrogenice înrinichi[25]. 

O proteină crucială ca comutare moleculară între căile de semnalizare Wnt canonice și necanonice s-a dovedit a fi inversiunea [26]. Deși au fost detectate interacțiuni ale diferitelor proteine ​​cu inversiune, funcția sa exactă nu a fost încă complet clarificată. Înrenalcelulele epiteliale, inversiunea este localizată în cilii primari, acționând ca o proteină ciliară [27]. În plus, inversiunea formează un complex constant cu tubulina în culturi derenalcelule și ele se colocalizează in vivo [27,28]. Inversia pare să joace un rol esențial în morfogeneza timpurie a sistemului pronefric și în determinarea simetriei stânga-dreapta în timpul dezvoltării [29,30]. Un eveniment semnificativ atât pentru căile de semnalizare Wnt canonice, cât și pentru cele necanonice, în recrutarea Dvl citoplasmatică la membrana celulară. Deoarece descoperirile anterioare au arătat că inversarea și Dvl se colocalizează în celulele epiteliale renale, se poate specula că inversarea ar putea avea, de asemenea, un rol în semnalizarea necanonică. Dereglarea semnalizării Wnt mediată de inversare declanșează proliferarea aberantă în tubuli [31]. Testele genetice au evidențiat o mutație DVL-1 la pacienții cu sindrom Robinow autosomal dominant, prezentând tulburări eterogene la unii pacienți asociate cu sindrom urogenital șirenalanomalii [32].

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI RINCHII/DIALIZA RENALĂ

Modelul de expresie de dezvoltare al -tubulinei, inversării și DVL-1 a fost investigat pe diferite modele animale. Astfel, expresia lor în pronephros a lui Xenopus laevis a fost confirmată prin utilizarea microscopiei intravitale [31], în timp ce au fost găsite în linii celulare derivate din celule tubulare proximale murine prin utilizarea microscopiei confocale și spectrometriei de masă [33]. În plus, microscopia cu lumină și imunofluorescența dublă au relevat prezența lor în secțiuni de șoarecirinichi[34]. Studiile asupra șoarecilor knock-out de inversare au raportat chisturi extinse, difuze la nivelulrenalmedulara și cortexul asociate cu inversiunea viscerală a situsului [35]. La om, mutația de inversare a fost prezentată cu nefronoftiză infantilă care a dus la întreruperea sarcinii [36]. În ciuda numeroaselor studii asuprarenal-tubulină, modelul de expresie inversă și DVL-1 și funcția, după cunoștințele noastre, un model de expresie a acestor proteine ​​în țesutul uman fetal și postnatal nu a fost încă investigat și a fost adus la o corelație. În plus, nu au fost raportate dovezi care să ia în considerare expresia inversării și DVL-1 în dezvoltarea umană timpurie. Prin urmare, acest studiu și-a propus să analizeze modelul de expresie spațială și temporală a -tubulinei, inversării și DVL-1 în timpul etapelor fetale și postnatale ale omului sănătos.rinichi, precum și înrinichițesuturi de MCDK, FSGS și CNFrinichipentru a stabili o posibilă legătură lipsă între aceste entități. Și anume, propunem că modelele de expresie perturbate ale proteinelor -tubulinei, inversarea și DVL-1 ar putea fi procesul de cistogenizare de bază și o funcție anormală a cililor primari care duce la cronicizare.boli de rinichi. 

Rezultate

Analiza dezvoltării și postnatalerinichiţesuturile a fost efectuată pe structuri distinct diferenţiate alerinichi:tubuli contorți proximali (pct), tubuli contorți distali (dct) și glomeruli (g). În fazele de dezvoltare analizate și în perioada postnatalărinichițesuturile, -tubulina, inversarea și DVL-1 au prezentat modele de expresie pozitive, dar cu diferențe de intensitate, distribuție și cantitate. Analiza patologiculuițesut renalde MCDK, FSGS și CNF a fost efectuată pe număr complet de imagini a celulelor pozitive în comparație cu controlul țesutului renal sănătos.

2.1. Microscopia ușoară, microscopia electronică și imunohistochimia (-tubulina) țesutului renal uman postnatal sănătos și modificat patologic

2.1.1. Lumină renală sănătoasă postnatală

microscopia postnatalerinichitesutul demonstreaza bine definitrinichistructuri, cu o diferență distinctă între medular și cortex și formarea pct, dct și g în regiunea corticală. Colorația imunohistochimică a tubulinei relevă prezența unui ciliu primar în centrul suprafeței celulare apicale a fiecărei celule tubulare și în 0.{018% ± 0,00014% SD pe suprafața celulelor glomerulare. Microscopia electronică arată prezența unui singur ciliu primar care provine din corpul bazal la suprafața celulei apicale a tubului (Figura 1a).

2.1.2. CNF

Majoritatea g-urilor analizate sunt mai mici și lobulate (80 la sută), în timp ce minoritatea sunt de mărime normală sau hipertrofice (20 la sută, n=100). Se găsește scleroza segmentară sau globală a g, în timp ce pct și dct sunt parțial dilatate și acoperite cu epiteliu atrofic. Ultrastructural se observă pierderea microvilozităților și scăderea înălțimii celulei cu multifragmentarea nucleelor. În podocite, procesele piciorului sunt pierdute difuz. Cilii primari tubulari sunt dezorganizați, în special în chisturile tubilor proximali, prezentând modificări în lungime și poziție citoplasmatică (Figura 1b).

2.1.3. MCDK

În țesutul renal, pot fi găsite g imaturi și mature sporadice.Rinichițesutul este umplut cu numeroase chisturi ovale. Celulele epiteliale coloane acoperă chisturile și sunt înconjurate de țesut conjunctiv lax. Colorația imunohistochimică la tubulină arată mai mulți cili primari lungi și dezorganizați pe suprafața celulelor epiteliale (Figura 1c).

2.1.4. FSGS

În 90% din g, se găsește scleroză segmentară extinsă (n=100), asociată cu fibroză interstițială și semne de leziuni tubulare. Scăderea înălțimii celulelor epiteliale cu pierderea microvilozităților se constată la microscopul electronic, în timp ce celulele endoteliale și regiunile mezangiale au ultrastructură regulată. La microscopul electronic, ciliul extrem de lung și dislocat (descentralizat) este observat pe suprafața celulei tubulare distale (Figura 1e). Podocitele prezintă pierderea difuză a proceselor piciorului cu țesut extins de microvilus. Colorația imunohistochimică la a-tubulină arată mai mulți cili primari lungi și dezorganizați pe suprafața celulelor epiteliale (Figura 1c).

2.2. Colorarea imunohistochimică la 心tubulină, inversare și DVL-1- și analiza statistică a rinichilor umani postnatali în curs de dezvoltare și sănătoși

În săptămânile 14, 15 și 16 de gestație,rinichițesutul este prezentat cu diferite stadii de dezvoltare ale formării nefronului: din cupe metanefrice,renalveziculele sunt în etape pentru a comanda nefronii în formă de S, formând astfel zona nefrogenă în cortexul exterior (Figura 2). Diferențierea pct, dct și g poate fi observată în regiunile corticale mai apropiate derinichimedular. În timpul celui de-al 22-lea GW, părți ale medularei și cortexului au devenit clar distinctive, în timp ce în al 38-lea GW,rinichistructurile apar ca fiind foarte diferențiate, conținând forme mature de pct, dct și g

2.2.1. a-Tubulină

În timpul dezvoltării, a-tubulina este puternic exprimată în toată dezvoltarearinichistructuri, vizualizând în primul rând forma cililor primari pe suprafețele celulelor epiteliale parietale ale capsulei Bowman, g, pct și dct. Înrinichițesut, 82-97% din celule PCT exprimă a-tubulină, în timp ce în dct expresia scade de la 99% la 72% în al 38-lea GW (vezi Figura 3, Tabelul 1). Dintre diferitele stadii de dezvoltare, cea mai puternică expresie a a-tubulinei se găsește în g al 16-lea GW.rinichi, care conține 93 la sută din celule pozitive. al 14-lea, al 15-lea și al 22-lea GW (vezi Figura 3a,b, Tabelul 1), aproximativ 70 procente din celulele g exprimă a-tubulină, în timp ce cea mai mică expresie este observată în al 38-lea GW (p < 0,01)="" cu="" 34%="" din="" celulele="" pozitive="" (figura="" 3c).="" în="">rinichițesut (1.5-ani și 7-anirinichi), cea mai puternică imunoreactivitate la a-tubulină este observată pe suprafața celulară apicală a pct și dct (Figura 3d-f). Expresia a-tubulinei este prezentă și în citoplasma perinucleară a dct și în celulele epiteliale parietale ale capsulei Bowman. a-tubulină pătează toaterenalstructuri cu o medie de 50 procente de celule pozitive în pct, 94 la sută în dct și 85 la sută în g (Figura 3f). Petele Dct sunt semnificativ diferite de pct (p < 0,0001).="" toate="" structurile="" investigate="" sunt="" pozitive="" pentru="" a-tubulină,="" cu="" 77%="" din="" celulele="" pozitive="" în="" pct,="" 72%="" în="" dct="" și="" 58%="" în="" g="">

Figura 3. Colorarea prin imunofluorescență a -tubulinei și DAPI în țesuturile renale umane în curs de dezvoltare și postnatale (a–e). Rinichi de 14, 15/16, 38 GW (a–c);rinichidin copiii de 1.5- și 7-an (d,e). Colorația pozitivă a -tubulinei (săgeți) este prezentată în fiecare structură din cortex prin fazele de dezvoltare și postnatale (a–e), tubuli contorți proximali (pct), tubuli contorți distali (dct) și glomeruli (g). Detaliile cililor primari în pct (d) și dct (a–c,e) sunt afișate ca inserții cu mărire mai mare (caseta albă). Mărire ×40, bară de scară 100 µm. Distribuția celulelor pozitive -Tubulină pe structură în diferite stadii de dezvoltare și în perioada postnatală este prezentată în graficul (f). Graficul (g) (numărul total de celule pozitive pentru proteine ​​din structurile observate) arată expresia proteinei legată de timpul de dezvoltare (regresia liniară) și interrelația dintre -Tubulina și DVL-1 prin dezvoltare și maturare (ANOVA bidirecțională urmată de testul posthoc al SIDAK). Datele sunt afișate ca medie ± SD.

Distribuția celulelor -tubulină-pozitive pe structură în diferite stadii de dezvoltare și în perioada postnatală este prezentată în graficul (f). Graficul (g) (numărul total de celule pozitive pentru proteine ​​din structurile observate) arată expresia proteinei legată de timpul de dezvoltare (regresia liniară) și interrelația dintre tubulina și DVL-1 prin dezvoltare și maturare (ANOVA bidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Sidak). Datele sunt afișate ca medii ± SD.

2.2.2. Colorare cu imunoflfluorescență dublă la inversare și colorare DVL-1 și DAPI nucleară în rinichii în curs de dezvoltare și sănătoși postnatali Expresie inversă în țesutul renal în curs de dezvoltare și postnatal

În al 14-lea, al 15-lea și al 16-lea GW, inversarea arată o expresie granulară puternică în g și o expresie granulară ușoară în citoplasma pct și dct (Figura 4a, b), în timp ce în GW al 22-lea și al 38-lea (vezi Figura 4c), cel puternic expresia pozitivă se observă în g (Tabelul 1). Între al 14-lea și al 22-lea GW, aproximativ 50 la sută din celule exprimă versiunea. În al 16-lea GW, celulele PCt exprimă inversie în 73% din celule, în timp ce scad la 29% din celule (p <0,05) în="" al="" 38-lea="" gw="" (vezi="" figura="" 4f).="" expresia="" pozitivă="" a="" inversării="" se="" găsește="" în="" aproximativ="" 80-90="" la="" sută="" din="" celulele="" dct="" și="" g="" din="">rinichițesuturile GW al 14-lea și al 16-lea, cu cea mai mică expresie în dct a GW al 38-lea (p < 0.05,="" respectiv="" p="">< 0,0001),="" unde="" 66="" la="" sută="" din="" celule="" au="" fost="" pozitive.="" în="">rinichi, pct colorează puternic la membrana celulară apicală, în timp ce dct colorează mai ales la membrana celulară bazală și în citoplasma perinucleară (Figura 4d,e). În acea etapă, am găsit expresia inversiunii în toți cei investigațirenalstructuri, inclusiv pct, dct și g, cu o expresie medie a celulelor pozitive de 92% pentru pct, 88% pentru dct și 90% pentru g (Figura 4f). Nu am observat o diferență semnificativă în puterea semnalului de expresie inversă între structuri. Cea mai mare expresie a inversării se găsește în g, cu o medie de 94% din celulele pozitive (Figura 4f). O diferență semnificativă se găsește comparând colorarea g (unde 94 la sută din celule colorează pozitiv) cu pct, unde 58 la sută dintre celule se colorează pozitiv (p < 0.01)="" și="" cu="" dct,="" unde="" 49="" la="" sută="" din="" celule="" sunt="" pozitiv="" (p="">< 0,0001,="" figura="">

Expresia DVL-1 în țesutul renal în curs de dezvoltare și postnatal

Expresia ușoară până la puternică a DVL{{0}} este observată în citoplasma pct, dct și g în perioada fetală (vezi Figura 4a–c, Tabelul 1). În pct, 76–86 procente dintre celule exprimă DVL-1 în al 14-lea–22 GW, în timp ce în al 38-lea GW, există 57 la sută de celule pozitive (Figura 4g). În dct al 14-lea și al 15-lea GW, 68–70 procente din celule exprimă DVL-1, în al 16-lea și al 22-lea GW, numărul de celule pozitive scade la 42–5{{41} } la sută, în timp ce în expresia a 38-a GW (p < 0,001),="" se="" observă="" în="" 19="" la="" sută="" din="" celulele="" dct.="" expresia="" dvl-1="" crește="" în="" g="" pe="" parcursul="" stadiilor="" fetale:="" în="" al="" 14-lea="" gw,="" este="" de="" 6%,="" în="" timp="" ce="" în="" al="" 15-lea,="" al="" 16-lea="" și="" al="" 22-lea="" gw,="" crește="" la="" 10%="" (p="">< 0,01).="" în="" 38="" gw,="" 14%="" dintre="" celulele="" g="" exprimă="" dvl-1="" (figura="" 4="" g).="" în="" perioada="" postnatală,="" imunoreactivitatea="" dvl-1="" este="" dispersată="" în="" citoplasmă="" (tabelul="" 1)="" atât="" a="" pct,="" cât="" și="" a="" dct="" (figura="" 4d,e).="" semnalul="" se="" găsește="" în="" toate="" structurile="" investigate="" dar="" mai="" ales="" în="" citoplasma="" perinucleară.="" intensitatea="" expresiei="" dvl-1="" este="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" pct="" în="" comparație="" cu="" dct="" și="" g="" (p="">< 0,01).="" 39-45%="" dintre="" celulele="" din="" pct="" și="" dct="" exprimă="" dvl-1,="" în="" timp="" ce="" în="" g,="" 21%="" dintre="" celule="" sunt="" pozitive="" (figura="" 4="" g).="" nu="" am="" găsit="" o="" diferență="" semnificativă="" între="" procentul="" de="" celule="" imunoreactive="" în="">renalstructurilor. Procentul de celule imunoreactive DVL-1 este de 34% în pct, 36% în dct și, respectiv, 27% în g (Figura 4g).

Figura 4. Colorare dublă cu imunofluorescență a inversării (verde), DVL-1 (roșu) și DAPI (albastru) în țesuturile renale în curs de dezvoltare și postnatale (14-38 GW, 1.5- și {{6 }}ţesuturi renale vechi de ani). Colorarea pozitivă (săgeți) este afișată în fiecare structură în toate fazele de dezvoltare (a–c) și perioada postnatală (d,e). Microfoane îmbinate împreună cu structurile de interes în cortex: tubuli contorți proximali (pct), tubuli contorți distali (dct) și glomeruli (g). Colocalizarea inversării/DVL-1 (cap săgeată) este prezentată în microfotografiile îmbinate. Colorațiile de control negative sunt afișate ca inserții la inversare și DVL-1 (a). Eritrocitele pot fi văzute ca celule puternic colorate lângă dct. Detaliile sunt afișate ca inserții cu mărire mai mare. Mărire ×40, bară de scară 100 µm. Distribuția celulară pozitivă dinamică a inversării și a DVL-1 în structurile rinichilor (pct, dct, g) de-a lungul etapelor de dezvoltare și postnatale sunt prezentate în grafice (f,g). Graficul (h) arată expresia proteinei (numărul total de celule pozitive din structuri) în legătură cu timpul de dezvoltare (regresia liniară) și interrelația dintre inversarea la DVL-1 prin dezvoltare și maturare (ANOVA bidirecțională urmată de testul post-hoc al Sidak). ). Datele sunt afișate ca medii ± SD.

Co-expresia inversării și DVL-1 este observată în citoplasma rinichilor g, dct și pct în timpul dezvoltării (vezi Figura 4a–c, fuziunea). În perioada postnatală, co-expresia inversării și DVL-1 caracterizează diferite compartimente celulare ale celulelor tubulare în pct și dct, în timp ce co-expresia în g este caracterizată prin prevalența puternică a expresiei inversării (vezi Figura 4d, îmbinare). ). În 7-rinichii postnatali, co-expresia inversării și DVL-1 este observată în celulele tubulare ale dct și pct și în g unde expresia inversării predomină ușor în comparație cu DVL-1 (Figura 4e, îmbinare).

2.2.3. Diferențele de exprimare a -tubulinei, inversării și DVL-1 între diferitele stadii de dezvoltare a rinichilor și rinichii postnatali

Numărul de celule pozitive pentru tubulină din pct din țesutul renal fetal a fost statistic semnificativ mai mare în comparație cu țesutul renal al copiilor de 7-ani (al 13-lea (p < 0.0{).="" {11}}1),="" al="" 15-lea="" (p="">< 0.0{001)="" și="" al="" 16-lea="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" din="" stadiile="" fetale="" timpurii="" (13,="" 15,="" 16="" și="" 22="" gw)="" a="" avut="" mai="" multe="" celule="" pozitive="" în="" comparație="" cu="" țesutul="" renal="" al="" copiilor="" de="" 38="" și="" 1.5-an="" (p=""><0,0001, respectiv,="" figura="" 3f).="" atunci="" când="" au="" fost="" comparate="" diferite="" stadii="" de="" dezvoltare,="" am="" găsit="" niveluri="" mai="" scăzute="" de="" expresie="" inversă="" în="" procentul="" de="" gw="" al="" 13-lea="" (p="">< 0,0001),="" al="" 15-lea="" (p="">< 0,00001),="" al="" 22-lea="" (p="">< 0,001)="" și="" al="" 38-lea="" (p="">< 0,0001)="" gw="" în="" comparație="" cu="">renalțesut de la copilul de 1.5-an. În dct, s-a găsit o expresie mai scăzută semnificativă statistic a inversării comparând țesutul renal al 16-lea GW cu cel al 38-lea GW (p < 0.0001).="" în="" plus,="" s-a="" observat="" o="" expresie="" mai="" scăzută="" a="" inversării="" în="" dct="" în="" țesutul="" renal="" al="" copiilor="" de="" 7-ani;="" comparând="" țesutul="" renal="" vechi="" de="" al="" 13-lea,="" al="" 15-lea="" (p="">< 0,001,="" ambele),="" al="" 16-lea="" și="" al="" 1.5-an="" cu="" dct="" al="" țesutului="" renal="" vechi="" de="" 7-an="" (p="">< 0,00001,="" respectiv,="" figura="" 4f).="" semnalul="" observat="" al="" expresiei="" dvl-1="" prin="" diferitele="" etape="" a="" relevat="" că="" pct="" din="" 13="" (p="">< 0,01),="" 15,="" 16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Relația dintre expresiile -tubulinei și inversarea la DVL-1 în țesutul renal în curs de dezvoltare și postnatal

-Expresiile tubulinei și inversării au fost comparate cu expresia DVL-1 pe parcursul etapelor de dezvoltare și în țesutul renal postnatal. -tubulina a avut o expresie statistic mai mare în toate etapele observate, în comparație cu expresia DVL-1 (p <0.001, figura="" 3g).="" în="" toate="" etapele="" observate,="" inversarea="" a="" avut="" o="" expresie="" mai="" mare="" în="" comparație="" cu="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" figura="" 4="">

2.2.5. Comparația colorării imunohistochimice cu -Tubulină, versiunea și DVL-1- și analiza statistică a țesutului renal modificat patologic (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulină Diferența colorației -tubulinei în MCDK, FSGS și CNF a fost semnificativă statistic în comparație la țesutul renal postnatal sănătos ca grup de control (p < 0.0001,="" respectiv).="" țesuturile="" renale="" displazice="" au="" avut="" o="" expresie="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" comparație="" cu="" grupul="" de="" control,="" în="" timp="" ce="" fsgs="" și="" cnf="" au="" arătat="" o="" expresie="" semnificativ="" mai="" mică="" a="" tubulinei="" în="" comparație="" cu="" controlul="" sănătos="" (figura="">

Inversiunea

Inversia este exprimată în citoplasma celulelor epiteliale dezorganizate și a tubulilor MCDK (Figura 5a). În CNF, expresia inversă caracterizează g și dct, în timp ce se manifestă mai puțin intens în chisturile pct (Figura 5b). În FSGS, inversiunea este puternic exprimată în g și dct, dar mai puțin intens în chisturile pct (Figura 5c). Expresia spațială a inversării a arătat o rată de colorare mai mare semnificativă statistic în țesuturile renale sănătoase (Figura 5g) în comparație cu MCDK, FSGS și CNF (p <{4}}.0001,>

Figura 5. Colorarea cu imunofluorescență dublă a inversării (verde), DVL-1 (roșu) și DAPI (albastru) în țesuturile renale patologice în MCDK (a), CNF (b) și FSGS (c): tubuli (t) , glomeruli (g), chist pct (c), înălțimea celulelor epiteliale pct (*). Structura și co-localizarea celulară a inversării și DVL-1 (capete de săgeată) sunt afișate în secțiunile îmbinate cu detalii în inserturi cu mărire mai mare. Colorațiile de control negative sunt afișate ca inserții la inversare și DVL-1 (a). Mărire ×40, bară de scară 10{{20}} µm. Relația dintre -tubulina (d) și inversarea (e) cu expresia DVL-1 în MCDK, FSGS și CNF (ANOVA bidirecțională urmată de testul post-hoc al SIDAK). Diferența de înălțime a celulelor epiteliale (f) a FSGS, CNF și MCDK pct în comparație cu controlul sănătos (ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Tukey, n=50). Diferența în procentul total de celule pozitive de -tubulină, inversare și DVL-1 în MCDK, CNF și FSGS în comparație cu controlul sănătos (g–i), ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Tukey). Datele sunt afișate ca medii ± SD. Diferențele semnificative sunt indicate prin valoarea p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl{-1="" este="" foarte="" ușor="" exprimat="" numai="" în="" tubulii="" dezorganizați="" ai="" mcdk,="" în="" timp="" ce="" în="" cnf,="" expresia="" sa="" caracterizează="" dct="" și="" g="" (figura="" 5a,b).="" în="" fsgs,="" dvl-1="" este="" observată="" ca="" reactivitate="" ușoară="" în="" g,="" dct="" și="" pct="" (figura="" 5c).="" țesuturile="" renale="" sănătoase="" colorate="" cu="" dvl-1="" au="" arătat="" o="" rată="" semnificativ="" mai="" mare="" de="" colorare="" (figura="" 5="" h)="" în="" contrast="" cu="" mcdk="" și="" cu="" fsgs="" (p=""><0,0001, ambele),="" în="" timp="" ce="" nu="" a="" fost="" găsită="" nicio="" diferență="" semnificativă="" pentru="">

2.2.6. Relația dintre expresiile -tubulinei și inversarea la DVL-1 în țesutul renal modificat patologic (MCDK, CNF, FSGS)În MCDK, FSGS și CNF, -tubulina este colorată semnificativ mai mare decât DVL-1 (p <0.0001, respectiv,="" figura="" 5d).="" inversia="" sa="" colorat="" semnificativ="" mai="" mare="" în="" comparație="" cu="" dvl-1="" în="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" și="" în="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" figura="">

2.2.7. Diferențele în înălțimea celulelor epiteliale ale tuburilor contorte proximale între controlul sănătos și țesutul renal modificat patologic (MCDK, CNF, FSGS)Înălțimea celulelor epiteliale pct (n {{0}} per grup) a fost comparată între celulele tubulare din țesuturile renale sănătoase și țesuturile renale modificate patologic (Figura 5b, c, f). Înălțimea medie a celulelor epiteliale în HC a fost de 12,91 µm ± 1,847 µm și a fost semnificativ mai mare în comparație cu CNF și FSGS (p <{14}},0001, respectiv).="" înălțimea="" medie="" a="" celulei="" în="" cnf="" pct="" a="" fost="" de="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" în="" timp="" ce="" în="" fsgs="" a="" fost="" de="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" celulele="" epiteliale="" pct="" ale="" mcdk="" nu="" au="" prezentat="" modificări="" semnificative="" ale="" înălțimii="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" în="" comparație="" cu="">

2.2.8. Diferențele în lungimea cililor primari între controlul sănătos și țesutul renal modificat patologic (MCDK, CNF, FSGS)

Lungimea ciliului primar (n=50 per grup) a fost comparată între HC și țesuturile renale modificate patologic (Figura 6c). Țesuturile renale sănătoase și MCDK au fost colorate cu -tubulină pentru a asigura specificitatea colorării ciliului cu -tubulină (Figura 6a, b). În țesuturile renale sănătoase, ciliul primar avea 5,065 µm ± 1,229 µm lungime, în timp ce în MCDK, CNF și FSGS au fost semnificativ mai lungi (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Discuţie

Scopul studiului nostru a fost de a investiga o expresie imunohistochimică a tubulinei, inversiune și DVL-1 la făt.renalțesut și țesut renal postnatal. În plus, am dorit să examinăm dacă expresia și modelul de colorare al tubulinei a, inversării și DVL-1 sunt perturbate în diferite boli de rinichi în comparație cu controlul sănătos. Și anume, în ciuda interesului extins al celorlalți cercetători privind rolul a-tubulinei, inversării și DVL-1 în timpul dezvoltării rinichilor, majoritatea studiilor anterioare au folosit animale sau modele experimentale in vitro. Din câte știm, acesta este primul studiu care a arătat expresia și localizarea a-tubulinei împreună cu inversarea și DVL-1 în rinichii umani fetali și postnatali și care a explorat expresia proteinelor menționate în rinichi. boli, cum ar fi MCDK, FSGS și CNF. Am analizat, de asemenea, modificările lungimii și aspectului cililor prin microscopia luminoasă și electronică, deoarece studiul nostru anterior a indicat deja că tulburările ciliare pot fi asociate cu cistogenia în FSGF și CNF [19].

În calea canonică de semnalizare Wnt, legarea liganzilor Wnt de receptori recrutează Dvl [37]. Procesele MET și ale căii de polaritate celulară plană în timpul etapelor incipiente ale morfogenezei rinichilor sunt controlate de semnalizarea Wnt. Prin medierea căii Wnt, cilii primari controlează proliferarea celulară, diferențierea și morfogeneza țesuturilor [12] prin organizarea citoscheletului și orientării celulei, precum și alungirea structurii tubulare [2,38]. În studiul nostru, -tubulina, inversiunea și DVL-1 au fost toate prezente în structurile rinichilor și toate au fost colocalizate nu numai în timpul dezvoltării rinichilor fetali, ci și în țesutul renal de la 1.5- și {{9 }}copii de ani. Aceste constatări sunt în acord cu activarea căii de semnalizare Wnt care s-a dovedit că are loc deja în timpul tubulogenezei [39]. În plus, rezultatele noastre au arătat că expresia -tubulinei și inversiunea sunt reciproc legate de DVL-1 și că ele arată o diferență semnificativă statistic între modelele lor de expresie. Aceasta este în corelație cu modelele experimentale, deoarece mutația întregii familii de proteine ​​Dvl la șoareci are ca rezultat o lipsă a procesului de gastrulație, în timp ce mutațiile care nu includ întreaga familie de proteine ​​prezintă defecte în plasarea cililor nodali împreună cu defecte de organ [40] . Descoperirile anterioare au sugerat că inversarea are un rol în migrarea celulelor în Xenopus pronephros. Deoarece acel segment se corelează cu ansa de mamifer a Henle și tubii distali, acest lucru ar putea indica importanța inversării în timpul dezvoltării rinichilor și la om [41]. În acord cu această premisă, studiile anterioare au dezvăluit că mutația genei de inversare ar putea duce la nefronoftiză de tip 2, care este mediată de expresia anormală a DVL-1 [42]. În ciuda faptului că rolul ciliului primar este controversat în reglarea căii de semnalizare Wnt, am constatat că -tubulina s-a colocalizat cu inversiune și DVL-1 în probele de rinichi analizate. Mai mult, studiile anterioare au subliniat că ciliul primar împreună cu inversiunea reglează degradarea Dvl prin influențarea căii de semnalizare Wnt [43]. În bolile renale umane asociate cu dezvoltarea chisturilor, s-au observat localizarea și funcția anormală a cililor primari [19]. În mod similar, prezentul studiu a confirmat, de asemenea, modificările morfologice ale formării cililor primari în condiții patologice precum CNF, FSGS și MCDK. Descoperirile anterioare au recunoscut că supraactivarea căii Wnt canonice în urma leziunilor renale duce la modificări structurale ireversibile ale țesutului renal [44]. Dimpotrivă, ciliului primar i s-a dat rolul de a trece de la calea Wnt canonică la necanonică în asistarearenalreparație. În plus, supraactivarea căii canonice Wnt în țesutul renal transplantat s-a dovedit a avea o valoare predictivă pozitivă față de fibroza renală [45]. Dacă calea canonică Wnt prevalează în detrimentul celei noncanonice, aceasta susține teoria fibrozei renale ca rezultat. Descoperirile noastre privind scăderea tubulinei și expresia inversă în CNF și FSGS implică inactivitatea căii noncanonice Wnt, mai ales că ambele condiții tind să conducă la stadiul final.boala renala.Și anume, se crede că localizarea și funcția normală a ciliului primar ar putea fi un factor în menținerea unei căi Wnt regulate și, prin urmare, o condiție prealabilă pentru dezvoltarea normală. În schimb, dacă calea Wnt este îmbunătățită, aceasta poate duce la proliferarea și diferențierea celulară dereglată care duce la carcinogeneză [46]. După cum s-a descris anterior, calea canonică Wnt este obligatorie pentru inițierea MET și formarea nefronului, în timp ce perturbarea acesteia poate duce larenalhipoplazie [47]. Rezultatele noastre susțin această idee, dezvăluind cea mai scăzută expresie a DVL-1 cu cea mai mare expresie a -tubulinei în MCDK în comparație cu controlul sănătos. Aceste rezultate pot implica cea mai scăzută activare a căii Wnt canonice, care ar putea fi o cauză de bază pentru absența formării nefronilor. În schimb, cea mai mare expresie a tubulinei cu cea mai scăzută expresie DVL-1 ar putea explica descoperirile multiplelor chisturi, deoarece nu există o elongare organizată și polarizare celulară ghidată de calea Wnt necanonică. Studiile anterioare au arătat, de asemenea, că inversiunea inhibă calea canonică de semnalizare Wnt prin țintirea Dvl pentru degradare [26]. Acest pas în interacțiunea lor s-a dovedit a fi necesar pentru a inhiba semnalizarea canonică Wnt în menținerea alungirii și poziționării tubulare normale. Mutația inversă are ca rezultat o reglare în sus a semnalizării Wnt canonice, care a provocat ulterior proliferarea anormală în celulele tubulare. Acest pas s-a dovedit a fi crucial în cistogeneză [42], în timp ce eliminarea inversării la șoareci duce la boala polichistică a rinichilor [48]. Conform teoriei luirenalcistogeneză, inversarea este considerată o „micoproteină”, datorită localizării sale la cilii primari înrenalcelule tubulare. În studiul nostru, cilii primari au fost prezenți pe suprafața celulelor apicale a celulelor tubulare în toate etapele analizate, în timp ce în stadiile fetale, expresia -tubulinei a fost mai puternică decât în ​​perioada postnatală.

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

Studiile anterioare au arătat că funcția primară a cililor poate fi afectată de dereglarea tubulinei în timpul dezvoltării, ceea ce poate duce la cistogenie, dezvoltarea anormală a rinichilor și posibilă boală cronică de rinichi în copilărie [31,49]. Acest lucru este în conformitate cu constatările noastre privind cilii primari scurtați și dismorfi observați în MCDK sau cu cili multipli și extrem de alungiți sau luxați găsiți în tubii dilatați ai CNF și FSGS în comparație cu controlul sănătos. Pentru a susține faptul că căile de semnalizare Wnt canonice și necanonice, reglementate de cilii primari, sunt considerate a fi obligatorii pentru dezvoltarea normală a rinichilor, am găsit o colorare semnificativ mai mică a inversării și DVL-1 în MCDK în comparație cu controlul sănătos. [31,49]. Dinamica modelului de expresie diferită a -tubulinei, inversarea și DVL-1 în diferite faze de dezvoltare a rinichilor pot indica comutarea între calea de semnalizare Wnt canonică și necanonică în timpul morfogenezei renale normale. Sugerăm că schimbul lor determină transcripția în calea canonică sau ordinea migrării și polarizării celulelor în timpul dezvoltării rinichilor într-o cale de semnalizare necanonică. Echilibrul și expresia lor în toate structurile renale investigate implică rolul lor important în dezvoltarea normală a rinichilor. În timpul dezvoltării normale a rinichilor (de la al 13-lea GW la al 38-lea GW), expresia generală a -tubulinei, inversării și DVL-1 scade pe măsură ce țesutul renal capătă morfologie matură. În țesuturile renale vechi de 1,5- și 7-an, -tubulina și inversarea au arătat o ușoară creștere a expresiei, ceea ce susține faptul că calea Wnt necanonică rămâne activă după naștere. Dimpotrivă, DVL-1 persistă cu un model de expresie scăzut, ceea ce ar putea adăuga la concluzia că calea canonică Wnt este redusă la tăcere în țesutul renal sănătos. Ca urmare a stărilor patologice ale rinichilor, celulele epiteliale ale rinichilor ar putea reacționa cu reapariția EMT și a fibrozei [50] asociate cu reactivarea căii Wnt canonice [44]. Prin urmare, tulburările de -tubuline, inversarea și DVL-1 găsite în rinichii bolnavi ar putea fi mecanismul patologic de bază și un rezultat al trecerii de la calea Wnt necanonică la canonică în rinichiul în curs de dezvoltare, făcând aluzie la trecerea de la rinichiul reversibil la cel ireversibil. deteriora. În plus, modificările lor prenatale și postnatalerenalModelul de expresie ar putea fi asociat cu afectarea funcției renale la vârsta adultă, ceea ce duce la boli congenitale și insuficiență renală cronică.

4. Materiale și Metode

4.1. Probe umane

Probele de țesut renal fetal au fost colectate după pierderea sarcinii la 14, 15, 16, 22 și 38 GW la Departamentul de Ginecologie și Obstetrică din Centrul Spitalului Universitar Split. Tot materialul fetal dobândit a fost examinat de către un patolog, iar pentru studiu au fost utilizate numai țesuturi fără semne de anomalii, macerații sau moarte intrauterină și cu cariograma normală. Fișele medicale ale mamelor au fost examinate înainte de recoltarea probei și, în cazul unor probleme de sănătate care ar putea influența rezultatul sarcinii, țesuturile renale au fost excluse din studiu. Maturitatea a fost determinată de circumferința capului, circumferința abdominală și lungimea femurului [51] în corelație cu calendarele menstruale ale pacienților. Exemplare de țesut renal vechi de 1,5- și 7-an au fost colectate după decese accidentale. Probele au fost obținute la Departamentul de Patologie a Centrului Spitalului Universitar Split. Probele de țesuturi renale displazice multichistice (MCDK) au fost obținute după pierderea sarcinii, glomeruloscleroza segmentară focală (FSGS) și sindromul nefrotic de tip finlandez (CNF) au fost obținute din cauza nefrectomiei. Tot materialul dobândit a fost examinat și evaluat de un patolog, care a clasificat diagnosticele. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de etică al Școlii de Medicină a Universității din Split (20 mai 2016) în conformitate cu Declarația de la Helsinki și cu actualizările acesteia (nr. clasificare: 003-08/16-03/0001, nr. de înregistrare: 2181-198-03-04-16-0024, 20 mai 2016) [52].

4.2. Imunohistochimie

Fixarea probei de țesut colectat a fost procesată cu 4% paraformaldehidă în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 24 de ore la 22 ◦ C. După deshidratare în etanol 100%, probele au fost încorporate în parafină, așa cum s-a descris anterior [53]. Specimenele au fost tăiate în secțiuni groase de 5 um folosind un microtom și apoi montate pe lamele de microscop. Pentru a verifica conservarea țesutului, fiecare a 10-a secțiune a fost colorată cu hematoxilină și eozină [54]. Depart-feminizarea și imunohistochimia au fost efectuate așa cum a fost descris anterior [2,55,56]. După clătire în PBS, lamele de microscop au fost incubate peste noapte cu anticorpi primari într-o cameră umedă la 22 ◦ C (sistem de colorare a lamei StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Anticorpii primari utilizați au fost anticorp monoclonal anti-alfa tubulină de iepure (diluție 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Marea Britanie), anticorp anti-inversiune policlonală de iepure (diluție 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Marea Britanie), DVL monoclonal de șoarece -1 anticorp (diluție 1:150; sc{-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SUA) și anticorp policlonal de iepure anti-tubulină gamma (pentru a verifica colorația primară specifică cililor cu alfa- tubulină, diluție 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, Marea Britanie). După clătire în PBS, anticorpii secundari au fost administrați timp de o oră așa cum este listat: IgG H&L anti-iepure de măgar, Alexa Fluor 488 (diluție 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și IgG H&L anti-șoarece de capră, TRITC (diluție) 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) 4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrat (DAPI) a fost utilizat pentru colorarea nucleelor ​​și, după o incubare de 2-min, diapozitivele au fost spălate în PBS și acoperite cu mediu de montare și lame de acoperire. Colorarea nespecifică a fost prevenită prin utilizarea blocului proteic (ab64226; Abcam, Cambridge, Marea Britanie) înainte de aplicarea anticorpului primar. Ca martor negativ, a fost efectuat un test de pre-adsorbție, în timp ce specificitatea anticorpilor secundari a fost verificată prin omiterea anticorpilor primari din procedurile de colorare.

4.3. Microscopia electronică

Fixarea derinichițesuturile a fost efectuată în paraformaldehidă 4% timp de 24 de ore, urmată de post-fixare în tetroxid de osmiu 1% timp de 1 oră. Procesul de deshidratare a fost realizat cu etanol de serie și finalizat cu înglobare în rășină LX 112 [22]. Secțiunile subțiri de un micrometru au fost colorate cu albastru de toluidină și studiate pentru a selecta secțiuni ultrasubțiri. Secțiunile ultrasubțiri cu o grosime de 0,05 micrometri au fost examinate după colorarea cu acetat de uranil și citrat de plumb. Microscopul JEOL 1200 EX a fost folosit pentru a obține microfotografiile.

4.4. Analiza genetică

După cum s-a descris anterior [19], folosind leucocite din sângele periferic, a fost extras ADN-ul genomic. A fost găsită o mutație homozigotă missense în gena NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) ceea ce a confirmat diagnosticul de sindrom nefrotic congenital de tip finlandez (CNF) [57].

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INFECȚIA RENICALE/RENALE

4.5. Analiza datelor

Analiza secțiunii a fost efectuată pe un microscop cu fluorescență FL folosind 3 canale de fluorescență FL (Olympus BX51, Tokyo, Japonia). Imaginile au fost capturate de camera digitală DP71 (Olympus, Tokyo, Japonia) cu mărire de mare putere (×40). Doarrenalcortexul conținând tubuli contorți proximali (pct), tubuli contorți distali (dct) și glomeruli (g) au fost de interes. Imaginile au fost apoi procesate de software-ul ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA, https://imagej.nih.gov/ij/ (accesat la 15 octombrie 2018), 1997–2021. ) și Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, SUA) pentru evaluare ulterioară. Înainte de numărarea celulelor, a fost folosit instrumentul ImageJ de canale divizate. Ulterior, fotografia microscopică de imunofluorescență originală a fost scăzută de canalul roșu sau verde (în funcție de canalul original) folosind instrumentul calculatorului de imagine ImageJ pentru a preveni scurgerea semnalului. Valorile sub nivelul pragului 50 au fost considerate negative. Am numărat semnalele imunoreactive în celule cu cel puțin 20 de structuri (pct, dct sau g) per etapă sau numărul total pozitiv de celule per microfotografie a displazicului multichisticrinichițesut, FSGS și CNF. Am clasificat celulele drept pozitive dacă semnalul de imunofluorescență s-a acumulat la orice nivel al membranei, citoplasmei sau nucleului peste valoarea 50 măsurată cu software-ul ImageJ folosind comanda prag. Celulele negative au fost clasificate ca celule cu absența oricărei imunoreactivitati. Doi anchetatori independenți au analizat datele.

4.6. Analiza semicantitativă

Intensitatea semnalului de colorare a -tubulinei, inversării și DVL-1 a fost evaluată de doi cercetători independenți folosind software-ul ImageJ. Intensitatea totală a semnalului a fost măsurată după ce imaginea a fost setată în tipul de 8-biți; apoi, intensitatea colorării markerului a fost evaluată în 20 pct, dct și g prin măsurarea zonei conturate a structurii. Dacă rezultatele dintre evaluatori au fost diferite, un al treilea cercetător independent a clarificat îndoiala. Intensitatea maximă a semnalului pentru -tubulină a fost de 84,125 ± 3,214 SD, pentru inversare a fost de 71,50 ± 2,715 SD și pentru DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. Cea mai mare saturație a culorii semnalului pe fotografiile cu microscop a fost marcată ca 3 (66,66–99,99 la sută din intensitatea totală a imaginii semnalului), urmată de 2 (33,33–66,66 la sută) pentru intensitatea intermediară a semnalului și 1 (0,33 la sută -33,33 la sută) pentru intensitate scăzută a semnalului (Tabelul 1.).

4.7. Analize statistice

Pentru determinarea diferențelor dintre etape și structuri s-a făcut testul Kruskal–Wallis, urmat de un post-hoc al lui Dunn folosind software-ul GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, SUA, www.graphpad.com (accesat pe 15 octombrie). 2018.)). Numărul de celule pozitive a fost exprimat în procente ca valoare medie ± abatere standard (SD), în timp ce semnificația statistică a fost recunoscută la p < 0,05.="" numărul="" structurilor="" analizate="" a="" fost="" de="" 4200="" în="" 35="" de="" probe,="" cu="" un="" număr="" total="" de="" 135.256="" celule="" numărate.="" am="" folosit="" 2-mod="" anova="" cu="" testul="" post-hoc="" al="" sidak="" pentru="" a="" testa="" diferențele="" de="" exprimare="" a="" -tubulinei,="" inversării="" și="" dvl-1="" în="" diferite="" stadii="" de="" dezvoltare.="" pentru="" a="" studia="" expresia="" proteinei="" în="" ceea="" ce="" privește="" timpul="" de="" dezvoltare,="" am="" folosit="" regresia="" liniară.="" anova="" unidirecțională="" urmată="" de="" testul="" post-hoc="" al="" lui="" tukey="" a="" fost="" utilizată="" pentru="" a="" explora="" diferențele="" de="" exprimare="" a="" -tubulinei,="" inversării="" și="" dvl-1="">rinichițesut comparativ cu țesuturile MCDK, FSGS și CNF. Diferențele de exprimare a proteinelor între MCDK, FSGS și CNF au fost investigate cu 2-mod ANOVA urmat de testul post-hoc al Sidak. ANOVA unidirecțională urmată de testul post-hoc al lui Tukey a fost utilizată pentru a evalua diferențele dintre lungimea cililor și înălțimea celulelor epiteliale ale PCT între controlul sănătos și patologic.rinichișervețele. Datele au fost prezentate ca valoare medie ± abatere standard (SD), cu diferența statistică recunoscută la p <>