Răspunsurile favonoide și fito-oxilipine în frunzele de rodie (Punica Granatum L.) Partea 1

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Iasmonatul de metil (MeJA) produs în plante poate media răspunsul acestora la stresul mediului. S-a demonstrat, de asemenea, că aplicarea exogenă a MeJA activează căile de semnalizare și induce acumularea de fitoalexină la multe specii de plante. Pentru a înțelege modul în care plantele de rodie răspund biochimic la stresul mediului, analiza metaboliților a fost efectuată pe frunzele de rodie supuse aplicării MeJA și a evidențiat modificări unice ale taninurilor hidrolizabile, flavonoidelor și fito-oxilipinelor. În plus, analizele transcriptomului și qPCR în timp real ale frunzelor de rodie tratate cu imitație și MeJA au identificat gene metabolice exprimate diferențial și factori de transcripție care sunt potențial implicați în controlulhidrolizabilcăile de tanin, flavonoide și fito-oxilipină. Caracterizarea moleculară, biochimică și bioinformatică a singuruluilipoxigenazăcu expresie susținută, indusă de MeJA, a arătat că este capabil să oxideze acizii grași polinesaturați, deși nu este localizat în compartimentul subcelular în care au fost produse fito-oxilipine non-jasmonate (non-JA). Aceste rezultate au sugerat în mod colectiv că, în timp ce suprimarea largă a flavonoidelor și antocianilor este controlată cel puțin parțial la nivel transcripțional, biosinteza indusă a non-JA.Fito-oxilipineprobabil că nu este reglementată transcripțional. În general, o mai bună înțelegere a modului în care frunzele de rodie răspund la stresul mediului nu numai că va promova sănătatea și productivitatea plantelor, ci va avea și un impact asupra sănătății umane, deoarece fructele produse de plantele de rodie sunt o sursă bogată de compuși nutritivi.

Cuvinte cheie:Iasmonat de metil.Flavonoid·Antocianine· Acid gras.Fito-oxilipină·Lipoxigenază

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Introducere

Când sunt rănite sau atacate de ierbivore și agenți patogeni, plantele produc și emit metil iasmonat (MeJA), care este perceput de țesuturile vegetale nerănite și de plantele învecinate pentru a activa răspunsul de apărare (Cheong și Choi 2003). În plus, s-a demonstrat că aplicarea exogenă a MeJA la o plantă provoacă căi de semnalizare, precum și producerea de proteine ​​legate de patogeneză și substanțe chimice de apărare cunoscute sub numele de fitoalexine. Fitoalexinele fenolice, de exemplu flavonoidele și antocianinele, au prezentat o acumulare crescută ca răspuns la tratamentul cu MeJA în diferite plante, cum ar fi Arabidopsis thaliana, struguri (Vitis vinifera), banane (Musa acuminate), măr (Malus Domestica) și zmeură roșie (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res și Ruiz del Castillo 2014). Biosinteza flavonoidelor și antocianilor începe cu formarea naringeninei calcone din cumaroil CoA și a trei molecule de malonil CoA catalizate de chalcone sintază (CHS) și izomerizarea ulterioară a naringeninei calcone la naringenină de către chalcon izomerază. Naringenina este apoi folosită pentru a genera scheletele de bază de flavonoide și antocianine, care sunt modificate în continuare cu grupări funcționale glicozil, metil, hidroxil și prenil pentru a da naștere la diverse structuri și funcții (Tian et al. 2008).

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>similaritate de 75 la sută) și nu conțin o peptidă semnal, în timp ce LOX-urile de tip II posedă o asemănare generală de secvență scăzută (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Rodia (Punica granatum L.) este o cultură horticolă de specialitate apreciată pentru compușii fenolici abundenți din fructele sale, cum ar fi flavonoidele, antocianii și taninurile hidrolizabile (HT) care sunt derivate dintr-un intermediar al căii shikimatului (Ono et al.2016). ). Multe studii s-au concentrat până acum pe rolul fenolicilor de rodie în atenuarea stresului și a bolilor la oameni (Wu și Tian 2017). În schimb, se știe puțin despre funcția fenolicilor și a altor substanțe fitochimice în apărarea rodiei împotriva factorilor abiotici și biotici (de ex. rănire, agenți patogeni, inducție MeJA) în frunze și fructe. Două rapoarte recente au evaluat tratamentul MeJA înainte de recoltare asupra calității postrecoltare a fructelor de rodie (Koushesh Saba și Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Antocianinele totale, flavonoidele și substanțele fenolice ale fructelor tratate cu MeJA, dar nu ale frunzelor, au fost analizate colectiv folosind un spectrofotometru. Unul dintre studii a analizat, de asemenea, antociani individuale folosind spectrometria de masă (Garcia-Pastor et al.2020). Cu toate acestea, rămâne neclar modul în care țesuturile plantelor de rodie, fie frunze, fie fructe, răspund la stresul mediului înainte de apariția fructelor.

Pentru a începe disecția interacțiunilor dintre plantele de rodie și factorii de mediu, am investigat răspunsul metabolic al frunzelor de rodie la aplicarea MeJA exogenă utilizând cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) și spectrometria de masă în tandem de cromatografie lichidă-ionizare electrospray (LC-ESI-MS/MS) . În frunzele de rodie tratate cu MeJA au fost observate modificări unice ale HT, flavonoide și antociani, precum și modificări ale lipidelor, acizilor grași și fito-oxilipinelor. Analiza comparativă a transcriptomului, validată prin analiza qPCR în timp real, a arătat că genele structurale și/sau reglatoare implicate în metabolismul HT, flavonoide, antocianine și fito-oxilipină au fost exprimate diferențiat în frunzele de rodie tratate cu imitație și MeJA. Singura genă LOX care a prezentat o expresie susținută reglată în frunzele tratate cu MeJA a fost supusă unei caracterizări moleculare, biochimice și filogenetice ulterioare.

Materiale și metode

Standardele -glucogalină și pentagaloil glucoză au fost achiziționate de la Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, China). Substanțele chimice utilizate în analiza LOX au fost obținute de la următorii furnizori: acid 3-(dimetilamino)benzoic (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, China), acid linoleic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), 3-metil-2-benzotiazolinonă (MBTH) și hemoglobină (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China).

Materiale vegetale Fructele și semințele de rodie (cv. Minunat) au fost furnizate cu generozitate de Academia Panzhihua de Științe Agricole și Forestiere și identificate de Dr. Binjie Ge la Grădina Botanică Shanghai Chenshan. Un exemplar de voucher (nr. CSHO173966) a fost depus la herbarul Grădinii Botanice Shanghai Chenshan, Shanghai, China. Răsadurile de rodie au fost cultivate într-o cameră de creștere cu temperatură controlată timp de 6 săptămâni la 25 de grade și 16 ore de lumină/8 ore de întuneric. Concentrația MeJA pentru aplicarea prin pulverizare pe țesuturile plantelor variază între 100 și 250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Diferite concentrații de MeJA au fost aplicate inițial pe frunzele de rodie, dintre care 200 μM MeJA au condus la un răspuns metabolic vizibil în analiza preliminară și au fost utilizate pentru analizele de exprimare a metaboliților și a genelor descrise în acest studiu. Înainte de tratamentul MeJA, jumătate din plantele de rodie au fost mutate într-o altă cameră de creștere cu condiții similare. În timp ce plantele dintr-o cameră de creștere au fost pulverizate cu 200 μM MeJA, cele din cealaltă cameră de creștere au fost pulverizate cu apă (de exemplu, control simulat). La 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h, și72-h după tratament, pleacă de la3 au fost reunite până la 5 plante simulate sau tratate cu MeJA, care constituie o replica biologică. Au fost colectate trei replici biologice pentru experimentele de tratament simulat și MeJA; fiecare replica biologică a fost împărțită în alicote pentru profilarea metaboliților și analizele expresiei genelor.

Analiza profilării metaboliților

Frunzele de rodie au fost liofilizate, cântărite și măcinate într-o pulbere fină folosind mărgele de zirconiu într-un batător de mărgele (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Germania) pentru anii 90 la 30 Hz. Pentru analiza HPLC, proba de frunze a fost extrasă în metanol 70% timp de 60 de minute sub sonicare și centrifugată la 13,000 rpm timp de 10 minute. Supernatantul a fost transferat într-o fiolă HPLC, din care 30μL au fost injectați pe un HPLC cu fază inversă (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) și analizat așa cum s-a descris anterior (Wil-son et al.2019). Metaboliții au fost detectați prin absorbție UV la 254 nm, 280 nm, 320 nm și 360 nm. Au fost construite curbele standard de calibrare pentru -glucogalină și pentagaloil glucoză; au fost utilizate pentru convertirea zonelor de vârfuri care se potrivesc cu timpii de retenție și spectrele de absorbție ale -glucogalină și pentagaloil glucoză la concentrațiile respective.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 au fost considerate modificate semnificativ.

Analiza transcriptomului

ARN total a fost extras din frunzele de rodie folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) și cuantificat folosind Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Integritatea probelor de ARN a fost verificată prin separare pe un gel de agaroză (fără degradare vizibilă) și determinarea raportului OD20/28o (între 1,8 și 2,2) folosind Nanodrop2000. Îmbogățirea ARNm din ARN total a fost efectuată utilizând granule magnetice oligo (dT) (Invitrogen). Bibliotecile ARNm-Seq au fost construite folosind trusa de preparare a bibliotecii ARN Truseq (Illumina, San Diego, CA, SUA). Analiza transcriptomului a fost efectuată pe Illumina HiSeq4000 și s-au obținut 55-60 milioane de 150-bp citiri la capăt pereche (PE150) pentru fiecare bibliotecă de mostre. Datele brute ale secvenței au fost procesate prin eliminarea secvențelor adaptorului, precum și a secvențelor scurte (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 și valoarea P ajustată<>

Analiză qPCR în timp real

ARN-ul total a fost extras din frunze de rodie tratate cu imitație și MeJA folosind kitul RNAprep Pure Plant (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, China). Transcripția inversă (RT) a fost efectuată utilizând ARN total și PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). PCR cantitativ (qPCR) a fost efectuată utilizând kitul TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) și un sistem PCR în timp real StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Analiza curbei de topire a fost efectuată și a arătat un singur produs de amplificare pentru fiecare pereche de primeri. Pentru analiza RT-qPCR, trei replici biologice și fiecare cu trei replici tehnice au fost examinate pentru probe tratate cu simulat și MeJA. Expresia genei a fost analizată utilizând metoda comparativă C,(△AC) (Livak și Schmittgen 2001), iar nivelurile de semnificație au fost determinate folosind un test t Student cu două cozi. Secvențele de primeri pentru analiza qPCR în timp real și eficiența de amplificare a perechilor de primeri sunt prezentate în Tabelul S1.

Exprimarea și purificarea proteinelor recombinante și teste enzimatice

Cadrul de citire deschis al Pgr025417 (codând un presupus LOX) a fost sintetizat pentru utilizarea optimă a codonului în E. coli (Genewiz, Suzhou, China) și donat în pET28a. Plasmida recombinantă a fost transformată în E. coli BL21 (DE3) celule. O cultură de 5-mL Luria Bertani (LB) cu 5{0ug mL-Ikanamicină a fost începută dintr-o singură colonie și incubată peste noapte cu agitare la 37°C. Cultura peste noapte a fost utilizată pentru a inocula un mediu LB de 100-mL cu 50 ug mL-'kanamicină și a fost lăsată să crească până la o OD600 de 0,5. Izopropil- -D-tiogalactozida (IPTG) a fost apoi adăugată la o concentrație finală de 0,1 mM pentru inducerea expresiei proteinei. După incubare cu agitare la 16 grade timp de 18 ore, celulele au fost recoltate prin centrifugare. Peletele celulare au fost resuspendate în tampon de liză (50 mM NaH, PO, pH 7,4300 mM NaCI, 10 mM imidazol) și omogenizate folosind un disruptor celular (Constant Systems Ltd, Northants, UK). Proteinele marcate cu lui au fost purificate folosind Granule Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) cu tampon de spălare (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCI, 25 mM imidazol) și tamponul de eluție (50 mM NaH, PO, pH 7.4.300 mM NaCI, 500 mM imidazol). Proteinele purificate au fost separate pe un gel SDS-PAGE 10% pentru vizualizarea purității proteinei. Concentraţia proteinelor purificate a fost determinată utilizând testul Bradford (Bradford 1976).

Pentru testul LOX, acidul linoleic a fost utilizat ca substrat într-o metodă colorimetrică în două etape, cu ușoare modificări （Anthon și Barrett 2008）. Amestecul de reacție 500-μL, inclusiv 50 mM Na-fosfat, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM acid linoleic și diferite cantități de proteine ​​recombinate purificate (1,5 mg mL -), a fost incubată la 25 de grade timp de 10 minute. La amestecul de reacție s-a adăugat o a doua soluție (500 μL) care conține 0,2 mM MBTH și 0,1 mg mL-'hemoglobină, care a fost incubată pentru încă 5 minute. Reacția a fost încheiată prin adăugarea a 500μL 1 procent (g/v) laurii sulfat de sodiu. A fost determinată absorbția luminii la 598 nm. Localizare subcelulară și analize filogenetice O căutare a genomului de rodie adnotat (Qin și colab. 2017) a identificat 1l LOX-uri de lungime completă presupuse (786 aa până la 970 aa), inclusiv Pgr025413, Pgr020032, Pgr025413, Pgr020032, Pgr0254132, Pgr0254032, Pgr0254032, Pgr0254032 -secvență de lungime în GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 și PgrO13780. Localizarea subcelulară și situsurile de clivaj ale peptidelor semnal pentru LOX-urile de rodie au fost prezise utilizând TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

Analiza site-ului de legare a TF

Pentru a prezice situsurile de legare ale TF, 1000 bp în amonte de codonul de pornire ATG al genelor țintă au fost obținute de la GenBank și s-au căutat împotriva TF-urilor Eucalyptus Grandis în PlantRegMap (versiunea 5) (Tian și colab. 2020). Valoarea prag pentru legare identificarea site-ului a fost setată la P Mai mică sau egală cu le-4. Analiza statistică pentru cuantificarea metaboliților, transcriptom și datele qPCR în timp real sunt descrise în secțiunile respective.

Rezultate

MeJA modulează semnalizarea celulară și căile metabolice din frunzele de rodie

Pentru a înțelege răspunsul transcripțional la nivelul întregului genom al rodiei la elicitarea MeJA, transcriptoamele frunzelor de rodie la 2-h,6-h,24-h și 72-h după MeJA sau tratament simulat (fiecare cu trei replici biologice) au fost analizate (Fig. S1). S-au obținut aproximativ 55 de milioane de citiri de secvențe brute (2 x 150 bp la capăt perechi) pentru fiecare transcriptom cu conținut de GC în jur de 52 la sută și valori Q30 variind de la 91,6 la 95 la sută (Tabelul S2). Pentru toate transcriptoamele, mai mult de 96 la sută din citirile secvenței curățate au fost mapate la genomul de referință al rodiei (Qin et al.2017) (Tabelul S3). Majoritatea transcriptelor asamblate au fost mai mici de 1000 bp (34,3 la sută), 1000 bp— 2000 bp (32,9 la sută) sau 2000 bp—3000 bp (18,1 la sută) (Tabelul S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, P ajustat<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Pentru a determina dacă modificările cantității de transcripte ale genelor biosintetice de shikimat și HT pot afecta nivelul metaboliților derivați din aceste căi, metaboliții fenolici au fost extrași din frunzele recoltate la 24-h, 30-h. 36-h,48-h și 72-h după MeJA sau aplicarea simulată și analizate prin HPLC (Fig.2). Trebuie remarcat faptul că aceste momente de timp au fost alese pentru a ține cont de timpul necesar sintezei proteinelor și producerii și acumulării metaboliților după modificările observate de expresie a genelor biosintetice shikimate și HT la 6-h. Timpii de retenție și spectrele de absorbție a doi metaboliți eluați la 4,57 min (vârful 1) și 24,98 min (vârful 2) s-au potrivit cu cele ale intermediarilor căii HT - glucogalină și, respectiv, aliajele Penta-glucoză (Figurile la și 2a). Ambele vârfuri au arătat modificări semnificative în zonele de vârf integrate în mai multe momente (Fig.2b). Mai exact, vârful 1 a crescut în frunzele tratate cu MeJA în comparație cu controalele simulate la 30-h, 36-h și 48-h (Fig.2b). În mod interesant, vârful de 2 in frunze tratate cu MeJA a scăzut inițial la 24-h, dar ulterior a crescut la 30-h și 36-h înainte de a reveni la un nivel similar cu controalele simulate la 48- h și 72-h (Fig.2b). Reducerea majorității flavonoidelor și antocianilor, precum și creșterea flavonelor și flavonolilor metilați, au fost evidente în frunzele de rodie tratate cu MeJA.

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tabelele S5 și S6). Pentru metaboliții acumulați diferențial, a existat o îmbogățire generală a metaboliților implicați în metabolismul secundar/specializat al plantei (67 din 102), în special compușii fenolici (63 din 102) (Tabelul S6).

Dintre substanțele fenolice, o reducere concertată a unei game largi de flavonoide și antociani (42 din cei 73 de compuși scăzuți) a fost evidentă în frunzele tratate cu MeJA (Fig. 3; Tabelul S6). În mod intrigant, trei flavone și flavonoli mono- sau di-O-metilate, inclusiv di-O-metil quercetină, crisoberil O-hexosil-O-hexozidă și 5-O-hexozide de vânzare, au fost crescute în frunzele tratate cu MeJA (Fig. 3; Tabelul S6). Mai mulți intermediari ai căilor flavonoide și antocianine, inclusiv luteolina, crisoberil, dihidrokaempferol, dihidroquercetină, dihydromyricetin, epicatechin, delphinidin și pelargonidin, au fost detectabili, dar nu au prezentat modificări semnificative în frunzele tratate cu MeJA (Fig.3; Tabelul S5). Derivații de hidroxicin-namoil, izoflavonele și cumarinele au fost printre alți substanțe fenolice care au prezentat o acumulare redusă la inducerea MeJA (Tabelul S6). În schimb, doi acizi fenolici, acid 2,3-dihidroxibenzoic și acid protocatecuic (acid 3,4-dihidroxibenzoic) și o cumarină, 6-metil cumarină, au fost crescute în frunzele tratate cu MeJA (Tabelul S6).

În concordanță cu flavonoidele și antocianinele foarte reduse din frunzele de rodie tratate cu MeJA, transcrierile a două enzime cheie pentru biosinteza flavonoidelor și antocianinei. CHS(Pgr005566) și CHI (Pgr025966), au fost semnificativ scăzute la 6-h și 24-h după aplicarea MeJA conform analizei transcriptomului (Fig. 4). Analiza qPCR în timp real a fost efectuată pentru a examina expresia CHS și CHI cu momente de timp suplimentare, inclusiv 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h și 72-h (Fig.4).Transcrierile CHS au scăzut în frunzele tratate cu MeJA la 3-h și au rămas semnificativ mai mici decât cele din simulare. controlează până la 72-h, cu cea mai mare scădere la 12-h. În schimb, reducerea expresiei CHI a fost semnificativă numai la 24-h, 48-h și 72-h după tratamentul cu MeJA (Fig. 4).

Acest articol este extras din Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9