Genetica osteopontinei la pacienții cu boală cronică de rinichi: studiul german asupra bolii cronice de rinichi Ⅳ

Variabile de referință și măsurători

Un set standardizat de biomarkeri a fost măsurat într -un laborator certificat central folosind protocoale Dardizate Stan [81]. Printre altele, creatinina și albumina din ser și urină au fost cuantificate folosind o metodologie de urmărire a IDMS (Creatinine Plus, Roche, Germania) și o metodă turbidimetrică (Tina-Quant, Roche, Germania) Roche/Hitachi P modular. Rata de filtrare glomerulară (GFR) a fost estimată folosind CKD-EPI pe bază de creatinină pentru Mula (unitate: ml/min/1,73m2, [82]). UACR a fost calculat ca fiind măsurat albumină urinară/creatinină URI nary (mg/g, [83]). Vârsta și sexul au fost auto-raportate la vizita de bază. În 2015, OPN a fost măsurată din eșantioane serice de bază ale cohortei complete de studiu GCKD folosind o tehnică de imuno-test de enzimă sandwich cantitativă (ELISA în fază solidă; Quantikine uman Opn Immunoassay DOST 00 din sisteme R&D (R&D Systems Europe, Abingdon, Marea Britanie )). Cuantificarea a fost efectuată la Institutul de Chimie Clinică și Medicină Oratorie de laborator, Greifswald, Germania. Coeficienții de variație (intra-test) au fost de 4,5%, 5,3% și 3,5% pentru niveluri scăzute, mediane și, respectiv, ridicate. Coeficientul de variație între teste a fost de 6,4%. Reactivii și standardele secundare au fost utilizate conform recomandărilor producătorului.

PIRBĂ TRADIȚIONALĂ ORGANICĂ PENTRU SĂNĂTATEA RINCHIILOR

Genotiparea, controlul calității și imputarea

Informații detaliate despre genotipare și curățarea datelor în studiul GCKD au fost descrise anterior [18]. Pe scurt, ADN-ul a fost izolat din sânge integral și genotipizat la 2.612.357 de variante pentru 5.123 de participanți GCKD folosind matricea Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module Version 1.9.4) la Helmholtz Center München. Curățarea datelor a fost efectuată separat pentru conținutul Omni2.5 și conținutul de cip exome al matricei. Pe baza protocoalelor standardizate [84], au fost utilizate scripturi scrise personalizate (R, Perl) și software-ul Plink1.9 [85] pentru controlul calității (QC) al conținutului Omni2.5. Pașii QC bazați pe eșantion au inclus verificări ale ratei apelurilor, sexului, heterozigozității, ascendenței genetice și rudențelor, ceea ce a condus la excluderea a 89 de eșantioane. La nivel de variantă, polimorfismele cu un singur nucleotidă (SNP) au fost excluse dacă rata de apel a fost<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Studiu de asociere la nivel de genom al variantelor comune

După cum s-a raportat anterior [17,18], GWAS a fost efectuat pentru participanții GCKD cu date de genotipizare completă (Omni2.5), eGFR, UACR și log2(OPN) (N=4,897) utilizând regresia lineară a log2 (OPN) pe SNP (model genetic aditiv) cu un MAF �1%, ajustat pentru vârstă, sex, log (eGFR) și log (UACR) (S1 Fig). Analiza de asociere a fost efectuată utilizând SNPTEST v2.5 [89]. Statisticile rezumate au fost verificate pentru calitate folosind GWAtoolbox [90] și pentru inflație folosind controlul genomic [91]. Cu toate acestea, nu a fost solicitată o corecție a controlului genomic (λ=1.01). Asocieri cu o valoare p<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Adnotarea funcțională a variantelor a fost efectuată folosind ANNOVAR [92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] și RegulomeDB [96]. Locurile de asociere regională au fost reprezentate folosind LocusZoom v1.3 [97].

Cartografiere fină

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Analize de colocalizare

Pentru a înțelege în continuare mecanismele moleculare și fenotipurile asociate care stau la baza asociațiilor, am efectuat analize de colocalizare a statisticilor rezumative OPN GWAS legate de cele două loci OPN replicate cu statistici rezumative GWAS din alte trei surse, așa cum este prezentat mai jos. Pentru toate analizele de colocalizare, am folosit funcția „coloc.fast” din pachetul R gtx cu parametri impliciti și definiții anterioare (https://github.com/tobyjohnson/gtx), o implementare a unei versiuni adaptate a metodei de colocalizare introdusă de Giambartolomei et al. [98]. Considerăm o colocalizare pozitivă atunci când probabilitatea ulterioară a unei variante cauzale comune la locusul de asociere pentru ambele trăsături (H4, p12) a fost > 0.8.

Exprimarea genelor.

În primul rând, am folosit statisticile rezumative GWAS ale datelor despre expresia genelor din proiectul GTEx [99] și din studiul NEPTUNE [100]. Datele eQTL din studiul GTEx V8 (49 de țesuturi) și din studiul NEPTUNE (NephQTL din glomerul și porțiunile de rinichi tubulointerstițial) au fost descărcate de pe portalul GTEx (https://www.gtexportal.org/home/) și de pe site-ul web NephQTL (http://www.gtexportal.org/home/). ://nephqtl.org/), respectiv. Etapele analizei colocalizării au fost descrise în detaliu în altă parte [17]. În primul rând, au fost extrase rezumate GWAS ale GTEx și NephQTL în regiunile genomice ± 100 kb din cele două SNP-uri OPN. Genele din GWAS extras sunt identificate și pentru fiecare genă este definită o fereastră cis de 500 kb care flanchează începutul și sfârșitul genei. Apoi, pentru fiecare astfel de fereastră de genă cis, cu cel puțin un SNP având o valoare p de asociere < 0,001, rezumatele GWAS ale țesutului GTEx și NephQTL, precum și GWAS OPN au fost extrase și utilizate ca intrare pentru analiza de colocalizare.