Glucoza exercită un efect anti-melanogenic prin inactivarea indirectă a tirozinazei în melanocite și a unui echivalent al pielii umane

Rezumat%3a

Zaharurile sunt omniprezente în organisme și sunt ingrediente cosmetice binecunoscute pentru hidratarea pielii cu efecte secundare minime. Glucoza, un zahăr simplu folosit ca sursă de energie de către celulele vii, este adesea folosită în produsele de îngrijire a pielii. Mai multe rapoarte au demonstrat că zahărul și compușii legați de zahăr au efecte anti-melanogenice asupra melanocitelor. Cu toate acestea, mecanismul molecular de bază prin care glucoza inhibă sinteza melaninei este necunoscut, chiar dacă glucoza este folosită ca ingredient de albire și hidratare în produse cosmetice. Aici, am descoperit că glucoza a redus semnificativ conținutul de melanină al celulelor B16 stimulate cu hormonul de stimulare a melanocitelor (MSH) și al melanocitelor umane normale pigmentate întuneric, fără semne de citotoxicitate.

Mai mult, tratamentul local al glucozei și-a demonstrat eficacitatea de albire prin fotografie, colorare Fontana-Masson (F&M) și microscopie multi-fotonă într-un model pigmentat de piele umană 3D, MelanoDerm. Cu toate acestea, glucoza nu a modificat expresia genelor sau nivelurile de proteine ​​ale proteinelor melanogene majore din melanocite. În timp ce glucoza a scăzut puternic activitatea tirozinazei intracelulare în melanocite, nu a redus activitatea tirozinazei ciupercilor într-un sistem experimental fără celule. Cu toate acestea, glucoza a fost metabolizată în acid lactic, care poate suprima puternic activitatea tirozinazei. Astfel, am ajuns la concluzia că glucoza inhibă indirect activitatea tirozinazei prin conversie în acid lactic, explicând efectele sale anti-melanogenice în melanocite.

Tirozinaza este o enzimă care poate descompune tirozina în proteine ​​și o poate transforma în produși de oxidare a tirozinei, cum ar fi tirozinfenolul și alte substanțe. Această enzimă există pe scară largă în corpul uman, în special în tractul intestinal, unde este implicată în digestia și absorbția alimentelor. Totodată, în cercetare s-a constatat că cistanche poate reduce activitatea tirozinazei și astfel albi pielea.

Faceți clic pe ce este cistanche

Cuvinte cheie:

melanogeneza; zahăr; glucoză; tirozinaza; echivalentul pielii umane

1. Introducere

Melanogeneza este procesul de producere a melaninei și este esențială pentru protecția pielii. Melanina absoarbe lumina ultravioletă (UV) și protejează pielea de efectele dăunătoare ale luminii UV și ale radicalilor liberi [1]. Cu toate acestea, deoarece producția excesivă de melanină provoacă hiperpigmentare, cum ar fi pistruii și lentigo, care pot fi considerate inestetice, multe cercetări au fost dedicate găsirii de ingrediente de-pigmentare eficiente pentru cosmetice sau medicamente [2-4].

Zahărul este un puternic umectant pentru hidratarea pielii și este folosit ca ingredient cosmetic pentru hidratarea pielii cu efecte secundare minime. În plus, zaharurile și agenții legați de zahăr afectează melanogeneza [5,6]. Glicozilarea tirozinazei, o enzimă cheie implicată în sinteza melaninei, poate fi modificată, inhibând activitatea sa catalitică și accelerând degradarea acesteia [7]. Rolul zaharurilor în melanogeneză a fost evidențiat de studiile care investighează efectul glicozilării asupra fenotipului de pigmentare a melanocitelor și rolul reziduurilor de zahăr asupra activității catalitice a tirozinazei [5–7]. Unele studii au raportat că derivații de zahăr pot inhiba maturarea tirozinazei, afectând glicozilarea acesteia. De exemplu, N-acetilglucozamina (NAG), o amino hexoză produsă fiziologic prin adăugarea unei grupări amino la glucoză, perturbă glicozilarea tirozinazei, rezultând efecte depigmentante în pielea de cobai și pielea umană [8].

În plus, studii recente au arătat că compușii legați de zahăr inhibă expresia sau activarea tirozinazei, precum și modifică glicozilarea acesteia. De exemplu, am evaluat eficacitatea de albire a acidului galacturonic (GA), un acid zaharat care este o formă oxidată a galactozei și componenta principală a pectinei. Acidul galacturonic exercită un efect de albire prin reglarea activității și expresiei tirozinazei în celulele melanomului murin B16 și un echivalent al pielii umane [9]. Într-un alt raport, un nou tip de oligozaharidă ciclică, cunoscut sub numele de nitrozil nigeroză ciclică (CNN), a arătat un efect inhibitor direct slab, dar semnificativ, asupra activității enzimatice a tirozinazei, sugerând un posibil mecanism de hipopigmentare [10]. Similar cu maturarea tirozinazei prin glicozilare adecvată, expresia sau activitatea CNN ar putea fi o țintă a agenților anti-melanogenici [11]. Cu toate acestea, numeroși agenți anti-melanogeni au efecte secundare severe, cum ar fi vitiligo [12,13]. Prin urmare, există un mare interes pentru compușii depigmentari mai siguri.

Aici, am investigat efectele anti-melanogenice ale glucozei asupra celulelor melanomului murin B16 și melanocitelor umane normale. În plus, am examinat culoarea țesutului și starea epidermică folosind colorarea secțiunii de țesut a unui echivalent al pielii umane. Pe baza constatărilor noastre, propunem că efectul de albire al glucozei este dependent de producția de acid lactic, ducând la inactivarea tirozinazei.

2. Rezultate

2.1. Eficacitatea anti-melanogenă a glucozei în B16 și NHM

Pentru a investiga efectul anti-melanogenic al glucozei, am folosit două tipuri de melanocite, celule de melanom B16 (o linie de celule de melanom murin) și melanocite umane normale (NHM). În primul rând, am determinat dacă glucoza este toxică pentru celulele B16. Glucoza nu a prezentat nicio citotoxicitate la concentrații de până la 100 mM în celulele B16, așa cum se arată în Figura 1A. Pe baza datelor de citotoxicitate, celulele B16 au fost tratate cu diferite concentrații de glucoză timp de 72 de ore în prezența hormonului de stimulare a melanocitelor (MSH), un inductor al melanogenezei. După cum se arată în Figura 1B, glucoza a redus în mod clar și semnificativ conținutul de melanină intracelulară într-o manieră dependentă de doză. Acidul Kojic (KA) a fost folosit ca compus de referință pentru anti-melanogeneză deoarece este adesea folosit ca ingredient cosmetic pentru iluminarea pielii [1,3,4]. Culoarea lizatelor din celulele tratate cu glucoză a fost mai deschisă decât culoarea celulelor de control (Figura 1C).

În plus, am confirmat că cantitatea de melanină secretată în mediile de cultură a scăzut și culoarea mediului s-a strălucit (Figura 1D). Apoi, am investigat efectul anti-melanogenic al glucozei asupra NHM-urilor pigmentate întunecate. Glucoza la concentrații de până la 100 mM nu a fost citotoxică timp de până la patru 4 zile (Figura 1E). Când conținutul de melanină a fost determinat după tratamentul cu glucoză al NHM timp de 4 zile, am constatat că conținutul de melanină a scăzut într-o manieră dependentă de doză (Figura 1F). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că glucoza suprimă sinteza melaninei în melanocite.

2.2. Efectul de albire al glucozei asupra unui echivalent 3D al pielii umane

Pentru a defini în continuare capacitatea anti-melanogenă a glucozei, am folosit un model pigmentat de piele umană 3D, MelanoDerm. După cum este descris în secțiunea Materiale și metode, glucoza a fost aplicată local pe MelanoDerm timp de 18 zile, iar viabilitatea celulară a fost determinată prin testul CCK-8. După cum se arată în Figura 2A, nu a fost observată nicio citotoxicitate tisulară după tratamentul cu glucoză timp de 18 zile. Modificările de culoare ale țesutului au fost evaluate prin fotografie. După cum se arată în Figura 2B, țesutul tratat cu glucoză a fost de culoare mai deschisă decât țesutul tratat cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). În plus, colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a arătat că glucoza nu a indus colapsul tisular, în timp ce colorația cu fontana-masson (F&M) a arătat că glucoza a scăzut numărul de melanocite hiperpigmentate (așa cum este indicat de săgeți) în stratul bazal (Figura 2C) .

Pentru a investiga în continuare modificările conținutului de melanină, am comparat semnalele de auto-fluorescență ale melaninei în straturile melanocite ale țesuturilor tratate cu PBS și glucoză folosind microscopia cu fluorescență cu excitație cu doi fotoni (TPEF), așa cum se arată în Figura 2D. O analiză a acestor imagini a arătat că volumul de melanină a scăzut cu aproximativ 36 la sută, iar intensitatea semnalului TPEF pentru melanină în zona bogată în melanocite a scăzut cu aproximativ 38 la sută în țesuturile tratate cu glucoză, comparativ cu țesuturile tratate cu PBS.

Figura 2. Efectul glucozei asupra echivalentului pielii umane, MelanoDerm. (A) Viabilitatea echivalentelor pielii umane tratate cu glucoză. (B) Echivalentele pielii umane (MelanoDerm; n=3) au fost tratate local cu glucoză timp de 18 zile și apoi fotografiate. Valoarea ∆L indică gradul de ușurință în comparație cu țesutul tratat cu PBS. (C) Colorarea H&E și F&M a secțiunilor de țesut. Lamele au fost fixate într-o soluție de formaldehidă și încorporate în ceară de parafină pentru colorare (bară de scară, 5{{10}} µm). Săgețile negre indică melanocite pigmentate. (D) Imagistica cu melanină (200 × 200 × 60 µm3) a echivalentelor pielii umane a fost efectuată utilizând microscopia TPEF. Semnalele pseudocolorate (roșu) indică melanina (bară de scară, 50 µm). Graficele indică cuantificarea volumului de melanină și a semnalelor TPEF. Datele sunt exprimate ca medie ± SD a cel puțin trei măsurători independente (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. Efectul glucozei asupra expresiei proteinelor melanogene în melanocite

Apoi, pentru a elucida mecanismul de depigmentare al glucozei din melanocite, am evaluat efectul acesteia asupra expresiei enzimelor melanogene, cum ar fi tirozinaza și Tyrp{0}} în celulele B16 și NHM. Celulele B16 au fost tratate cu glucoză pentru timpii indicați în prezența -MSH. Apoi, nivelurile de proteine ​​ale tirozinazei și Tyrp-1 au fost determinate prin test Western blot (Figura 3A). Nivelurile de expresie ale tirozinazei și Tyrp-1 nu au fost scăzute de glucoză în niciun moment. În plus, nivelurile de transcriere ale tirozinazei nu au fost afectate de glucoză în celulele B16 stimulate de -MSH (Figura 3B). Similar cu celulele B16, nivelurile de proteine ​​ale tirozinazei, Tyrp-1 și MITF nu au fost inhibate de glucoză (Figura 3C) în celulele NHM tratate cu glucoză, iar nivelurile de ARNm de tirozinază și Tyrp-1 nu au fost, de asemenea, a scăzut, dar mai degrabă ușor crescut de glucoză (Figura 3D).

Figura 3. Efectul glucozei asupra expresiei proteinelor melanogene în celulele B16 și NHM. (A, B) Celulele B16 au fost tratate cu -MSH pentru timpul indicat în prezența sau absența glucozei 20 mM. Apoi, au fost efectuate teste Western blot (A) și qRT-PCR (B). (C) NHM-urile au fost tratate cu concentrațiile indicate de glucoză timp de 48 de ore. Apoi, a fost efectuat testul Western blot. (D) NHM-urile au fost tratate cu timpul indicat în prezența a 50 mM de glucoză. Apoi, au fost efectuate teste qRT-PCR. Datele sunt exprimate ca media ± SD a cel puțin trei măsurători independente.

2.4. Efectul glucozei asupra activității tirozinazei

Pentru a defini în continuare mecanismul de acțiune al glucozei, am testat dacă aceasta a avut un efect inhibitor asupra activității tirozinazei ciuperci. Așa cum se arată în Figura 4A, am constatat că glucoza nu a avut niciun efect inhibitor asupra activității tirozinazei ciupercilor, ceea ce indică faptul că glucoza nu afectează în mod direct activitatea tirozinazei. Apoi am efectuat un test de activitate totală a tirozinazei intracelulare folosind lizate de celule tratate cu glucoză atât din celulele B16, cât și din NHM. Interesant, activitatea tirozinazei intracelulare a fost inhibată într-o manieră dependentă de doză în celulele B16 tratate cu glucoză în prezența -MSH (Figura 4B). În NHM, glucoza a inhibat și activitatea tirozinazei intracelulare (Figura 4C). Aceste date susțin posibilitatea ca glucoza să inactiveze indirect tirozinaza în melanocite.

Figura 4. Efectul glucozei asupra activității tirozinazei. (A) Efectul glucozei asupra activității tirozinazei ciupercilor într-un sistem fără celule. (B, C) Testul activității tirozinazei celulare. (B) Celulele B16 au fost tratate cu concentrațiile indicate de glucoză timp de 24 de ore. Apoi, a fost efectuată analiza activității tirozinazei celulare, așa cum este descris în secțiunea metode. (C) NHM-urile au fost tratate cu glucoză 50 mM pentru timpul indicat. Apoi, a fost efectuată analiza activității tirozinazei celulare, așa cum este descris în secțiunea metode. Activitatea tirozinazei celulare a fost normalizată de conținutul total de proteine. Datele sunt exprimate ca medie ± SD a cel puțin trei măsurători independente (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.5. Inactivarea tirozinazei prin producerea de acid lactic în melanocitele tratate cu glucoză

Glucoza este transformată în metabolitul celular lactat, care este acidul lactic în soluție și care a fost raportat a fi eficient în tratarea leziunilor pigmentare [14,15]. Prin urmare, am emis ipoteza că glucoza este convertită în acid lactic în melanocite și că nivelurile crescute de acid lactic inhibă melanogeneza prin inactivarea tirozinazei. Pentru a evalua această ipoteză, am evaluat mai întâi producția de acid lactic în mediu din melanocitele tratate cu glucoză. Așa cum era de așteptat, glucoza a reglat în mod semnificativ conținutul de acid lactic din mediile cultivate pe celule B16 (Figura 5A). În plus, deoarece se știe că acidul lactic inhibă direct activitatea tirozinazei [15], am evaluat dacă acidul lactic a suprimat activitatea tirozinazei ciupercilor. După cum se arată în Figura 5B, acidul lactic a inhibat dramatic activitatea tirozinazei ciupercilor, spre deosebire de glucoză. Aceste rezultate sugerează că conversia glucozei în acid lactic are un efect anti-melanogenic prin inactivarea tirozinazei de către acidul lactic.

Figura 5. Producția de lactat de către glucoză și efectul acidului lactic asupra activității tirozinazei. (A) Producția de lactat în celulele B16 tratate cu glucoză. (A) Celulele B16 au fost tratate cu concentrațiile indicate de glucoză timp de 3 zile. Apoi, s-a efectuat un test de lactat folosind mediul de cultură, așa cum este descris în secțiunea metode. (B) Efectul acidului lactic asupra activității tirozinazei ciupercilor într-un sistem fără celule. Datele sunt exprimate ca medie ± SD a cel puțin trei măsurători independente (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001) .

3. Discuție

Zaharurile sau materialele derivate din zahăr sunt adesea folosite ca ingrediente cosmetice pentru protecția pielii și controlul fiziologic. De exemplu, rafinoza crește autofagia independentă de mTOR și reduce moartea celulară în keratinocitele iradiate cu UVB, indicând faptul că agentul natural rafinoza are o valoare potențială în limitarea fotodeteriorării [16]. Trehaloza și zaharoza sunt noi activatori ai autofagiei în keratinocitele umane printr-o cale independentă de mTOR [17]. Aceste descoperiri oferă o nouă perspectivă asupra reglării autofagiei mediată de zahăr în keratinocite. În cazul glucozei, s-a demonstrat că glucoza locală induce expresia claudinei-1 și filagrinei într-un model de șoarece de dermatită atopică și cultură de keratinocite, indicând faptul că are un efect antiinflamator prin repararea funcției de barieră a pielii [18]. În plus, glucoza inhibă proliferarea și îmbunătățește diferențierea keratinocitelor pielii [19]. Prin urmare, glucoza reglează diferite aspecte ale fiziologiei epidermice, cum ar fi funcțiile de barieră a pielii și nivelul de hidratare a keratinocitelor.

Zaharurile pot acționa ca agenți depigmentari prin mai multe mecanisme diferite care implică tirozinaza. De exemplu, unii agenți inhibă maturarea tirozinazei, în timp ce alți agenți induc inhibarea expresiei sau activității genei tirozinazei [5,8–10]. Cu toate acestea, puține studii au investigat mecanismele care stau la baza efectelor de depigmentare ale glucozei.

Pentru a determina efectul glucozei asupra melanogenezei, anterior ne-am concentrat pe receptorii X hepatici (LXR), care sunt receptori nucleari activați de liganzi care joacă roluri esențiale în metabolismul lipidelor și homeostazia colesterolului [20]. Am descoperit că activarea receptorului X hepatic inhibă melanogeneza prin accelerarea degradării factorului de transcripție asociat microftalmiei (MITF) mediată de kinaza reglată de semnal extracelular (ERK) [21]. În plus, glucoza este un ligand LXR endogen [22]. Astfel, am emis ipoteza că glucoza are efecte anti-melanogenice datorită activării unei căi dependente de LXR. Cu toate acestea, așa cum se arată în Figura 3C, glucoza nu a modificat nivelurile de expresie ale tirozinazei sau MITF, deși activarea LXR a redus nivelurile de expresie ale acestor proteine ​​în melanocite.

Prin urmare, am ajuns la concluzia că glucoza a avut efecte depigmentante asupra melanocitelor independent de activarea LXR.

Glucoza este principalul substrat pentru producerea de energie și este hidrolizată prin reacții în serie ale mai multor enzime, cunoscute sub numele de glicoliză. Numeroase studii au arătat că glicoliza are un singur produs final, acidul lactic, fie în condiții aerobe sau anaerobe. În condiții aerobe (O2), lactatul este utilizat ca substrat al lactat dehidrogenazei mitocondriale (MLD). LDH-urile îl transformă în piruvat care intră în ciclul acidului tricarboxilic (TCA). În condiții anaerobe (N2), lactatul se acumulează în citosol. Prin urmare, calea glicolizei începe cu glucoza ca substrat și se termină cu producerea de lactat ca produs final principal [23]. În plus, David și colab. a măsurat fracția de glucoză care a fost convertită în acid lactic sau piruvat în melanocitul uman normal [24]. Majoritatea metaboliților glucozei au fost mai degrabă acid lactic decât piruvat.

Acidul lactic este un acid alfa hidroxi (AHA); acești acizi sunt utilizați pe scară largă în formulările cosmetice ca agenți de peeling superficial [25]. În plus, acidul lactic suprimă formarea melaninei prin inhibarea directă a activității tirozinazei, efect independent de natura sa acidă, ceea ce înseamnă că efectele acidului lactic asupra leziunilor pigmentare se datorează nu numai accelerării turnover-ului celulelor epidermice, ci și inhibării directe a formării melaninei în melanocite [15]. Astfel, ne-am gândit că glucoza își poate exercita efectul anti-melanogenic prin producția de acid lactic, deoarece glucoza poate fi transformată în acid lactic. După cum era de așteptat, am constatat că tratamentul cu glucoză a dus la producția de acid lactic în melanocite (Figura 5A).

În plus, am confirmat că acidul lactic a inhibat puternic și direct activitatea tirozinazei (Figura 5B). Usuki și colab. de asemenea, a descoperit că acidul lactic a scăzut activitatea tirozinazei intracelulare în celulele B16 și celulele HM3KO umane [15]. În raport, ARNm și nivelurile de proteine ​​ale tirozinazei și Tyrp-1 nu au fost afectate de acid lactic. Împreună, aceste date indică faptul că glucoza crește producția de acid lactic și că acest acid lactic inhibă direct activitatea tirozinazei fără a afecta nivelurile de expresie a genelor, indicând faptul că glucoza are un efect anti-melanogenic în melanocite prin inactivarea indirectă a tirozinazei, dependentă de producția de acid lactic. Cu toate acestea, sunt necesare experimente suplimentare pentru a valida rolul acidului lactic și al glucozei în depigmentare.

Datele colective din acest studiu oferă dovezi preliminare care susțin utilitatea glucozei topice ca albire eficientă, precum și ca reactiv de hidratare care poate fi utilizat în siguranță în formulări cosmetice și medicinale.

4. Materiale și Metode

4.1. Materiale

D-glucoză, -MSH, acid kojic (KA), L-tirozină, L-DOPA și acid lactic au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Anticorpii împotriva tirozinazei și actinei au fost achiziționați de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie). Anticorpul împotriva Tyrp-1 a fost achiziționat de la Santa Cruz Biotechnology (CA, SUA). Anticorpul împotriva MITF a fost achiziționat de la Proteintech (oraș, IL, SUA).

4.2. Cultură celulară și analiza viabilității

Am achiziționat celule de melanom murin B16, mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) și ser fetal bovin (FBS) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA). Celulele B16 au fost cultivate în DMEM care conține 4500 mg/L de glucoză ridicată (ATCC 30-2002) așa cum este recomandat de producător (ATCC) suplimentat cu 5% FBS și incubate la 37 ◦ C într-o atmosferă umidificată care conține 95% aer și 10% CO2. NHM primare pigmentate întuneric au fost achiziționate de la Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, SUA). Celulele au fost cultivate în Mediu 254 (#M254500) suplimentat cu Supliment pentru creșterea melanocitelor umane (#S0025) și incubate la 37 °C sub o atmosferă de 5% CO2. Pentru experimente, au fost utilizate NHM primare între pasajele 4 și 7. Viabilitatea celulelor cultivate a fost evaluată folosind un kit de numărare a celulelor-8 (CCK{-8), așa cum este descris de producător (DOJINDO, Tokyo, Japonia).

4.3. Măsurarea conținutului de melanină

Conținutul de melanină a fost determinat așa cum este descris în rapoartele anterioare [2-4]. Pe scurt, celulele B16 au fost tratate cu concentrațiile indicate de glucoză în prezență de -MSH (200 nM) timp de 72 de ore. NHM-urile au fost tratate cu concentrațiile indicate de glucoză timp de 4 zile. După aceea, toate celulele au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și dizolvate în NaOH 1 N la 60 ◦ C timp de 1 oră. Lizatele celulare au fost transferate pe o placă de 96-godeuri și absorbanța a fost măsurată la 405 nm. Valorile au fost normalizate pe baza concentrațiilor de proteine ​​din fiecare godeu de probă.

4.4. Testul activității tirozinazei de ciuperci

Am investigat efectele directe ale concentrațiilor indicate de glucoză asupra activității tirozinazei ciupercilor. Pe scurt, 100 µL de tampon fosfat care conține glucoză a fost amestecat cu tirozinaza de ciuperci (10 unități/godeu) și combinat cu 50 µL de 0,03% L-tirozină sau L-DOPA în apă distilată. Apoi, amestecul a fost incubat împreună la 37 °C timp de 10 minute și absorbanța a fost măsurată la 405 nm. Acidul Kojic (KA), un agent anti-tirozinază bine-cunoscut, a fost utilizat ca compus de referință.

4.5. Analiza activității tirozinazei intracelulare

Pe scurt, celulele B16 sau NHM au fost tratate cu concentrațiile indicate de glucoză pentru timpii indicați. Apoi, celulele au fost spălate cu PBS și lizate prin incubare în tampon fosfat 50 mM (pH 6,8) care conține 1 procente Triton X{-100 și 0,1 mM fluorură de fenilmetil-sulfonil. Lizatele celulare au fost apoi centrifugate la 12,000 rpm la 4 ◦C timp de 20 de minute. Supernatantul care conține tirozinaza celulară a fost colectat și conținutul de proteine ​​a fost determinat pentru normalizare. Extractul celular a fost incubat cu L-DOPA în tampon fosfat și formarea dopacromului a fost monitorizată prin măsurarea absorbanței la 405 nm în 30 de minute.

4.6. Izolarea ARN și reacția în lanț a polimerazei de transcripție inversă cantitativă în timp real (qRT-PCR)

Pentru a determina expresia relativă a ARNm a genelor selectate, ARN-ul total a fost izolat cu TRIzol (Invitrogen, CA, SUA), conform instrucțiunilor producătorului, iar 4 µg ARN a fost transcris invers în cADN folosind RT-premix (Bioneer, Seoul, South). Coreea). PCR cantitativă a fost efectuată utilizând un sistem rapid de PCR în timp real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Seturile de primeri qRT-PCR pentru tirozinază și Tyrp-1 au fost achiziționate de la Applied Biosystems, iar kiturile TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) au fost utilizate pentru amplificare. Expresia genei țintă a fost normalizată la cea a genei menajere care codifică proteina ribozomală subunitatea tulpină laterală P0 (RPLP0). Cuantificarea relativă a fost efectuată folosind metoda comparativă ∆∆Ct conform instrucțiunilor producătorului.

4.7. Western Blotting

Celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece și apoi lizate în tampon RIPA modificat la rece cu gheață (Cell Signaling Technology, MA, SUA) care conține inhibitori de protează (Calbiochem, La Jolla, CA, SUA). Concentrația totală de proteine ​​a fost determinată, iar proteinele au fost rezolvate prin SDS-PAGE pe geluri Bis-Tris cu gradient de 4-12% (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA), transferate pe membrane de nitroceluloză (Thermo Fisher Scientific). După transfer, membranele au fost blocate într-o soluție de blocare de 5%. Membranele au fost incubate cu anticorpi primari la 4 ◦C timp de 24 de ore, spălate cu soluție salină tamponată Tris care conține 0,1% Tween-20 (TBST) și expuse la anticorpi secundari conjugați cu peroxidază timp de 1 oră la temperatura camerei. Membranele au fost clătite de trei ori cu TBST. Un semnal chemiluminiscent a fost dezvoltat utilizând reactiv ECL Western blot (GE Healthcare, Hatfield, Marea Britanie).

4.8. Echivalent cu piele umană tridimensională (3D).

Am folosit MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, SUA) ca model de țesut de piele umană. Acest echivalent viabil, reconstituit, 3D de piele umană a fost derivat de la donatori de culoare neagră și conține melanocite și keratinocite normale. MelanoDerm a fost crescut la interfața aer-lichid în mediu EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, SUA). Înainte de tratamentul cu glucoză, țesuturile au fost spălate cu 1 mL PBS pentru a îndepărta compușii reziduali. Glucoza a fost dizolvată în PBS. Concentrația finală de glucoză a fost de 2%. Proba martor a fost tratată numai cu PBS. Glucoza a fost aplicată pe MelanoDerm în zilele 1, 4, 6, 8, 11, 13 și 15. După 18 zile, țesuturile MelanoDerm au fost fixate în formaldehidă tamponată cu 4%, încorporate în parafină, tăiate la o grosime de 3 µm și supuse la colorarea H&E și F&M. Viabilitatea probelor de țesut a fost evaluată folosind un kit de numărare a celulelor-8 (CCK{-8), așa cum este descris de producător (DOJINDO, Tokyo, Japonia). Pigmentarea MelanoDerm a fost evaluată prin compararea modificării valorii L*.

4.9. Imagistica prin fluorescență cu excitație cu doi fotoni (TPEF).

Pentru a vizualiza distribuția melaninei în echivalentul 3D al pielii umane, am efectuat imagistica TPEF, așa cum este descris în rapoartele noastre anterioare [3,4]. Pe scurt, fiecare preparat MelanoDerm a fost fixat în formol 4% timp de 24 de ore la 4 °C și apoi spălat cu PBS/0,1% BSA (albumină serică bovină, Merck, Branchburg, NJ, SUA). Imaginile TPEF au fost obținute din stratul bazal pentru a măsura melanina intracelulară în stratul de melanocite. Intensitățile relative ale semnalului TPEF pentru melanină în volumul de măsurare au fost cuantificate folosind software-ul Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, SUA).

4.10. Analiza L-lactatului

Celulele B16 au fost însămânțate la 1,0 × 105 celule per godeu într-o placă de 12-godeuri. După tratamentul cu glucoză timp de 3 zile, nivelurile extracelulare de lactat au fost cuantificate folosind un kit de analiză colorimetrică L-lactat (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) conform protocolului producătorului.

4.11. Analize statistice

Datele sunt exprimate ca medii ± SD (abateri standard), iar semnificația statistică a fost determinată de testul t Student. O valoare p < 0.05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

Contribuții ale autorului:

Conceptualizare, H.-JK, JL și CSL; Curatarea datelor, SHL; Ancheta, SHL; Metodologie, SHL, I.-HB și E.-SL; Supraveghere, JL și CSL; Scriere — schiță originală, SHL și CSL; Scriere — revizuire și editare, JL Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:

Această cercetare a fost finanțată de Programul de cercetare în știință de bază prin Fundația Națională de Cercetare din Coreea (NRF), finanțat de Ministerul Educației (Număr grant: 2018R1D1A1B07049402).

Conflicte de interes:

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Abrevieri

-MSH -hormon de stimulare a melanocitelor

Proteina înrudită cu tirozinaza Tyrp-1 1

factor de transcripție asociat microftalmiei MITF

Melanocite umane normale ale NHM

Fluorescență cu excitație cu doi fotoni TPEF

Receptorul X hepatic LXR

AHA alfa hidroxiacizi

H&E hematoxilină și eozină

F&M Fontana-Masson

Referințe

1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Investigarea rolului melaninei în producția de ROS celulară și mitocondrială indusă de UVA/UVB și peroxid de hidrogen și deteriorarea ADN-ului mitocondrial în celulele melanomului uman. Radic liber. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Un nou derivat de adamantil benzilbenzamidă, AP736, suprimă melanogeneza prin inhibarea factorului de transcripție asociat microftalmiei activate de cAMP-PKA-CREB și a expresiei tirozinazei. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Oh, SG; et al. Eficacitatea antimelanogenă a Melasolv (3,4,5-Trimetoxicinamat Thymol Ester) în melanocite și echivalent tridimensional al pielii umane. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lipidele Lee, CS Mannosylerythritol inhibă melanogeneza prin suprimarea semnalizării ERK-CREB-MITF-Tyrosinase în melanocitele umane normale și un echivalent tridimensional al pielii umane. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Dezvoltarea agenților anti-melanogeni pe bază de zahăr. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Inhibitori ai melanogenezei. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. Ando, ​​H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Auz, VJ Abordări pentru a identifica inhibitorii biosintezei melaninei prin controlul calității tirozinazei. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MEA; Yoon, TJ Perturbarea glicozilării tirozinazei de către N-acetilglucozamină și efectele sale depigmentante în pielea de cobai și pielea umană. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Eficacitatea depigmentării acidului galacturonic prin reglarea tirozinazei în celulele melanomului murin B16 și un echivalent tridimensional al pielii umane. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Efectele unui carbohidrat ciclic non-ciclodextrină asupra celulelor melanomului de șoarece: Caracterizarea unui nou tip de zahăr hipopigmentat. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Inhibitori noi de tirozinază din resurse naturale – Studiile lor computaționale. Curr. Med. Chim. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: O revizuire actualizată asupra aspectelor biologice, chimice și clinice. Pigment. Celulă. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Efecte diferite ale cinci compuși de-pigmentari, rododendron, cetonă de zmeură, monobenzonă, rucinol și AP736 asupra melanogenezei și viabilității melanocitelor epidermice umane. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, î.Hr.; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Metabolismul glucozei în cultura de celule de mamifere: noi perspective pentru modificarea căilor de epocă. Tendințe. Biotehnologia. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]

15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Efectul inhibitor al acidului glicolic și al acidului lactic asupra sintezei melaninei în celulele melanomului. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Rafinoza crește autofagia și reduce moartea celulară în keratinocitele iradiate cu UVB. J. Photochem. Fotobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehaloza, zaharoza și rafinoza sunt noi activatori ai autofagiei în keratinocitele umane printr-o cale independentă de mTOR. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Glucoza locală induce expresia Claudin-1 și Filaggrin într-un model de șoarece de dermatită atopică și în cultura de keratinocite, exercitând efecte antiinflamatorii prin repararea funcției de barieră a pielii. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. Spravcikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Efectele glucozei asupra keratinocitelor pielii: Implicații pentru complicațiile pielii diabetului. Diabet 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Receptorii nucleari în biologia macrofagelor: La intersecția metabolismului lipidic și a inflamației. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Fiul, ED; Park, YH; Lim, KM Liver X activarea receptorului inhibă melanogeneza prin accelerarea degradării MITF mediată de ERK. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Receptorul nuclear LXR este un senzor de glucoză. Natura 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Carbohidrat; IntechOpen: Londra, Marea Britanie, 2017; pp. 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Profilul comparat al fluxului metabolic al liniilor celulare de melanom: Dincolo de efectul Warburg. J. Biol. Chim. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Efectele duble ale acizilor alfa-hidroxi asupra pielii. Molecule 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com