Supraexpresia GRP78 declanșează mitofagia neuroprotectoare mediată de PINK1-IP3R Partea 2

2.5. Western Blot

Am anesteziat profund șobolanii cu Dolethal (n=4) la 7 dpi pentru a obține segmente L4-L5 ale măduvei spinării (5-mm lungime) pentru analiza Western blot. Am congelat rapid probele în azot lichid.

În ultimii ani, din ce în ce mai multe rezultate ale cercetărilor au arătat că există o relație strânsă între blotting proteine ​​și memorie. Protein blotting este o tehnică analitică pentru detectarea expresiei proteinelor, care a fost utilizată pe scară largă în cercetarea în neuroștiință.

Legătura dintre neuroni este strâns legată de stocarea memoriei. Protein blotting poate detecta starea conexiunii dintre neuroni și expresia proteinelor pre- și post-sinaptice, dezvăluind în continuare rolul important al proteinelor în formarea și stocarea memoriei.

Studiile au descoperit că expresia proteinelor neuronale presinaptice este strâns legată de formarea și stocarea memoriei. De exemplu, în timpul procesului de învățare și memorie, neuronii modifică expresia proteinelor presinaptice, iar această schimbare este legată de formarea și stocarea de noi amintiri. În plus, unele studii au mai constatat că modificările în expresia unor proteine ​​sunt legate de boli neurodegenerative precum boala Alzheimer.

Prin urmare, protein blotting poate oferi o înțelegere aprofundată a stării conexiunii dintre neuroni și a modificărilor în expresia proteinelor înrudite, dezvăluind mecanismul molecular al neuronilor. Acest lucru este de mare importanță pentru studierea mecanismului de formare a memoriei și a bolilor neurodegenerative.

Pe scurt, relația dintre blocarea proteinelor și memorie arată rolul proteinelor în legătura dintre neuroni și stocarea memoriei. Aceasta oferă noi idei și direcții pentru studierea mecanismului de formare a memoriei și a bolilor neurodegenerative. Să promovăm activ cercetarea în neuroștiință și să contribuim la sănătate și longevitate! Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece are efecte antioxidante, antiinflamatorii și anti-îmbătrânire, care pot ajuta la reducerea răspunsurilor oxidative și inflamatorii din creier, protejând astfel sănătatea nervilor. sistem. În plus, Cistanche poate promova, de asemenea, creșterea și repararea celulelor nervoase, sporind astfel conectivitatea și funcția rețelelor neuronale. Aceste efecte pot ajuta la îmbunătățirea memoriei, a capacității de învățare și a vitezei de gândire și pot preveni, de asemenea, apariția disfuncțiilor cognitive și a bolilor neurodegenerative.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de îmbunătățire a funcției creierului

Probele au fost stocate sau prelucrate în continuare prin omogenizare în tampon de liză (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM zaharoză, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA și un cocktail de protează (Sigma-Aldrich) și inhibitori de fosfatază (Roche, Basel, Elveția) ) cu un omogenizator Potter pe gheață.

După centrifugarea lizatelor la 800 x g timp de 20 de minute la 4 °C, am colectat supernatantul ca fracție post-nucleară și am cuantificat proteinele prin test BCA (Pierce Chemical Co.).

Pentru Western blotting, am încărcat 30 µg de fracțiuni post-nucleare de segmente L4-L5 de la fiecare animal pe geluri de poliacrilamidă SDS 12% pentru a efectua separarea electroforetică a proteinelor, urmată de transferul pe o membrană PVDF într-un sistem BioRadcuvette în 25 mM. Tris, pH 8,4, 192 mM glicină, 20% (v/v) metanol.

Am blocat membranele cu 5% BSA în PBS plus 0.1% Tween-20 timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi am incubat la 4 ◦ C peste noapte cu anticorp primar: anti- -actină de șoarece ( 1:10000, SigmaAldrich), anti-GRP78 de șoarece (1:500, Sigma-Aldrich), anti-CV de șoarece (1:1000, Invitrogen), anti-HSP60 de iepure (1:500, Anticorpi-online), NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), șoarece anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), iepure anti-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, Marea Britanie), șoarece anti-PINK1 (1:500, Abcam), iepure anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), iepure anti-GRP75 (1:500, Abcam).

După mai multe spălări, membranele au fost incubate timp de 2 ore cu un anticorp secundar adecvat conjugat cu peroxidază de hrean (1:5000, Vector). Membrana a fost vizualizată folosind un amestec chemiluminiscent de 1:1 (luminol 0,5 M, acid p-cumaric 79,2 mM, Tris-HCI 1 M, pH 8,5) și (peroxid de hidrogen 8,8 M, Tris-HCI 1 M; pH 8,5) și imaginile au fost luate cu un aparat Gene Genome și analizate cu Gene Snap și software-ul Gene Tools (Syngene).

2.6. Model in vitro

Celulele NSC34 au fost cultivate în mediu de glucoză ridicat al lui Eagle modificat (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Sigma-Aldrich), 100 unități/ml penicilină și 0,5 X soluție de penicilină/streptomicina (Sigma-Aldrich) și menținut într-un incubator umidificat la 37 ◦ C sub 5% CO2, în esență așa cum a fost descris anterior [26].

După 4 zile de cultură celulară fără schimbarea mediului, celulele NSC34 au avut un fenotip asemănător diferențiat caracterizat prin prezența de neurite lungi. În ziua 4, medicamentele au fost adăugate celulelor. Soluțiile Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, SUA) și EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, SUA) au fost preparate la o concentrație de 10X și dizolvate în DMEM.

După 24 de ore, s-a evaluat viabilitatea celulelor prin incubarea celulelor cu 4 mg/mL soluție MTT timp de 3 ore. Cristalele de formazan albastru formate au fost dizolvate în DMSO și absorbanța la 570 nm a fost măsurată cu un cititor de microplăci (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, SUA).

2.7. Nucleofecție

Am transfectat un milion de celule cu 2 ug plasmidă pentru exprimarea GFP, GRP78, HAPARK, mouse-ul sh-eGFP, mouse-ul sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mouse-ul sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) și /sau mouse-ul sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) folosind Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Elveția) și kitul Nucleofactor V (Lonza) urmând recomandările producătorului.

Pentru analiza citometrică statică, am însămânțat celulele în {{{0}}godeuri acoperite cu colagen 10%. După cultură, am fixat celulele cu 4% PFA, am clătit de două ori cu PBS și am stocat sau adăugat ulterior tampon de blocare care conține PBS 0,3% (v/v)Triton X-100 și 10% ser fetal bovin. După 3 zile de cultură celulară, s-au adăugat medicamente dizolvate în DMEM.

Pentru aceste experimente, am folosit 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) sau 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). După 5 ore după tratament, fie am fixat celulele pentru imunocitochimie cu 4% PFA, fie le-am omogenizat în tampon RIPA modificat (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1 mM EGTA). , 1% NP-40, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, cocktailuri de protează și fosfatază) pentru imunoblot. Imunohistochimia a fost efectuată prin clătirea probelor de două ori cu PBS și incubarea cu tampon de blocare care conține PBSplus 0,3% (v/v) Triton X-100 și 10% ser fetal bovin.

Am incubat cu următorii anticorpi primari: iepure anti-IP3R (1:200, Abcam), șoarece anti-HA (1:2000, Abcam), șoarece anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) și iepure anti-HSP60 (1:500, Antibodies-online). Pentru a evalua viabilitatea prin MTT așa cum este descris mai sus, am lăsat tratamentul timp de 24 de ore.

2.8. Măsurarea producției de superoxid mitocondrial și ∆ψM

Celulele au fost incubate cu 2,5 pM MitoSOX pentru analiza superoxidului sau cu 2,5 pMTMRM pentru analiza ∆ψM, atât de la Molecular Probes, cât și Invitrogen în ultimele 30 de minute de tratament. Fluorescența a fost detectată cu un microscop IX81 Olympus și cuantificată folosind software-ul de citometrie statică.

2.9. Măsurarea electrochimică a consumului de oxigen

Celulele (1 × 106 per 1 mL în HBSS) au fost agitate într-o cameră etanșă la gaz la 37 ◦ C. Măsurătorile au fost luate cu un electrod O2 de tip Clark (Rank Brothers, Cambridge, UK) și înregistrate cu datele Dup.18 dispozitiv de achiziție (WPI) imediat după 5-htratamentul cu vehicul sau Tun.

2.10. Fracționarea mitocondrială și citosolică

Celulele au fost omogenizate în tampon de liză (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM zaharoză și un cocktail de proteaze (Sigma-Aldrich) și inhibitori de fosfatază (Roche)) cu un omogenizator Potter pe gheață.

După centrifugarea lizatelor la 2000x g timp de 5 minute, supernatantul a fost centrifugat la 10.000 x g timp de 12 minute. Supernatantul a fost considerat fracțiunea solubilă (S2) și conține proteine ​​​​citosolice și microzomi.

Peletul (P2) a fost fracția mitocondrială îmbogățită, care a fost resuspendată în tampon RIPA modificat (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8} }}, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, cocktailuri de protează și fosfatază) și concentrația de proteine ​​a fost determinată prin testul BCA. Probele au fost apoi prelucrate pentru Western blot.

2.11. Microscopia electronică cu transmisie

Am scufundat segmentele L{{{{0}}L5 ale măduvei spinării (felii de 1-mm) într-o soluție de fixare de 2% (g/v) PFA și 2,5% (v/v) glutaraldehidă (grad EM) în 0.1 M PBS, pH 7,4 și le-am plasat pe o platformă balansoar timp de 2 ore, apoi fixate în 1% (g/v) PFA și ulterior postfixate cu 1% (g/v) tetroxid de osmiu (TAAB Lab) ) care conține 0,08% (g/v) hexacianoferat de potasiu (Sigma-Aldrich) în PBS timp de 2 ore.

Am efectuat patru spălări cu apă deionizată și deshidratare secvențială în acetonă. Toate procedurile au fost efectuate la 4 ◦C, așa cum este descris anterior [33]. Am încorporat mostre în rășină EPON și am polimerizat la 60 ◦ C timp de 48 de ore.

Probele au fost prelucrate pentru a obține secțiuni semi-subțiri (1 µm) cu un microtom Leicultracut UCT, colorate cu soluție apoasă de albastru de toluidină 1% (g/v) și examinate cu un microscop cu lumină pentru a identifica zonele cornului ventral îmbogățite cu MN.

Secțiuni ultrasubțiri (70 nm) au fost tăiate cu un cuțit de diamant, așezate pe grile acoperite și au fost contrastate cu acetat de uranil convențional și soluții Reynolds de citrat de plumb.

În cele din urmă, am observat secțiunile cu un microscop electronic de transmisie (Jeol 1400) echipat cu o cameră GatanUltrascan ES1000CCD. Am selectat trei felii pe condiție, am analizat trei MN-uri pe secțiune și am măsurat zonele nucleelor ​​în comparație cu aria totală a MN-ului folosind instrumentele ImageJ.

2.12. Bioinformatica si Statistica

Am folosit analize de varianță (ANOVA) pentru a compara valorile dintre diferite grupuri experimentale pentru datele care au îndeplinit ipoteza de normalitate. Diferențele dintre grupuri au fost analizate folosind un ANOVA unidirecțional, urmat de testul cu intervale multiple post-hoc al lui Tukey sau folosind testul t al lui Student. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0.05 pentru semnificație).

3. Rezultate

3.1. Text

3.1.1. Analiza proteomică a supraexpresiei GRP78 a dezvăluit mitocondriile ca țintă principală

Pentru a identifica mecanismele moleculare care conduc la neuroprotecția mediată de supraexprimarea GRP78, am efectuat o analiză proteomică comparativă fără etichete pentru a identifica diferențele atât cantitative, cât și calitative între animalele rănite cu RA infectate cu adenovirusuri pentru supraexprimarea GRP78 (Ad-GRP78), care anterior s-a dovedit neuroprotector. de MN, sau beta-galactozidază (Ad-ß-Gal) ca martor [20].

Sevendays post-injury (dpi) a fost momentul ales pentru analiză conform studiilor anterioare efectuate în laboratorul nostru [20,25]. Într-o comparație anterioară între un model de regenerare după axotomie distală și sutura nervului sciatic față de modelul nostru degenerativ RA, am observat că evenimentele de semnalizare au fost similare până la 7 dpi, când au apărut evenimente divergente pro-degenerative după RA [20,25].

Analiza LC-MS/MS fără etichete a fracțiilor post-nucleare din segmentele măduvei spinării L4-L5 a dus la identificarea a 1420 de proteine, cu cel puțin două peptide per proteină, așa cum a fost raportat anterior pentru alte mostre și studii [25] .

Un total de 566 și 732 de proteine ​​sau peptide au fost modificate semnificativ din cauza supraexprimării Ad-GRP78 sau, respectiv, Ad-ß-Gal, la animalele rănite cu RA în raport cu animalele rănite cu RA neinfectate cu un virus (p < 0 .05) (Tabelele S1 și S2).

Am comparat ambele liste și am constatat că 220 au fost modificate în mod unic din cauza supraexpresiei Ad-GRP78 (Tabelul S3). Adnotarea funcțională a acestor proteine ​​folosind instrumentul DAVID (Baza de date pentru adnotare, vizualizare și descoperire integrată) ne-a permis să identificăm cele mai semnificative funcții biologice din setul de date (FDR < 0,05) [34,35].

Supraexprimarea GRP78 a dus la diferențe în nivelurile proteinelor implicate în procesele, funcția și componentele mitocondriale (Tabelul S4A-C, Figura S1A-C). Termenii de Ontologie genetică (GO) și analiza de îmbogățire a căii KEGG a acestor date au arătat că la animalele infectate cu Ad-GRP78 au existat scăderi semnificative ale nivelurilor multor proteine ​​cu funcții mitocondriale, inclusiv proteinele din fața mitocondrială exterioară și interioară, proteinele complexului respirator, și proteinele matricei.

Am confirmat diferențele în nivelurile de proteine ​​​​dezvăluite în lista proteomică, cum ar fi GRP75, care a fost reglat în sus (p <{1}}.05) și subunitatea complexului V (CV), reglat în jos (p=0.03) în grupurile GRP78 așa cum era de așteptat (Figura 1A).

Din întreaga listă, cele mai puternic reglate au fost 2-proteina purtător de malat/oxoglutarat OGC (SCL25A11), MT-ND3 (un supresor de tumori care participă la transferul themalat-aspartat și regenerează rezervorul de NADH din matricea mitocondrială pentru a permite complexul). I), subunitatea 3 de NADH dehidrogenază a complexului I, aminotransferaza ABAT a acidului gammaaminobutiric și subunitatea reductază ubichinol-citocrom C a complexului III. În schimb, foarte puține proteine ​​au fost reglate (Figura 1B).

O proteină reglată a fost GRP78, așa cum era de așteptat, iar celelalte proteine ​​​​reglate au fost transportorul de aminoacizi EAAT2, care este localizat în principal în membrana plasmatică și, uneori, în mitocondrii la sinapsele excitatoare, și hidroxiacil-CoA dehidrogenază HADHA, care catalizează ultimii trei pași ai beta mitocondrială. - oxidarea acizilor grași cu lanț lung.

Am extins analiza pentru a investiga dacă alte proteine ​​din proteinele legate de funcția mitocondriilor au fost modificate din lista proteomică pentru a confirma afectarea funcțională a mitocondriilor (Figura 1C).

Am observat că atrofia optică GTPază 1 (OPA1) legată de dinamină conservată mitocondrială, care este implicată în fuziune [36], a fost reglată în jos (p < 0.1); LONP1, o protează dependentă de ATP care mediază degradarea selectivă a polipeptidelor pliate greșit, a prezentat o tendință de creștere, dar nu s-au observat diferențe în nivelurile de ubichinonă NDUFA9, factorul de transcripție NRF2, care reglează genele care conțin elemente de răspuns antioxidant sau alte dinamine. -GTPaza asociată implicată în perfuzie, cum ar fi mitofusina 2 (MFN2) [36].

Un rezumat cuprinzător al modificărilor găsite în mitocondrie este prezentat în schema din Figura 1D. Dinamica mitocondrială este importantă pentru răspunsurile la stres, deoarece mitocondriile deteriorate fuzionează pentru schimbul de material, iar fisiunea mitocondrială permite segregarea mitocondriilor deteriorate și mitofagia ulterioară [37].

Având în vedere că numărul major de proteine ​​reglate în jos se localizează la mitocondrii și nu au fost observate modificări evidente în ceea ce privește activitatea de fuziune a mitocondriilor prin analiza MFN2 și raportul formelor L/S OPA1 (Figura 1C), am investigat markerii legați de mitofagie.

În mod clasic, degradarea mitocondriilor dependentă de autofagie are loc după depolarizare și este de obicei declanșată de acumularea crescută a fosfatazei și a tensinhomologului (PTEN) indusă de kinaza 1 (PINK1) de lungime completă la membrana mitocondrială exterioară.

Ulterior, inter-inelul E3 ubiquitin-protein ligaza Parkin este recrutată pentru a marca proteina mitocondrială a membranei exterioare a mitocondriilor depolarizate prin ubiquitilare [38-41]. Partea de sus a figurii 2A nu prezintă modificări ale nivelurilor Parkin, dar o reducere semnificativă a PINK1 pe toată lungimea produsă de leziuni RA în segmentul măduvei spinării L4-L5 ipsilateral în raport cu controlul la 7 dpi. În schimb, supraexpresia GRP78 a redus Parkin, dar a dublat nivelurile PINK1 după RA în comparație cu expresia de control a proteinei neînrudite -Gal (Figura 2A, jos).

Reglarea în sus a PINK1 de lungime completă este în concordanță cu inducerea mitofagiei [42], iar reducerea Parkinului ar putea fi legată de o stare avansată de dezmembrare a organelelor, așa cum este observată de restul proteinelor mitocondriilor.

Investigăm în continuare co-localizarea mitocondriilor și a proteinelor asociate microtubulilor 1A/1B lanțul ușor 3 (LC3)-pozitiv puncta, o componentă cheie a mașinilor de macroautofagie de bază și necesară procesului de mitofagie [43].

Folosind microscopia confocală, am observat o creștere semnificativă a co-localizării mitocondriilor, etichetate cu anti-COX IV, cu puncta LC3-pozitivă după RA numai în MN-urile deteriorate care supraexprimă GRP78 la 7 dpi (Figura 2B).

Am confirmat existența mitofagiei în MN-urile avulsate numai atunci când supraexprimam GRP78 prin analiza probelor utilizând microscopia electronică cu transmisie.

Am observat vacuole abundente cu mitocondrii înghițite, un semn distinctiv al mitofagiei [37], asemănătoare cu mitofagozomi și mai multe ERcisternae în strânsă legătură cu mitocondriile din MN-uri de la animale Ad-GRP78, dar nu le-am detectat la Ad- -Gal RA rănit. probe de șobolan la 5 dpi (Figura 2C).

Figura 1. Supraexprimarea GRP78 la animalele rănite cu RA vizează proteinele mitocondriale. (A) Immunoblot și grafice cu bare care arată modificările medii ale orificiilor (± SEM) ale nivelurilor de proteine ​​​​GRP78, GRP75 și CV în segmentele măduvei spinării L{4-L5 în GRP78 vs.

-Gal supraexprimând șobolanii răniți de RA cu 7 dpi. Nivelurile au fost normalizate la valorile actinei (n=4; * p < 0,05 vs.Ad{- -Gal, testul t Student). (B) Histograma modificărilor pliului proteinei mitocondriale obținute prin analiza proteomică a segmentelor măduvei spinării L{4-L5 de la animalele rănite de RA care supraexprimă GRP78 în comparație cu grupul Ad- -Gal cu 7 dpi. (C) Immunoblot și grafice cu bare care arată modificările medii ale ori (± SEM) ale NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 normalizate la actină. (Fără diferențe semnificative între grupuri. Testul t Student). (D) Mitocondrii schematice cu proteine ​​modificate de supraexprimarea GRP78 în segmentele măduvei spinării L4-L5 de la animalele rănite de RA evidențiate cu galben (scăzut) sau în albastru (creștet) la 7 dpi.

Figura 2. Mitofagia este modulată in vivo după RA la șobolani care supraexprimă GRP78. (A) Imunobloturi și grafice cu bare corespunzătoare pentru analiza modificării orificiului PINK1 și PARK a nivelurilor proteinelor (medii ± SEM) normalizate la nivelurile de actină, în segmentele L4-L5 ale măduvei spinării ale șobolanilor lezați cu RA vs.

control (sus) sau din grupurile Ad{{0}}Gal și Ad-GRP78 (jos) cu 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, testul t al studentului). (B) În stânga, microfotografii ale MN-urilor reprezentative la locul ipsilateral de la animalele rănite prin RA care au primit o injecție intratecală cu grupuri AAVrh10-GFP sau AAVrh10-GRP78 la 7 dpi. Probele au fost colorate pentru COX IV (roșu) și LC3 (verde) și contracolorate cu Nissl fluorescent (albastru).

Bară de scară=10 µm și zoom digital în inserții 10X.

Rețineți că co-localizarea este observată numai în grupul AAVrh10-GRP78. Dreapta, grafic cu bare care arată analiza % din punctele de co-localizare ale COX IV și LC3. Media ± SEM a co-localizării COX IV și LC3 (n=4; ** p < 0.01, testul t al Studentului). (C) Imagini reprezentative de microscopie electronică cu transmisie în care mitocondriile se disting în MN-urile măduvei spinării: a, imaginea citoplasmei MN care arată mitocondriile animale necontrolate; b, imaginea citoplasmei MN de la șobolan rănit de RA din grupul Ad- -gal; c, imagine a citoplasmei MN de la șobolan rănit cu RA din grupul Ad-GRP78 cu unele mitocondrii înghițite, indicate cu asteriscuri roșii; d, imaginea cu mărire mai mare este afișată în (C), indicând o mitocondrie mare și un contact ER. Barele de scară sunt indicate în figuri.

În total, aceste rezultate au sugerat că supraexprimarea GRP78 poate induce MN-uri deconectate de mitofagină după RA și ar putea promova neuroprotecția.

3.1.2. Supraexpresia GRP78 restabilește funcția mitocondrială deteriorată

Apoi am investigat în continuare efectul supraexprimării GRP78 asupra mitocondriilor utilizând un model in vitro de stres ER, deoarece această insultă apare devreme după leziunea RA in vivo, raportată anterior [20,26], și este o metodă fiabilă de a screening noi agenți neuroprotectori [2,44] ].

Acest model folosește tunicamicină (Tun), care este un inductor de stres ER care determină formarea intermediarilor N-acetilglucozamină-lipidici, prevenind astfel glicozilarea proteinelor nou sintetizate și conducând la plierea greșită a proteinelor. Am folosit asta, deoarece o cale secretorie oprită a fost, de asemenea, raportată a fi cheie în procesul neurodegenerativ după RA [26].

Am verificat mai întâi că nucleofecția celulelor asemănătoare motoneuronului NSC34 cu un vector adecvat a dus la producerea de GRP78 (Figura 3A). În aceste celule, expresia GRP78 a îmbunătățit semnificativ supraviețuirea în mediul care conține Tun (Figura 3B).

Deși tratamentul cu Tun induce în mod normal GRP78 în sine, această supraexpresie endogenă este destul de târziu (cu 24 de ore) (Figura S2). De asemenea, ne-am întrebat dacă am putea determina dacă supraexprimarea GRP78 are efecte neuroprotectoare într-un alt model in vitro pe care l-am raportat anterior că reproduce mai multe caracteristici ale morții MN după leziunea RA [26].

Acest model se bazează pe leziunile citoscheletice induse de nocodazol, care interferează cu polimerizarea microtubulilor. Expresia GRP78 a crescut viabilitatea celulelor cultivate și în prezența nocodazolului (Figura 3B).

Apoi, am evaluat funcția mitocondrială prin măsurarea generării de specii reactive de oxigen (ROS) în mitocondrii utilizând MitoSOX, potențialul membranei mitocondriale (∆ψm) folosind tetrametilrodamină metil ester (TMRM) și rata de consum de O2, în celulele noastre NSC34 supuse stresului . cu sau fără supraexpresie GRP78.

Ca martor pozitiv, am folosit efavirenz (EFV), un agent mitotoxic care modifică toți cei trei parametri [45]. Am observat că nivelurile MitoSOX au crescut progresiv după adăugarea Tun, atingând semnificația statistică cu 24 de ore și că generarea de ROS a crescut semnificativ în celulele tratate cu EFV din prima oră post-tratament în ceea ce privește controalele tratate cu vehicul (Figura S3A).

Supraexprimarea GRP78 a dus la niveluri semnificativ mai mici de mitocondrii de ROSin în raport cu celulele care exprimă GFP la 24 de ore după tratamentul Tun sau EFV (Figura 3C). ∆ψm a fost prăbușit după 5 și 24 de ore de tratament Tun și după 24 de ore de tratament EFV (Figura S3B). Recuperarea acestui parametru a fost realizată prin supraexpresia GRP78 în celulele tratate cu Tun sau EFV (Figura 3D).

Rata consumului de O2 a fost diminuată în timpul a 80 min de analiză după adăugarea Tun în celulele care exprimă GFP (pantă -0.063,R{2=0.98), dar consumul de O2 a fost stabil în celulele care supraexprimă GRP78- în ciuda prezenței lui Tun (pantă -0,221, R2=0,99) (Figura 3E, stânga).

După 5 ore, respirația a fost normală în celulele GRP78-supraexprimate și grav compromisă în celulele care exprimă GFP (Figura 3E, dreapta). În total, aceste rezultate sugerează că GRP78 atenuează disfuncția mitocondrială cauzată de stresul ER sau mitotoxicitatea.

For more information:1950477648nn@gmail.com