Reglarea mediată de HDAC1-a semnalizării GABA în septul lateral facilitează extincția de lungă durată a fricii sociale la șoarecii masculi

Tulburarea de anxietate socială (TAS) este cauzată de experiențe sociale traumatice. Se caracterizează prin frică intensă și evitarea contextelor sociale, care pot fi imitate robust de paradigma condiționării fricii sociale (SFC). Faza de extincție a paradigmei SFC este asemănătoare cu terapia de expunere pentru SAD și necesită învățarea de a disocia trauma de contextul social. Acetilarea histonelor indusă de învățare este esențială pentru formarea memoriei de extincție și rezistența acesteia. Deși histone deacetilazele de clasa I (HDAC) reglează procesul de învățare menționat mai sus, există o lipsă de claritate în izoforme și specificitate spațială în funcția HDAC în învățarea socială. Utilizând paradigma SFC, am caracterizat funcțional rolul HDAC1, în special în septul lateral (LS), în reglarea formării memoriei de extincție a fricii sociale pe termen lung.

Inducția este foarte importantă în învățare. Inducerea adecvată îi poate face pe elevi să accepte cunoștințele în mod mai conștient și să înțeleagă și să-și amintească mai profund conținutul învățat. Aceasta pentru că memoria oamenilor este un fel de activitate mentală și o manifestare a inteligenței. Inducția este o activitate cognitivă pozitivă și creativă, care poate stimula și ghida gândirea și imaginația oamenilor în timpul procesului cognitiv, îmbunătățind astfel memoria.

Inducția poate fi realizată în diferite moduri. De exemplu, profesorii pot stabili probleme în timpul prelegerilor și îi pot lăsa pe elevi să se gândească singuri la soluții, ceea ce îi poate ajuta pe elevi să își îmbunătățească capacitatea de a analiza cuprinzător problemele și memoria. În plus, profesorii pot folosi, de asemenea, resurse didactice bogate, cum ar fi imagini, audio, video și alte moduri de a promova absorbția și memoria de cunoștințe de către elevi.

Din acest motiv, există o relație strânsă între inducție și memorie. Prin inducerea adecvată, cursanții pot înțelege cunoștințele mai profund și pot stăpâni mai bine conținutul de învățare. Această înțelegere profundă îi va ajuta pe cursanți să păstreze cunoștințele pentru o perioadă mai lungă și să faciliteze aplicarea flexibilă a ceea ce au învățat în învățarea și practica ulterioară.

Pe scurt, inducția și memoria sunt inseparabile. Trebuie să găsim o metodă adecvată de învățare și o metodă de inducție prin explorare și practică continuă și să ne îmbunătățim continuu memoria și nivelul de învățare. Numai așa putem să dăm pe deplin talentele noastre în viața viitoare. Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria. Cistanche poate îmbunătăți memoria deoarece Cistanche este un material medicinal tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea cărnii tocate provine dintr-o varietate de ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid carboxilic, polizaharide, flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului prin diverse canale.

Faceți clic pe cunoașteți suplimentele pentru a crește memoria

Am măsurat o creștere locală a fosforilării HDAC1 care induce activitate la reziduurile de serină ale șoarecilor condiționați de frică socială și d (SFC+), ca răspuns la stingerea fricii sociale. De asemenea, am constatat că funcția LS-HDAC1 se corelează negativ cu învățarea extincției fricii sociale acute folosind abordări farmacologice și virale. În plus, inhibarea LS-HDAC1 a îmbunătățit expresia subunității receptorului GABA-A 1 (Gabrb1) la șoarecii SFC+, iar activarea receptorilor GABA-A a facilitat învățarea extincției acute. În cele din urmă, facilitarea învățării extincției prin inhibarea HDAC1 sau activarea receptorului GABA-A în cadrul LS a condus la formarea memoriei de extincție de lungă durată, care a persistat chiar și la 30 de zile după extincție. Rezultatele noastre arată că reglarea mediată de HDAC1-a semnalizării GABA în LS este crucială pentru formarea memoriei de stingere a fricii sociale.

INTRODUCERE

Tulburarea de anxietate socială (TAS) cauzată de experiența socială aversivă se caracterizează prin frică intensă și evitarea situațiilor sociale [1, 2]. Tratamentul pentru SAD constă în terapia cognitiv-comportamentală (CBT) bazată pe expunere, care creează o memorie „de siguranță” care coexistă cu memoria aversivă originală [3, 4]. Deoarece același indiciu poate activa atât amintirile aversive, cât și cele de siguranță, ele concurează atunci când sunt rechemate de stimuli relevanți, iar urma de memorie dominantă determină rezultatul comportamental. Se știe că memoria de siguranță creată de CBT bazată pe expunere se diminuează în timp, ceea ce duce la o recidivă a răspunsurilor de frică stinse anterior la pacienții cu SAD [5-7]. Astfel, este imperativ să înțelegem mecanismele care stau la baza memoriei de extincție durabilă pentru a dezvolta strategii terapeutice care să conducă la o remisiune mai completă și mai robustă din SAD.

În acest scop, am stabilit paradigma de condiționare a fricii sociale operante (SFC), care generează frică robustă și evitarea conspecificilor la șoareci [8]. În această paradigmă, dispariția fricii sociale și formarea memoriei de extincție sunt induse de prezentări consecutive ale diferiților stimuli sociali (conspecifici necunoscuți), având ca rezultat o pierdere treptată a fricii și o investigație socială sporită [9]. Studiile anterioare din laboratorul nostru au arătat implicarea septului lateral (LS) în stingerea fricii sociale induse de SFC la șoareci [10, 11]. LS este, de asemenea, cunoscut că reglează diferite comportamente sociale [12], care sunt susținute de mecanisme epigenetice complexe [13]. Cu toate acestea, mecanismele epigenetice din cadrul LS care reglementează stingerea fricii sociale și formarea memoriei de extincție pe termen lung rămân necunoscute.

Dovezile concurente sugerează importanța acetilării posttranslaționale a cozilor N-terminale ale reziduurilor de histonă în consolidarea și menținerea memoriei fricii [14]. Histone deacetilazele de clasa I (HDAC), care catalizează îndepărtarea grupărilor acetil din aceste cozi N-terminale ale histonelor, sunt regulatori esențiali ai expresiei genelor care stau la baza învățării și memoriei [15]. Aceste HDAC de clasă I, inclusiv HDAC1, HDAC2, HDAC3 și HDAC8, arată o dependență spațială și contextuală remarcabilă în funcția lor.

De exemplu, HDAC1 hipocampal a fost descoperit că îmbunătățește memoria asociativă într-o paradigmă de condiționare a fricii contextuale [16], în timp ce HDAC2 hipocampal a fost legat funcțional de afectarea formării obiectelor pe termen lung și a memoriei spațiale [17, 18]. În mod similar, activitatea HDAC1 a fost reglată în sus, în timp ce activitatea HDAC2 a fost reglată în jos în amigdala și, respectiv, în cortexul prefrontal, în urma condiționării fricii determinate [19]. Studiile au implicat, de asemenea, contribuția diferențială a HDAC3 în formarea de amintiri contextuale aversive robuste și de frică în hipocamp și, respectiv, în amigdala bazală [20].

Având în vedere funcțiile variate și complicate ale HDAC-urilor de clasă I în reglarea învățării și memoriei, inhibitorii HDAC sunt adesea utilizați ca amplificatori cognitivi în mai multe studii preclinice [21]. Cu toate acestea, contribuția HDAC-urilor specifice în reglarea rezistenței memoriei dispariției fricii sociale rămâne evazivă.

Astfel, în acest studiu, am examinat reglementarea HDAC-urilor de clasa I în contextul paradigmei SFC. Pe baza creșterii post-extincție a fosforilării serinei care induce activitatea HDAC1, am manipulat funcția LS-HDAC1 utilizând inhibarea farmacologică și supraexpresia virală. În plus, urmărind creșterea expresiei genei care codifică pentru 1 subunitate a receptorului de acid gamma-aminobutiric (GABA) A (Gabrb1) ca răspuns la combinația dintre blocarea HDAC1 și antrenamentul de extincție, am activat receptorul GABA-A. semnalizare în cadrul LS. În cele din urmă, am testat efectul inhibării LS-HDAC1 și activării receptorului LSGABA-A asupra formării memoriei de extincție pe termen lung. Rezultatele noastre indică faptul că LS-HDAC1 reglează negativ învățarea stingerii fricii sociale și învățarea pe termen lung a stingerii fricii sociale prin semnalizarea GABA-A.

MATERIALE ȘI METODE

Animale

Șoarecii masculi CD1 (Charles River Germania, vârsta de 8-11 săptămâni la începutul experimentelor) au fost ținuți găzduiți în grup în condiții standard de laborator (ciclu lumină/întuneric de 12/12 ore, lumini aprinse la 06:00, 22 de grade, 60% umiditate, hrană și apă ad libitum) în cuști de policarbonat (16 × 22 × 14 cm) până la operație sau cu 3 zile înainte de fiecare experiment comportamental. Șoarecii CD1 masculi potriviți în funcție de vârstă și greutate au fost utilizați ca stimuli sociali în paradigma SFC. Toate procedurile experimentale au fost efectuate între 08:00 și 12:00 h de către Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al Guvernului din Unterfranken, liniile directoare ARRIVE [22] și liniile directoare ale NIH.

Paradigma SFC

SFC a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [8] cu modificări minore pentru analiza extincției pe termen lung:

Dobândirea fricii sociale (ziua 1). Șoarecii au fost plasați în camera de condiționare a fricii și lăsați să se obișnuiască timp de 30 s înainte de a fi expuși la o cușcă goală din plasă de sârmă timp de 3 minute timp în care au putut investiga liber obiectul. Apoi, cușca goală a fost înlocuită cu o cușcă identică care conținea vârsta și conspecificul egal cu greutatea (stimul condiționat: CS). Șoarecii condiționati (SFC+) au primit un șoc ușor la picior (stimul necondiționat: US; 0,7 mA, 1 s) de fiecare dată când au investigat conspecificul. Șoarecii necondiționați (SFC-) au fost lăsați să interacționeze liber cu conspecific timp de 3 minute. De obicei, șoarecii SFC + au evitat să se apropie sau să interacționeze cu conspecificul după 1-3 perechi CS-US, moment în care s-a considerat că au dobândit frică socială și s-au întors în cușca lor de acasă.

Stingerea fricii sociale (ziua 2). Extincția fricii sociale a fost efectuată în mod identic în cușca de acasă a șoarecilor SFC+ și SFC−. Fiecare șoarece cu o singură găzduire a fost expus de trei ori la o cușcă goală din plasă de sârmă, apoi la șase conspecifici de vârstă și greutate diferite, timp de 3 minute fiecare, cu un interval interstimul de 3-min. Timpul petrecut investigând stimulul social a fost măsurat ca un indicator al fricii sociale.

Rechemarea fricii sociale (ziua 3, ziua 32). Pentru reamintirea pe termen scurt a stingerii fricii sociale, șoarecii au fost expuși la șase stimuli sociali diferiți în cușca lor de acasă timp de 3 minute cu un interval interstimul de 3-min. Pentru reamintirea pe termen lung a stingerii fricii sociale, șoarecii au fost testați în cușca lor de acasă la 30 de zile după dispariția fricii sociale. Vârsta la care potrivirea ponderală s-a expus de două ori la stimuli sociali diferiți timp de 3 minute fiecare cu un interval interstimul de 3-min.

Implantări stereotaxice

Ghid canulbygth; Injecta GmbH) pentru perfuzia bilaterală a medicamentului în LS au fost implantate stereotaxic cu vârful sprijinit la 2 mm deasupra regiunii țintă LS (din bregma: anterior-posterior: −0.3 mm, mediolateral: ±0 0,5 mm, dorsoventral: −1,6 mm [23]), sub anestezie cu izofluran (Forene, Abbott GmbH) [10, 24]. Toți șoarecii au primit o injecție subcutanată de antibiotice (10 mg/kg Baytril, Bayer GmbH) și analgezice (0,05 mg/kg Buprenorfină, Bayer) pentru a evita infecțiile și durerea post-chirurgicale. Pentru a reduce stresul post-chirurgical, toți șoarecii au fost manipulați o dată pe zi timp de cel puțin 5 zile înainte de experimentele în care au fost dezinfectate canulele false care închideau canulele de ghidare.

Infuzii intraseptale de medicamente

Șoarecii au primit perfuzii bilaterale fie de MS275 (un inhibitor de moleculă mică orto-aminoconspecificat cu afinitate mare pentru HDAC1; 375 ng/0.2 µl/emisferă), [16, 25], muscimol (Muc; un GABA-A selectiv agonist al receptorului; 0,2 µg/0,2 µl/emisferă) [26, 27] sau Vehicul (Veh; 0,2 µl/emisferă; 0. 5% DMSO în Ringer steril) în LS printr-o canulă de perfuzie de 27 G introdusă în canulele de ghidare conectate la o seringă Hamilton de 10-µl. Infuzia de MS275 și Muc a fost efectuată cu 120 de minute sau, respectiv, 10 minute înainte de antrenamentul de extincție SFC. Numai animalele cu locuri de perfuzie corecte, verificate histologic, au fost incluse în analizele statistice.

Infuzii virale intraseptale

Virusul Adeno-asociat (AAV; Vector Biolabs) pentru supraexprimarea HDAC1, adică AAV-hSyn-HDAC1-GFP-WPRE (HDAC1-OE; 2,5 × 1013 GC /ml;), sau vectorul de control, adică AAV-hSyn-GFP-WPRE (GFP; 2,5 × 1013 GC/ml), au fost infuzați bilateral în LS (anterior-posterior din bregma +0,3 mm). , lateral ±0,5 mm; dorsoventral −3,8 mm, −3,4 mm, −3,1 mm, −2,8 mm) cu patru 70-nl perfuzii/emisferă. Perfuziile au fost efectuate timp de 3 săptămâni au fost expuse la începutul experimentelor comportamentale așa cum a fost descris anterior [11].

Analiza expresiei genelor

Șoarecii au fost supuși la dispariția fricii sociale și au fost lăsați netulburați în cuștile lor de acasă timp de 90 minute după antrenamentul comportamental. Șoarecii au fost apoi sacrificați sub anestezie cu CO2, creierul lor a fost îndepărtat rapid și a fost disecat anterior-posterior-posterior din bregma 0.1 mm până la -0,10 mm).

Izolarea ARN și matrice PCR

Extracția și analiza proteinelor

Proteinele nucleare au fost extrase folosind kitul de extracție nucleară EpiQuick (Epigentek) conform protocolului producătorului. Analiza Western blot a fost utilizată pentru a detecta nivelurile de expressionToorylation HDAC1. 15 ug de proteină au fost dizolvate pe geluri fără pete TGX 12% (Bio-Rad) și transferate pe membrane de nitroceluloză. Membranele au fost blocate cu 5% lapte, 1% Tween-20 în soluție salină tamponată cu Tris, urmată de incubare peste noapte cu următorul anti-HDAC1 pe bază de antibanilidă (Thermo Fisher; PA1-860; 1:2000) , fosforilarea HDAC1 pe reziduul de serină 421 (iepure-anti-pHDAC1(S421); Thermo Fisher; PA5-36810; 1:2000), precum și fosforilarea pe serină 421 și 423 (iepure-anti-pHDAC1 (S421, S423), Thermo Fisher; PA5-36911; 1:2000). Benzile imunomarcate au fost detectate utilizând anticorpul capră-anti-iepure conjugat cu HRP (Cell Signaling; #7074; 1:1000) în urma unui sistem îmbunătățit de chemilbeforence (SuperSignal West Dura, Thermo Fisher). Proteina totală a fost utilizată ca control intern al încărcării.

Punctajul comportamentului și analiza statistică

Timpii de investigație socială ca indicator al fricii sociale au fost marcați manual de un observator nevăzut la tratament folosind JWatcher (1.0, Universitatea Macquarie și UCLA). GraphPad Prism versiunea 9.0 pentru Windows (Software GraphPad) a fost folosit pentru analiza statistică. Un raport detaliat al analizelor anterioare-posterioare este disponibil în tabelul suplimentar S2. Toate figurile au fost produse folosind designul Affinity.

REZULTATE

Stingerea fricii sociale reglează în creștere activitatea inducerii înainte de fosforilări în septul șoarecilor SFC+ În primul rând, am analizat nivelurile de proteină HDAC1 în țesutul septal msubiecte obținute de la șoareci SFC+ și SFC− la 90 minute după expunerea fie la un singur stimul social, adică cu extincție prescurtată (SFC+/1ss și SFC-/1ss) sau șase stimuli sociali, adică cu extincție completă (posterior-posterior6ss) (Fig. 1A). Numărul de perechi CS-US în timpul achiziției fricii sociale în ziua 1 (Fig. 1B) a fost similar între ambele grupuri de șoareci SFC +. După cum era de așteptat, șoarecii SFC + au petrecut mult mai puțin timp investigând primii (sau următorii) stimuli sociali în comparație cu șoarecii SFC- (P <0,05; Fig. 1C), indicând niveluri mai ridicate de frică socială. Cu toate acestea, până la sfârșitul protocolului complet de extincție, timpul de investigare al celui de-al șaselea stimul social de către șoarecii SFC + / 6ss a fost similar cu cel al omologilor lor SFC - / 6ss (Fig. 1C), sugerând extincția cu succes a fricii sociale.

Analiza Western blot nu a evidențiat diferențe în nivelurile septale HDAC1 între cele patru grupuri testate, adică între SFC+/1ss, SFC+/6ss, SFC-/1ss și SFC-/6ss, în timpul stingerii fricii sociale (Fig. 1D). Fosforilarea post-translațională a HDAC1 pe ser421 (pHDAC1) și dubla fosforilarea la ser421 și ser423 (ppHDAC1) sunt cunoscute pentru creșterea activității deacetilazei HDAC1 [28]. Astfel, am cuantificat nivelurile pHDAC1 și ppHDAC1 în sept pentru a evalua activarea HDAC1 în timpul dispariției fricii sociale. Atât nivelurile de pHDAC1, cât și de ppHDAC1 au fost crescute în SFC+/6ss comparativ cu șoarecii SFC+/1ss (Fig. 1E; P <{28}}.05 pentru pHDAC1 și Fig. 1F; P <0,05 pentru ppHDAC1), sugerând o creștere a activității HDAC1 în timpul stingerii fricii sociale.

Modularea bidirecțională a LS-HDAC1 reglează învățarea stingerii fricii sociale

În continuare, ne-am propus să stabilim o relație cauzală între funcția LSHDAC1 și stingerea fricii sociale prin modularea bidirecțională a funcției LS-HDAC1 folosind fie blocarea farmacologică (pierderea funcției), fie o supraexpresie mediată de AAV (câștig de funcție) în două cohorte separate de șoareci. .

Pentru blocarea farmacologică a micropuncurilor, S275 sau Veh a fost infuzat bilateral în LS înainte de antrenamentul de extincție, ducând la următoarele grupuri: SFC+/Veh, SFC+/MS275, SFC-/Veh și SFC-/MS275 (Fig. 2A). Numărul de perechi CS-US nu a diferit între grupurile SFC + în timpul achiziției fricii sociale (Fig. 2B). În timpul dispariției fricii sociale în ziua a 2-a, toți șoarecii SFC+ au exprimat niveluri ridicate de frică socială în timpul prezentării primului stimul social, independent de tratamentul lor, așa cum se reflectă în timpii scăzuti de investigație socială. Cu toate acestea, inhibarea HDAC1 a accelerat extincția, deoarece grupul SFC+/MS275 a afișat deja o investigație socială ridicată în timpul expunerii la al 2-lea și al 3-lea stimul social (P <0.05 vs. SFC+/Veh; Fig. 2C). Tratamentul cu MS275 nu a afectat timpii de investigație socială la șoarecii SFC- (Fig. 2C, D). Toate grupurile au arătat niveluri similare ridicate de investigație socială în timpul reamintirii pe termen scurt (Fig. 2D), indicând dispariția cu succes a fricii sociale.

În al doilea rând, am efectuat un experiment de creștere a funcției folosind supraexprimarea HDAC1 mediată de AAV (AAV-hSyn-HDAC1-GFPWPRE; HDAC1-OE) sau un virus de control (AAV-hSyn-GFP- WPRE; GFP) în septul șoarecilor SFC+ și SFC− conducând la următoarele grupuri: SFC+/GFP, SFC+/HDAC-OE, SFC−/GFP și SFC−/HDAC-OE (Fig. 2E). Toate grupurile de șoareci SFC + au primit același număr de perechi CSUS în timpul achiziției la trei săptămâni după transfecția virală (Fig. 2F), sugerând că supraexprimarea LS-HDAC1 nu a modificat învățarea fricii sociale. Toți șoarecii SFC+, independenți de tratament, au prezentat niveluri ridicate de frică socială în timpul prezentării primului stimul social, așa cum se reflectă prin investigația socială redusă în comparație cu grupurile SFC- respective (Fig. 2G). Cu toate acestea, dispariția fricii sociale a fost afectată semnificativ de supraexprimarea LS-HDAC1, deoarece grupul SFC+/HDAC1-OE a afișat o investigație socială mai scăzută în timpul expunerii celui de-al 2-lea până la al 6-lea stimul social, spre deosebire de șoarecii SFC+/GFP care au afișat așteptările. extincție (P <0.05 vs. SFC+/GFP; Fig. 2G). înainte de șoareci, supraexpresia LS-HDAC1 nu a afectat timpii de investigație socială (Fig. 2G, H). În timpul reamintirii pe termen scurt, toate grupurile de șoareci au prezentat niveluri similare de investigație socială (Fig. 2H). Supraexprimarea HDAC1 a fost confirmată prin analiza Western blot (Fig. S1 suplimentară).

Inhibarea pre-extincție a LS-HDAC1 duce la modificări dinamice ale expresiei genelor

Pentru a identifica posibilele ținte din aval ale LS-HDAC1, șoarecii SFC+ au fost perfuzați bilateral fie cu Veh, fie cu MS275 120 min înainte de dispariția fricii sociale și au fost sacrificați la 90 min după expunerea fie la primul (Veh). /1ss și MS275/1ss) sau al 6-lea (Veh/6ss și MS275/6ss) stimul social (Fig. 3A). Micropuncurile de țesut septal au fost obținute și procesate folosind o matrice PCR pentru semnalizarea GABA și glutamat (vezi „Materiale și metode”). Toate grupurile SFC+ au primit un număr similar de perechi CS-US în timpul achiziției fricii sociale (Fig. 3B). În timpul dispariției, toate grupurile de șoareci SFC+ au prezentat o investigație socială scăzută în timpul expunerii la primul stimul social. Cu toate acestea, în timpul extincției, șoarecii SFC + sacrificați după al șaselea stimul social au arătat un contact social incremental cu fiecare expunere sugerând o extincție adecvată a fricii sociale (Fig. 3C). Ca confirmare a rezultatelor din Fig. 2C, dispariția fricii sociale a fost accelerată la MS275/6ss în comparație cu șoarecii Veh/6ss, așa cum este evident din timpi mai mari de investigație socială în timpul prezentării la al 2-lea și al 3-lea stimul social (P < 0. 05 vs. Veh/ 6ss; Fig. 3C). Analiza matricei PCR pentru genele legate de semnalizarea GABA și glutamat a dezvăluit schimbări dinamice în multe gene, așa cum se arată în harta termică (Fig. 3D). Un generalist complet al matricei PCR împreună cu modificările respective și valorile P sunt furnizate în tabelul suplimentar S3. Cu toate acestea, o genă care a fost reglată în mod explicit la șoarecii tratați cu MS275-după antrenamentul complet de extincție a fost Gabrb1 (P <0,05 față de toate celelalte grupuri; Fig. 3E), în timp ce gena Gabrb3 strâns înrudită a rămas neschimbată (Fig. 3F). ).

Activarea farmacologică a receptorilor LS-GABA-A facilitează învățarea extincției

Pe baza rezultatelor creșterii post-extincție indusă de HDAC{{{0}}inhibarea expresiei Gabrb1, am emis ipoteza că semnalizarea GABAergică ar putea sta la baza efectului de accelerare a extincției al inhibării LSHDAC. Pentru a testa această idee, am activat local semnalizarea LSGABA-A prin infuzarea de Muc, un agonist specific GABA-A [25] sau Veh, conducând la următoarele grupuri: SFC+/Veh și SFC+/Muc, SFC-/Veh și SFC−/Muc (Fig. 4A). Șoarecii SFC+ infuzați fie cu Muc, fie cu Veh au necesitat același număr de perechi CS-US pentru a dobândi frica socială (Fig. 4B). În timpul dispariției fricii, toți șoarecii SFC+ au petrecut un micropunchese semnificativ investigând stimulul social în timpul expunerii la primul stimul social decât omologii lor SFC− (P <0.05 vs. SFC−/Veh și SFC−/Muc; Fig. 4C), care a indicat spre dobândirea cu succes a fricii sociale. Cu toate acestea, șoarecii SFC+/Muc au prezentat o extincție mai rapidă. Mai exact, ei au arătat niveluri de investigație socială similare cu cele ale șoarecilor SFC-, care au fost semnificativ mai mari decât cele ale șoarecilor SFC +/Veh deja în timp ce erau expuși la al doilea stimul social (P <0,05 vs. SFC +/Veh: Fig. 4C) . În timpul retragerii pe termen scurt, toate grupurile de șoareci au prezentat investigații sociale similare (Fig. 4D), sugerând extincția cu succes.

Inhibarea farmacologică a LS-HDAC1 sau activarea semnalizării LS-GABA duce la dispariția durabilă a fricii sociale

Pe baza învățării îmbunătățite privind extincția pe care am observat-o atât după inhibarea LS-HDAC1, cât și după activarea semnalizării LS-GABA, am studiat în continuare natura durabilă a acestor generalizări farmacologice (Fig. 5A).

În primul experiment, am testat efectul blocării HDAC1 asupra formării memoriei de extincție durabilă la șoarecii SFC+/Veh și SFC+/MS275. Atât șoarecii SFC+ infuzați cu Veh, cât și cu MS275-, au primit același număr de perechi CS-US în timpul dobândirii fricii sociale (Fig. 5B). Confirmând observațiile noastre anterioare (Figurile 2C și 3C), șoarecii SFC+ infuzați cu MS275 au arătat o investigație socială crescută în timpul expunerii la al 2-lea și al 3-lea stimul social în timpul antrenamentului de stingere a fricii sociale (P <0.05. faţă de SFC+/Veh; Fig. 5C). În consecință, ambele grupuri au arătat niveluri similare de timpi de investigare socială în timpul expunerii la al șaselea stimul social, sugerând extincția cu succes. În ciuda extincției cu succes, în timpul retragerii pe termen lung efectuate la 30 de zile după antrenamentul de extincție, șoarecii SFC+/MS275 au prezentat niveluri semnificativ mai ridicate de investigație socială (P < 0,05 față de SFC+/ Veh; Fig. 5D), demonstrând o memorie îmbunătățită de extincție de lungă durată după Inhibarea HDAC1.

Același experiment a fost efectuat într-un set separat de șoareci SFC+ perfuzați local cu Muc sau Veh (grupe SFC+/Veh și SFC+/Muc). Ambele grupuri au primit perechi similare CS-US care indică o achiziție egală (Fig. 5E) și au prezentat investigații sociale la fel de scăzute în timpul expunerii la primul stimul social în timpul antrenamentului de extincție (Fig. 5F). Cu toate acestea, ca și în experimentul anterior (Fig. 4C), grupul SFC+/Muc a avut o extincție accelerată a fricii sociale (P <0.{05 vs. SFC+/Veh; Fig. 5F). Interesant este că în timpul retragerii pe termen lung în ziua 32, șoarecii SFC+/Muc au prezentat o investigație socială crescută în comparație cu grupul SFC+/Veh (P <0,05 față de SFC+/Veh; Fig. 5G), sugerând că activarea LS-GABA-A, de asemenea are ca rezultat o memorie îmbunătățită de extincție de lungă durată.

DISCUŢIE

Procesele care reglementează trecerea de la memoria pe termen scurt la memoria pe termen lung în contextul comportamentelor legate de frică, în special ale SAD, nu sunt bine înțelese. În acest studiu, folosind paradigma SFC combinată cu abordări farmacologice și virale, descriem un nou mecanism epigenetic mediat de HDAC1 în cadrul LS care reglementează memoria de lungă durată a dispariției fricii sociale la șoarecii masculi. În mod specific, am observat (i) fosforilare crescută a HDAC1 care induce activitate în septul șoarecilor SFC + în timpul dispariției fricii sociale, (ii) reglarea negativă a expresiei fricii sociale de către HDAC1 în LS, (iii) o expresie îmbunătățită a Gabrb1 în sept ca răspuns la combinația dintre inhibarea și extincția HDAC1, (iv) facilitarea dispariției fricii prin activarea receptorului GABA-A și (iv) consolidarea de lungă durată a memoriei extincției după inhibarea farmacologică a HDAC1 sau activarea receptorilor GABA-A în LS .

HDAC-urile de clasa I au fost asociate anterior cu deficite de comportament social [29-31] și învățarea asociativă [16, 17, 20, 32]. Având în vedere această premisă, am testat dinamica proteinei HDAC1 septale în timpul dispariției fricii sociale și am constatat că extincția fricii sociale la șoarecii SFC + a îmbunătățit pHDAC1 și ppHDAC1 (Fig. 1E, F), deși nivelurile de proteină HDAC1 au rămas neschimbate (Fig. 1D). Fosforilările post-translaționale mediate de cazein kinaza 2- ale HDAC1 la ser421 și ser423 sunt cunoscute că își măresc activitatea catalitică (adică, deacetilazei) și asocierea cu complecși represori mari, cum ar fi complexele Sin3A și CoREST [33]. Fosforilarea crescută la aceste locuri a rezultat din dispariția fricii sociale, sugerând că antrenamentul de extincție crește activitatea HDAC1 numai la șoarecii SFC +. Această îmbunătățire nu a fost observată la șoarecii SFC- sau la șoarecii SFC+ care au trecut printr-o extincție prescurtată, sugerând că antrenamentul complet de extincție la șoarecii cu frică socială este esențial pentru ca fosforilarea HDAC1 să fie crescută.

Am dezvăluit în continuare o legătură cauzală între activitatea crescută HDAC1 în LS și frica socială. (i) Blocarea farmacologică a LS-HDAC1 120 min înainte ca stingerea fricii a facilitat stingerea fricii sociale (Fig. 2C). (ii) În schimb, supraexprimarea HDAC1 mediată de AAV în cadrul LS a afectat stingerea fricii sociale (Fig. 2G). După cum sa menționat mai devreme, HDAC1 și alte HDAC de clasa I au fost descrise ca regulatori critici ai memoriei fricii [16]. De exemplu, ocuparea redusă a HDAC3 la promotorul cFos din hipocampul dorsal și amigdala bazolaterală s-a corelat cu formarea contextuală a memoriei fricii fără a afecta frica semnalată [20]. Într-un alt studiu, RGFP963—un inhibitor cu moleculă mică al HDAC-urilor de clasă I—a îmbunătățit consolidarea fricii semnalate [34]. Având în vedere că LS-ul este crucial pentru procesarea indiciilor sociale în timpul formării amintirilor asociative [12], rezultatele noastre sugerează o funcție nouă pentru LS-HDAC1 ca regulator negativ al învățării de extincție a fricii sociale.

Pentru a dezvălui țintele din aval pentru HDAC1, care ar putea media efectul său asupra învățării extincției, am efectuat o matrice PCR pentru genele legate de semnalizarea GABA și glutamat la șoarecii SFC + cu sau fără inhibare HDAC1. Am constatat că expresia Gabrb1 este crescută în țesutul septal al șoarecilor care primesc [37], activarea mediată de Muc a semnalizării GABA-A cu regiunea hipocampală CA1 îmbunătățește stingerea fricii contextuale [38], în timp ce manipularea similară în cortexul prefrontal infralimbic sau amigdala bazolaterală sporește stingerea fricii semnalate [39]. Studiile au arătat că reducerea funcției receptorului GABA-A rezultată din reglarea în jos care sugerează expresia a1 din cauza reducerii acetilării promotorului H3 este mediată de HDAC2 și HDAC3 în condiții de expunere cronică la etanol [40]. Un mecanism similar ar putea sta la baza rezultatului nostru. Astfel, inhibarea HDAC1 poate duce la acetilarea H3 și H4 îmbunătățită și, în consecință, la exprimarea Gabrb1 îmbunătățită și semnalizarea GABA în LS, ceea ce duce la o învățare îmbunătățită a extincției într-un context social. Pentru confirmarea acestei ipoteze, activarea înaintea receptorului LS-GABA-A folosind Muc a facilitat învățarea extincției similar cu efectul observat al inhibării LS-HDAC1 (Fig. 4C). LS este în principal GABAergic și este cunoscut că reglează comportamentele motivate [12]. În plus, LS primește input glutamatergic din regiunile CA2 hipocampale, care codifică memoria socială [41, 42]. Cu toate acestea, aceste intrări glutamatergice au o organizare spațială definită și activează un ansamblu specific de neuroni în LS [12, 43], conducând la efecte comportamentale specifice în aval. În contextul dispariției fricii sociale, astfel de intrări ar putea comunica valența negativă a stimulului social la șoarecii SFC+, provocând astfel evitarea socială și frica socială. Cu toate acestea, o inhibare generală a LS cauzată de semnalizarea GABAergică locală îmbunătățită este probabil să dezinhibeze abordarea socială a învățării sociale.

După cum sa menționat mai devreme, recidiva și recurența SAD la pacienții care au suferit remisie completă sunt foarte mari [44–46]. Astfel, am testat memoria de stingere a fricii pe termen lung după inhibarea LS-HDAC1 sau activarea LS-GABA-A. În mod remarcabil, atât inhibarea HDAC1, cât și activarea receptorului GABA-A în LS au crescut suficient rezistența dispariției fricii sociale și au prevenit reapariția amintirilor sociale aversive, așa cum se găsește în controalele tratate cu vehicul, la 30 de zile după dispariția fricii sociale (Fig. 5D, G) . Aceste date demonstrează că înclinarea accelerată observată în mod acut de inhibarea HDAC1 și activarea receptorului GABA-A a condus la o consolidare mai substanțială a memoriei de extincție, făcând-o foarte durabilă. Acest lucru coroborează ideea că inhibitorii HDAC sunt amplificatori cognitivi eficienți [21, 47]. Se știe că SAD are o prevalență mai mare la femele [48] și am stabilit, de asemenea, paradigma SFC la șoarecii femele [11]. Mai mult, au existat efecte contrastante ale inhibării HDAC asupra cogniției la șoarecii femele, în funcție de subtipul HDAC și de contextul specific examinat [49, 50]. Astfel, s-ar putea lua în considerare studiul mecanismului menționat mai sus la șoarecii femele. Cu toate acestea, această examinare este în afara domeniului de aplicare și ar trebui să fie un studiu de urmărire interesant.

În rezumat, studiul nostru oferă perspective esențiale asupra mecanismelor moleculare implicate în reglarea dispariției fricii sociale și implică faptul că inhibarea mediată de HDAC1-a semnalizării GABAergice în LS este un regulator negativ atât al dispariției fricii sociale acute, cât și pe termen lung în soareci. Din câte știm, acesta este primul studiu care leagă cauzal HDAC1 de reglarea amintirilor sociale aversive. Acest studiu se adaugă la corpul tot mai mare de dovezi care plasează HDAC-urile ca potențiali regulatori ai memoriei asociative și propune în mod specific HDAC1 ca o potențială țintă terapeutică pentru SAD.

REFERINȚE

dsDemyttenaere K, Bruffaerts R, Posada-Villa J, Gasquet I, Kovess V, Lepine JP, et al. Prevalența, severitatea și nevoia nesatisfăcută pentru tratamentul tulburărilor mintale în Sondajele Mondiale de Sănătate Mintală ale Organizației Mondiale a Sănătății. J Am Med Conf. univ. 2004;291:2581–90.

2. Blanco C, Bragdon LB, Schneier FR, Liebowitz MR. Farmacoterapia bazată pe dovezi a tulburării de anxietate socială. Int J Neuropsihofarmacol. 2013;16:235–49.

3. Scholten WD, Batelaan NM, van Balkom AJ, Wjh Penninx B, Smit JH, van Oppen P. Recurrence of anxiety disorders and its predictors. J Afect Disord. 2013;147:180–5.

4. Buton ME. Recuperarea contextului, timpului și memoriei în paradigmele de interferență ale învățării pavloviane. Taur psihic. 1993;114:80–99.

5. Bruce SE, Yonkers KA, Otto MW, Eisen JL, Weisberg RB, Pagano M și colab. Influența comorbidității psihiatrice asupra recuperării și recurenței în tulburarea de anxietate generalizată, fobia socială și tulburarea de panică: un studiu prospectiv pe 12-an. Am J Psihiatrie. 2005;162:1179–87.

6. Boschen MJ, Neumann DL, Waters AM. Recidiva anxietății și fricii tratate cu succes: probleme teoretice și recomandări pentru practica clinică. Aust NZJ Psihiatrie. 2009;43:89–100.

7. Leung HT, Westbrook RF. Recuperarea spontană a răspunsurilor de frică stinsă adâncește stingerea lor: un rol pentru mecanismele de corectare a erorilor. J Exp Psychol Anim Behav Process. 2008;34:461–74.

8. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Condiționarea fricii sociale: un model animal nou și specific pentru a studia tulburarea de anxietate socială. Neuropsihofarmacologie. 2012;37:1433–43.

9. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Condiționarea fricii sociale ca model animal de tulburare de anxietate socială. Curr Protoc Neurosci. 2013;63:9–42.

10. Zoicas I, Slattery DA, Neumann ID. Oxitocina cerebrală în condiționarea fricii sociale și stingerea acesteia: implicarea septului lateral. Neuropsihofarmacologie. 2014;39:3027–35.

11. Menon R, Grund T, Zoicas I, Althammer F, Fiedler D, Biermeier V, et al. Semnalizarea oxitocinei în septul lateral previne teama socială în timpul alăptării. Curr Biol. 2018;28:1066–78.e1066.

12. Menon R, Suss T, Oliveira VEM, Neumann ID, Bludau A. Neurobiology of the lateral septum: regulation of social behavior. Trends Neurosci. 2022;45:27–40. 13. Bludau A, Royer M, Meister G, Neumann ID, Menon R. Reglarea epigenetică a creierului social. Trends Neurosci. 2019;42:471–84.

14. Levenson JM, Sweatt JD. Mecanisme epigenetice în formarea memoriei. Nat Rev Neurosci. 2005;6:108–18.

15. Mahgoub M, Monteggia LM. Un rol pentru histon deacetilaze în mecanismele celulare și comportamentale care stau la baza învățării și memoriei. Învață Mem. 2014;21:564–8.

For more information:1950477648nn@gmail.com