Extractul de Herba Cistanche îmbunătățește starea glutationului mitocondrial și respirația în inimile de șobolan, cu posibila inducere a proteinelor de decuplare

Introducere

Reperfuzia unui miocard ischemic anterior determină o serie de modificări mitocondriale, inclusiv producția crescută de specii reactive de oxigen (ROS), Ca2+supraîncărcare și o scădere a producției de adenozin trifosfat (ATP), toate acestea putând duce la necroză și/sau moarte celulară mediată de apoptoză (Redegeld și colab., 1992; Lemasters și colab., 1998). Deoarece mitocondriile joacă un rol crucial în determÎn ceea ce privește soarta cardiomiocitelor în urma unei provocări de ischemie/reperfuzie (I/R), protecția împotriva leziunilor miocardice I/R ar trebui, prin urmare, să fie orientată spre păstrarea integrității structurale și funcționale mitocondriale. Menținerea metabolismului energetic mitocondrial după provocarea I/R este deosebit de importantă, deoarece funcția contractilă a inimii este aproape în întregime dependentă de ATP generat de mitocondrii. Cardiomiocitele care sunt în viață, dar care nu se contractă sunt de foarte puțină folos.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎNȚOIREA IMUNITĂȚII PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, întreaga plantă uscată deCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), este o plantă parazită care crește în principal în zonele deșertice din nordul și nord-estul Chinei. Herba Cistanche, clasificată drept o plantă „învigorătoare Yang” în medicina chineză, este prescrisă pentru deficiența rinichilor, sterilitatea feminină și constipația care rezultă din uscăciunea intestinului la pacienții senili (Chen, 1998). Studiile anterioare din laboratorul nostru au arătat că un metanolextract de Herba Cistanchecrește capacitatea miocardică de generare a ATP (Leung & Ko, 2008) și protejează împotriva leziunilor miocardice I/R la șobolani (Leung, 2006). În timp ce stimularea capacității de generare a ATP a fost paralelă cu îmbunătățirea transportului de electroni mitocondriali (Leung & Ko, 2008), cardioprotecția împotriva leziunilor I/R oferite de tratamentul cu Herba Cistanche a fost asociată cu o scădere a epuizării ATP miocardice (Leung, 2006). În studiul de față, pentru a defini rolul mitocondriilor în acțiunea cardioprotectoare a Herba Cistanche, am investigat efectul tratamentului cu Herba Cistanche asupra statusului de glutation mitocondrial, conținutului de Ca2+, potențialului de membrană și ratei respirației, în inimile de șobolan. .

Materiale și metode

Material pe bază de plante

Herba Cistanche a fost achiziționat de la un dealer local (din Hong Kong) de plante medicinale (Lee Hoong Kee). Planta a fost autentificată de furnizor și un exemplar de voucher (HKUST00301) a fost depus în Departamentul de Biochimie, Universitatea de Știință și Tehnologie din Hong Kong (HKUST). Extracția plantei cu metanol a fost efectuată, pe baza unor studii anterioare care indică faptul că un astfel de extract a îmbunătățit generarea de ATP mitocondrial și a protejat împotriva leziunilor I/R în inimile de șobolan (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Pe scurt, Herba Cistanche (400 g) a fost tăiată în bucăți mici și extrasă prin încălzire la reflux în 300 ml de metanol la 60 de grade timp de 2 ore, așa cum s-a descris anterior (Leung & Ko, 2008). Procedura s-a repetat de două ori. Extractul reunit a fost uscat prin evaporarea solventului sub presiune redusă; randamentul a fost de 42% (g/g) referitor la cantitatea de plantă brută. Extractul a fost păstrat la 4 grade până la utilizare. Deși ierburile chinezești sunt în mod tradițional extrase cu apă pentru consumul oral, metanolul a fost folosit în studiul nostru anterior pentru comoditate în procesarea și depozitarea probelor (Yim & Ko, 2002) și am constatat că extracția cu metanol este satisfăcătoare din toate punctele de vedere.

Îngrijirea animalelor și tratamentul medicamentos

Femelele adulte de șobolan Sprague-Dawley (8-10 săptămâni; 200-230 g) au fost găzduite într-o cameră cu umiditate controlată, cu un ciclu de întuneric/lumină de 12 ore, la aproximativ 22 de grade, și au permis hrană și apă ad libitum. Animalele au fost repartizate aleatoriu în diferite grupuri, cu cinci animale în fiecare grup. Șobolanii au primitExtract de Herba Cistancheintragastric ({{0}},2 g/mL în apă) la 0,5 g/kg sau 1,0 g/kg timp de 3 zile consecutiv. Animalele de control (netratate) au primit doar apă. La douăzeci și patru de ore după ultima dozare, țesut ventricular cardiac a fost obținut de la animale anesteziate pentru analiză biochimică. Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul de practică de cercetare, HKUST.

Prepararea fracțiilor mitocondriale

Țesuturile ventriculare ale inimii tocate (~{{0}},6 g) au fost omogenizate într-un exces de 10-ori (g/v) de tampon zaharoză rece ca gheața [0,32 M zaharoză, 1 mM acid etilendiamin tetraacetic (EDTA), 50 mM Tris/HCI; pH 7,4] folosind un omogenizator de teflon-sticlă, la 4000 rpm, cu 25–30 de curse. Pelete mitocondriale au fost preparate din omogenate de țesut prin centrifugare la 800 x g la 4 grade timp de 30 de minute, iar puritatea a fost determinată prin măsurarea activităților specifice relative ale succinat dehidrogenazei și lactat dehidrogenazei în supernatant și, respectiv, peletă, așa cum s-a descris anterior (Evans, 1992). Peletele mitocondriale au fost suspendate în 1 ml de tampon de omogenizare.

Măsurarea nivelurilor mitocondriale de glutation redus și glutation oxidat

Nivelurile mitocondriale reduse de glutation (GSH) au fost determinate enzimatic folosind 5,59-ditiobis(2- acid nitrobenzoic) (DTNB) și glutation reductază (GR), într-un protocol modificat de Griffith (198{{17} }). O alicotă (210 µL) din fracția mitocondrială a fost amestecată cu 90 µL de 10% (v/v) 5-acid sulfosalicilic (SSA) și amestecul a fost centrifugat la 600 x g timp de 10 minute. Pentru a măsura nivelurile de glutation oxidat (GSSG), s-au amestecat cantități de 100 µL de supernatanți SSA cu 10 µL de 20% (g/v) 2-vinilpiridină și 10 µL 60% (v/v) trietanolamină în tuburi de microcentrifugă. Fiecare tub a fost lăsat să stea la temperatura camerei timp de cel puțin 1 oră. Un amestec de reacție care conține 0,63 mM DTNB și 0,053 mM NADPH (fosfat redus de nicotinamidă adenin dinucleotidă) în tampon fosfat (0,1 M, cu 5 mM Na2 EDTA; pH 7,5) a fost preincubat la 30 de grade timp de 2 minute. O alicotă (30 µL) fie dintr-un supernatant de probă SSA (glutation total), fie dintr-o probă GSSG a fost adăugată într-un godeu al unei plăci de microtitrare 96-godeuri și 180 µL de amestec de reacție preîncălzit, care conține 0,525U/ mL GR, a fost adăugat în continuare. Modificările de absorbție la 412 nm au fost monitorizate spectrofotometric timp de 5 minute. Concentrațiile de GSH și GSSG au fost estimate din curbele de calibrare folosind GSH și GSSG [dizolvate în 3% (g/v) SSA] ca standarde și exprimate ca nmol/mg proteină. Nivelurile de GSH au fost estimate scăzând de două ori cantitatea de GSSG din cea a GSH total.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Măsurarea conținutului de Ca2+ mitocondrial

Conținutul de Ca{{{0}} mitocondrial a fost măsurat utilizând o sondă de fluorescență sensibilă la Ca{{-5, ester fluo{-5N AM (Molecular Probes, Eugene, OR) utilizând Victor2 Multi-Label Counter (Modelul 1420; PerkinElmer, Turku, Finlanda), așa cum este descris în Menze și colab. (2005). Constantele de disociere Ca2+ (valorile Kd) au fost determinate folosind un kit de calibrare Ca{2+ valabil în intervalul de concentrație 1–1000 µM; valorile estimate ale Kd au fost de 90–100 µM, cu fiabilitate ridicată, conform datelor producătorului trusei. O alicotă (25 ui) din fracția mitocondrială (0,5 mg proteină/ml concentrație finală) a fost amestecată cu 25 ui tampon de incubare {100 mM KCI și 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propansulfonic acid]; pH7,2} într-o placă de microtitrare neagră cu 96-godeuri. Amestecul a fost incubat la 25 de grade timp de 15 minute; S-au adăugat apoi 25 uL digitonină (50 ug/mL) și 25 uL ester fluo-5N AM (1 uM în 0,005% (g/v) Pluronic F-127). Prin facilitarea pătrunderii membranei, digitonina a mediat intrarea mitocondrială a colorantului fluorescent. Am descoperit că nivelurile de fluo-5N din preparatele mitocondriale ale inimii de șobolan au fost crescute de 20-ori în prezența digitoninei. Amestecuri de reacție au fost incubate la 25 de grade timp de 30 de minute, iar citirile de fluorescență au fost măsurate la o lungime de undă de excitare de 488 nm și o lungime de undă de emisie de 532 nm. Conținutul de Ca2+ mitocondrial a fost estimat utilizând o curbă de calibrare și exprimat ca µmol/mg proteină.

Măsurarea potențialului membranei mitocondriale

Potențialul de membrană (ΔΨm) a fost evaluat printr-o metodă modificată față de cea a lui Bonavita și colab. (2003), folosind un colorant fluorescent, sonda cationică lipofilă 5.596,69-tetraclor{-1,193,39-iodură de tetraetilbenzimidazolilcarbocianină, denumită în mod obișnuit JC-1. Alicote (50 µL) de fracții mitocondriale (ajustate la 1 mg proteină/mL) au fost incubate la 37 de grade cu 50 µL de soluție de substrat (conținând 6 mM piruvat și 6 mM malat), 25 µL de soluție de adenozin difosfat (ADP) pretratată (30mM), și 25 µL de 3 µM JC-1, în întuneric. Valorile ΔΨm au fost obținute prin măsurarea fluorescenței la 535 nm (FL1) față de 580 nm (FL2), folosind Victor2 MultiLabel Counter. JC-1 formează agregate în mitocondrii, rezultând valori ridicate de fluorescență FL2 și indicând un potențial mitocondrial normal. Pierderea ΔΨm duce la o reducere a fluorescenței FL2 (agregate JC-1 într-o măsură mai mică) și o creștere concomitentă a fluorescenței FL1 (de la monomerii JC-1). Datele au fost exprimate ca rapoarte ale valorilor fluorescenței FL1/FL2. Cianură de carbonil m-clorofenilhidrazona (CCCP), un agent de colaps ΔΨm, a fost utilizată pentru a valida testul.

Măsurarea respirației mitocondriale

Rata respirației mitocondriale a fost măsurată la 37 de grade folosind un instrument Hansatech Oxygraph-Plus echipat cu un electrod de oxigen de tip Clark (Sarasota, FL, SUA). Fracțiile mitocondriale (0,6 mg proteină/mL) au fost suspendate în tampon de respirație care conține 125 mM KCI, 20mM MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM acid etilenglicol tetraacetic (EGTA) și 2 mM KH2PO4; pH 7,2. După incubare la 37 de grade timp de 2 minute, fiecare probă a primit 50 uL soluție de substrat (5 mM piruvat și 5 mM malat). Ratele de respirație au fost măsurate în prezența (Starea 3) a 1 mM ADP și după fosforilarea întregului ADP la ATP (Starea 4). Raportul ratelor de respirație Star 3:State 4 este indicele de control respirator, care indică etanșeitatea cuplării dintre respirație și fosforilare (Javadov și colab., 2005; Kuwabara și colab., 1997). Înainte de adăugarea soluției de substrat, rata de respirație în starea 1 a fost măsurată până la începutul respirației în starea 2, iar rata de respirație în starea 2 a fost estimată înainte de adăugarea de ADP.

analize statistice

Datele au fost analizate prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) pentru comparații cu mai multe grupuri. Valorile diferențelor cele mai puțin semnificative (LSD) au fost utilizate pentru a identifica diferențele semnificative între cele două grupuri atunci când valorile p au fost < 0.05.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultate

După cum se arată în figurile 1 și 2, tratarea cu un metanolextract de Herba Cistanche({{0}},5 sau 1,0 g/kg/zi×3) a îmbunătățit semnificativ starea glutationului mitocondrial în inimile de șobolan, așa cum este demonstrat de creșterile dependente de doză ale nivelurilor de GSH (11–30%) și scăderea Niveluri GSSG (31%).

Tratamentul cu Herba Cistanche a scăzut în funcție de doză nivelurile mitocondriale de Ca2+ în inimile de șobolan, comparativ cu martorii; suprimarea a fost de 41% la o doză de 1,0 g/kg (Figura 3).

Tratamentul cu Herba Cistanche a crescut ΔΨm mitocondrial, așa cum este demonstrat de o scădere (14-16%) a raportului FL1/FL2. CCCP (100 uM) a provocat colapsul ΔΨm, așa cum este indicat de o creștere a raportului FL1/FL2 (Figura 4).

Tratament cu Herba Cistancherespirație mitocondrială îmbunătățită, așa cum este evidențiată de o rată semnificativ mai mare a respirației în starea 3 (84%) la animalele de testare în comparație cu martorii (Tabelul 1). Nivelurile de respirație în starea 2 și 4 au fost crescute cu 47 și, respectiv, 80%, dar stimularea respirației în starea 4 a fost complet suprimată de guanozin-5'-difosfat 1 mM, un inhibitor al proteinei de decuplare 2/3. Tratamentul cu Herba Cistanche nu a afectat indicele de control respirator, estimat prin raportul ratelor de respirație Starea 3/Starea 4.

Discuţie

Mitocondriile izolate din inimile de șobolan tratate cu Herba Cistanche au prezentat o stare îmbunătățită a glutationului, așa cum este indicat de nivelurile crescute de GSH și nivelurile scăzute de GSSG. Menținerea stării redox a glutationului mitocondrial este esențială pentru cardioprotecția împotriva leziunilor I/R (Chiu & Ko, 2003). Conținutul de Ca2+ citosolic crește în timpul ischemiei miocardice, prin absorbția de către uniporterul de Ca2+ din membrana internă (Ataka și colab., 1992; Grover și colab., 1990), conducând la Ca{{6} mitocondrial } acumulare. Rezultatele noastre indică faptul că tratamentul cu extract de Herba Cistanche a îmbunătățit starea redox a glutationului mitocondrial și a scăzut nivelul mitocondrial de Ca2+, ceea ce poate oferi protecție împotriva leziunilor miocardice I/R (Leung, 2006). Incapacitatea tratamentului cu Herba Cistanche, la o doză mai mare de 1,0 g/kg, de a scădea în continuare nivelurile de GSSG și Ca2+, poate fi legată de existența unui mecanism de reglare autolimitat care afectează potențialul redox al glutationului și starea calciului. în mitocondrii.

Mitocondriile generează un gradient electrochimic de protoni de-a lungul membranei interioare, prin transportul de electroni. Acest gradient este utilizat de ATP sintaza pentru a fosforilează ADP în ATP. Scăderea potențialului membranei mitocondriale, ca în hipoxie/reoxigenare după lezarea cardiomiocitelor cultivate (Chiu și colab., 2008), are ca rezultat o reducere a generării de ATP. Tratamentul cu Herba Cistanche, care poate crește potențialul membranei mitocondriale miocardice, poate crește generarea de ATP, în special în timpul reperfuziei post-ischemice. Din nou, existența unui mecanism de reglare autolimitat poate explica de ce efectele tratamentului cu Herba Cistanche asupra potențialului membranei mitocondriale nu sunt dependente de doză.

Tratamentul cu Herba Cistanche a crescut foarte mult rata de respirație în starea 3 în mitocondriile inimii de șobolan, după cum este evaluată prin consumul de oxigen. Această constatare este în concordanță cu rezultatele obținute din măsurători in vitro și situ ale capacității de generare a ATP mitocondrial (Leung & Ko, 2008). În mod intrigant, deși tratamentul cu Herba Cistanche a redus nivelul la starea de echilibru al ATP miocardic (datele nu sunt prezentate), tratamentul a îmbunătățit generarea de ATP mitocondrial. Implicarea respirației decuplate poate explica aceste observații discrepante. Fosforilarea oxidativă necuplată are loc atunci când protonii sunt mutați prin membrana interioară mitocondrială înapoi în matricea mitocondrială, disipând astfel potențialul de membrană format de lanțul de transport de electroni. Acest lucru are ca rezultat o reducere a forței motrice de protoni care conduce la formarea ATP (Garvey, 2003). În consecință, concentrația de Ca2+ și producția de ROS în mitocondrii sunt atenuate dramatic (Teshima și colab., 2003). Această sugestie este în concordanță cu rezultatele studiului de față, care a arătat o scădere a nivelurilor mitocondriale de Ca2+ în inimile tratate cu Herba Cistanche. În ceea ce privește respirația decuplată, sinteza proteinelor de decuplare (UCP) poate fi indusă prin tratamentul cu Herba Cistanche. Se știe că UCP-urile decuplează fosforilarea oxidativă și expresia UCP1 în inimile de șoareci transgenici protejate împotriva leziunilor miocardice induse de I/R (Hoerter și colab., 2004). Efectul de decuplare al UCP-urilor a fost inhibat de difosfații și trifosfații de nucleotide purinice (cum ar fi ADP, ATP, guanozin difosfat (GDP) și GTP) (Echtay și colab., 2002). În studiul de față, parametrii mitocondriali, cum ar fi potențialul membranei și rata de respirație, au fost măsurați în prezența ADP (ca substrat); efectul de decuplare al UCP-urilor a fost prin urmare inhibat. Cu toate acestea, atunci când rata de respirație mitocondrială în starea 4 a fost măsurată în absența ADP, această rată a fost mai mare în mitocondriile preparate din inimile tratate cu Herba Cistanche decât în ​​inimile martorilor netratate. Rata de respirație în starea 4 reflectă consumul de oxigen de către mitocondrii atunci când protonii se scurg înapoi în matricea mitocondrială printr-un mecanism care nu implică F1 F0 -ATPaza (Garvey, 2003). Posibila implicare a UCP-urilor în creșterea indusă de Herba Cistanche a respirației în starea 4 este susținută de constatarea că această îmbunătățire a fost suprimată de PIB (Bento și colab., 2007).

În concluzie, tratamentul cu Herba Cistanche poate îmbunătăți starea glutationului mitocondrial, poate scădea nivelul mitocondrial de Ca2+ și poate crește potențialul membranei mitocondriale și rata de respirație la inimile de șobolan. Îmbunătățirea statusului glutationului mitocondrial și a capacității funcționale, precum și inducerea presupusă a UCP, pot fi legate de cardioprotecția oferită deTratament cu Herba Cistanchedupă leziuni I/R.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA PLANT CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%