Iată o versiune mai concisă a titlului: Determinarea simultană a șase componente în Cistanche Tubulosa prin spectroscopie în infraroșu apropiat

1. Introducere

Cistanche (Hoffmg. Et Link) este un gen fanerogamic peren din familia de plante Orobanchaceae. Majoritatea speciilor aparținând genului Cistanche au fost folosite ca plantă medicinală de milenii în China; au reputația de tonic superior; și sunt cunoscute sub numele de „Ginsengul deșerților”. Cistanche tubulosa este un parazit obligatoriu al rădăcinilor plantei perene Tamarix chinensis. A fost documentat în Farmacopeea Chineză ca sursă autentică aCistanches Herba(nume chinezesc: Roucongrong) din ediția din 2005. Cercetările farmacologice moderne asupra speciilor Cistanche au fost inițiate în anii 1980. Investigațiile farmacologice au arătat că extractele de plante Cistanche posedă un spectru larg de activități, precum vindecarea deficienței renale și a constipației senile, avansarea capacității de învățare și memorare, anti-boala Alzheimer, creșterea imunității, anti-îmbătrânire, anti-oboseală etc. În ultimele trei decenii, studiile farmacologice cuprinzătoare și sistematice au fost combinate cu investigații fitochimice pentru a lumina baza materială a efectelor benefice ale rădăcinilor plantelor Cistanche. Aceste studii indică faptul că glicozidele feniletanoide (PhG) au fost principalele componente eficiente în plantele Cistanche, jucând roluri cheie în tratamentul deficienței renale, impotenței, anti-îmbătrânire și anti-Alzheimer. Conținutul a două PhG (echinacozidă și verbascozidă) a fost cerut în Farmacopeea Chineză. Între timp, carbohidrații precum manitolul, zaharoza, glucoza și fructoza din plantele Cistanche dețin funcția laxativă și grupurile de carbohidrați alePlante de Cistancheau fost utilizate pentru tratamentul constipației.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU MĂSTRĂREA TESTOSTERONULUI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Resursele sălbatice ale C. tubulosa sunt distribuite în principal în zona din jurul deșertului Taklamakan din sudul Regiunii Autonome Xinjiang din China. Similar cu multe alte specii folosite ca medicamente tradiționale chinezești (MTC), C. tubulosa are o mare valoare economică și este aproape dispărută în habitatul său sălbatic din cauza colectării excesive. Cultivarea C. tubulosa a început în anii 1990 în China pentru a asigura aprovizionarea cu materii prime pentru Cistanches Herba, precum și pentru a proteja resursele de plante sălbatice. Începând cu 2017, în prefectura Hotan din Xinjiang există aproape 13 mii ha de C. tubulosa cultivate. Sunt necesare progrese în tehnologia de plantare pentru extinderea culturii, precum și pentru îmbunătățirea calității C. tubulosa.

Scopul principal al cultivării C. tubulosa este producerea de Cistanches Herba, fiind bogată în acele componente eficiente. Cu toate acestea, conținutul componentelor eficiente înCistanches Herba, cum ar fi PhG și oligozaharide, pot fi afectate semnificativ de mulți factori în timpul producției. Ar trebui explorat un sistem de detectare în timp real a calității C. tubulosa. Prin urmare, este necesar să se dezvolte o metodă cu randament ridicat pentru a îndeplini cerința de a analiza un număr mare de probe într-o perioadă scurtă. În mod tradițional, determinarea acelor componente eficiente primare, cum ar fi PhG și carbohidrați, în C. tubulosa a fost de obicei realizată folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Deși este precis și fiabil, este consumator de timp și laborios pentru colectarea și procesarea datelor. În plus, este nevoie de mult timp și efort pentru prepararea probei care implică de obicei pulverizarea, extracția și filtrarea testelor HPLC. Prin urmare, sunt necesare un principiu clar și un instrument ușor de utilizat pentru a obține o cantitate relativ mare de date. Din fericire, spectroscopia în infraroșu apropiat (NIRS) a fost utilizată pe scară largă pentru a evalua produsele agricole, alimentele, probele medicale și produsele farmaceutice, deoarece este rapidă și nedistructivă. Prin urmare, NIRS ar putea să corespundă exact cerințelor pentru măsurători eficiente ale TCM-urilor și, fără a fi surprinzător, NIRS a fost aplicat pentru identificarea calitativă și cuantificarea compușilor în TCM.

În acest studiu, conținutul a șase componente eficiente, inclusivechinacozidă, verbascozidă, manitol, zaharoză, glucoză și fructozăîn 116 loturi de probe de C. tubulosa care au fost colectate de la prefectura Hotan din Xinjiang în 2013–2015 au fost pentru prima dată determinate prin HPLC. Ulterior, modelele de calibrare ale acestor șase componente au fost stabilite cu metoda de regresie parțială a celor mai mici pătrate (PLSR). Aceste modele au fost apoi validate cu coeficienții de corelație și erorile de predicție din seturile de calibrare. Rezultatele au demonstrat că metoda dezvoltată ar putea fi folosită ca metodă fiabilă pentru analiza cantitativă a C. tubulosa.

2. Rezultate

2.1. Analiza HPLC

Conținutul deechinacozid și verbascozidau fost determinați printr-o metodă HPLC-UV bine definită în literatură și patru carbohidrați (manitol, zaharoză, glucoză și fructoză) au fost determinați printr-o metodă HPLC-ELSD bine definită în literatură pentru toate cele 116 probe. Metodele de preparare și determinare a probelor au fost descrise în secțiunile 3.1 și 3.3. Figura 1 prezintă cromatogramele caracteristice ale standardelor mixte. Se poate observa că toate cele șase componente eficiente au fost separate de referință și, prin urmare, au putut fi cuantificate. Metoda HPLC a fost validată înainte de testarea probei. Principalele rezultate ale metodei HPLC sunt enumerate în tabelul 1. O relație liniară favorabilă (r=0.9998) și recuperarea (98,5%) a metodei de determinare a echinacozidelor sunt prezentate în rezultate, același rezultat ca toate cele cinci componente. Prin urmare, conținutul celor șase componente eficiente poate fi determinat cu precizie. Toate intervalele de conținut determinate sunt rezumate în Tabelul 1.

2.2. Analiza NIRS

Figura 2 prezintă spectrele NIR (4000–10,{000 cm-1) ale probelor de C. tubulosa. Au apărut vârfuri semnificative de absorbție de la 4000 cm-1 la 7500 cm-1 în toate probele, în timp ce au apărut fluctuații ușoare de la 7500 cm-1 la 10.000 cm-1. Deviația de bază a spectrelor NIR a avut loc deoarece proba a fost ușor afectată de factori precum dimensiunea particulelor și culoarea (Figura 2A). Pretratările matematice ale spectrelor au fost folosite pentru a reduce într-o oarecare măsură influența informațiilor inutile. Pretratările matematice au inclus prima derivație (prima derivație), a doua derivație (a doua derivație), varietate normală standard (SNV) și corecție multiplicativă a dispersiei (MSC). Figura 2B prezintă a doua derivație a spectrelor NIR ale C. tubulosa și se observă variațiile semnificative care au apărut din trei regiuni, 4000–4500 cm-1, 5000-5500 cm-1 și 7000-7500 cm-1.

2.3. Stabilirea Modelelor Cantitative de Calibrare

Regresia parțială a celor mai mici pătrate (PLSR) este o metodă clasică de modelare și a fost aplicată pe scară largă în modelele cantitative datorită calității înalte a rezultatelor. Avantajele PLSR includ capacitatea sa bună de prognoză și simplitatea relativă. PLSR a fost, de asemenea, aplicat pe scară largă în stabilirea modelelor de calibrare cantitativă a TCM [25]. Pe baza spectrelor NIR pretratate, a fost stabilit un model de analiză cantitativă NIR pentru cele șase componente eficiente din C. tubulosa folosind metoda PLSR cu datele de analiză HPLC ca valori adevărate. Cele 116 probe au fost împărțite aleatoriu în seturi de calibrare și validare cu un raport de 3:1. Condițiile cele mai potrivite pentru calibrare au fost alese prin RMSEC scăzut și coeficient de corelație ridicat.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Selectarea benzii de undă pentru modelele de calibrare

Selectarea unei benzi de undă adecvată a fost un pas important pentru construirea modelului de calibrare. În acest studiu, au fost comparate spectrele intervalului NIR de 4000-7500 cm-1 (recomandat de software-ul analist TQ) și 4{000-10.000 cm-1. S-a observat că acest interval este nepotrivit pentru calibrarea la intervalul dintre 4000 cm−1 și 7500 cm−1 din tabelul 2. Prin urmare, în studiul actual, intervalele spectrale pentru cei șase constituenți chimici au fost toate selectate din intervalul de la 4000 până la 10.000 cm−1 prin compararea performanțelor RMSEC și a coeficientului de corelație.

2.3.2. Selectarea numărului optim de factori pentru modelele de calibrare

PLSR explică cantitatea maximă de variabilitate a datelor prin reducerea dimensionalității datelor spectrului prin calculul factorilor. Problema „deficitării insuficiente” a apărut din cauza informațiilor insuficiente care a rezultat dintr-un număr limitat de factori; cu toate acestea, alegerea factorilor mai mari decât valorile optime introduse în model va duce la problema „supraadaptarii”. Fie „subadaptarea”, fie „supraadaptarea” va reduce puterea predictivă a modelelor stabilite [22]. Figura 3 arată relația dintre RMSECV și factori pentru toți cei șase compuși. Prin urmare, am selectat acei factori corespunzători celor mai mici valori ale RMSECV. Selecția optimă a factorilor pentru modelele de calibrare este listată în Tabelul 3.

2.3.3. Selectarea pretratării spectrale pentru modelele de calibrare

Un alt factor de influență esențial pentru modelele de calibrare este pretratarea spectrală, care are ca scop reducerea influenței împrăștierii și a deplasării liniei de bază, îmbunătățirea raporturilor semnal-zgomot și eliminarea variațiilor neregulate. Pentru a elimina influența împrăștierii radiațiilor, s-au folosit metode de corecție multiplicativă a împrăștierii (MSC) și standard standard variate (SNV). Pentru a rezolva efectele derivei liniei de bază, s-au comparat spectrele derivate 1 și 2 și s-a selectat derivația a 2-a. Pentru efectul dorit, am netezit spectrele cu algoritmul de filtru Savitzky-Golay (SG) înainte de derivare pentru a preveni mărirea zgomotului. Tabelul 3 prezintă informațiile despre pretratarea spectrală și rezultatele acesteia pentru modelele de calibrare.

2.4. Evaluarea modelelor stabilite

Un model de calibrare NIRS bun ar trebui să aibă valori RMSEC și RMSEP scăzute, precum și un coeficient de corelație ridicat (r) și diferențe mici între RMSEC și RMSEP. Modelele de calibrare ale celor șase compuși selectați au fost stabilite conform procedurilor menționate mai sus (Tabelul 3). Valorile RMSEC și r pentru setul de calibrare al echinacozidului au fost 27,6 și, respectiv, 0,9808. Parametrii de performanță ai altor modele de compuși chimici sunt enumerați în Tabelul 3, din care putem concluziona că modelele stabilite rezultă rezultate de predicție satisfăcătoare și pot fi utilizate pentru analiza cantitativă rapidă a C. tubulosa. Diagramele de dispersie ale celor șase compuși chimici sunt prezentate în Figura 4 pentru a face modelele de calibrare mai descriptive și observate vizual. După cum se arată în Figura 4, au apărut diferențe minore între valorile predictive și măsurate, deoarece majoritatea punctelor au fost distribuite în jurul curbei regresive cu o ecuație ca y=x. Prin urmare, în Figura 4 au fost observate performanțe predictive excelente.

3. Materiale și Metode

3.1. Pregătirea probei

O sută șaisprezece probe de C. tubulosa au fost colectate de la prefectura Hotan din regiunea autonomă Xinjiang din 2013 până în 2015. Toate probele au fost cultivate, dar au fost colectate în diferite stadii de creștere. Greutatea proaspătă a probelor a variat între 20 g și 1000 g. După uscarea la soare, probele uscate au fost zdrobite și cernute printr-o sită cu plasă 60-.

3.2. Colectarea datelor spectroscopice NIR

Spectrele NIR ale probelor au fost colectate la un interval de 8 cm−1 pe regiunea spectrală de 4000-10.000 cm−1 cu un sistem Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, SUA) echipat cu un adaptor de reflexie pentru fibră optică de mână. Fiecare spectru a fost obținut prin media a 64 de scanări. Toate probele au fost lăsate să se echilibreze la temperatura camerei (25 ◦ C) înainte de scanarea spectrelor NIR pentru a se asigura că probele au fost analizate la aceeași temperatură. Umiditatea din laborator a fost menținută la un nivel ambiental.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI RINCHILOR PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. Colectarea datelor HPLC

3.3.1. Pregătirea pentru extracție

Un gram de pulbere de C. tubulosa a fost extras cu 50 mL de metanol 50% într-un balon conic cu ultrasunete (500 W, 40 KHz) timp de 30 min. Extractul a fost depozitat la 4 ◦C. Supernatantul extractului a fost filtrat pentru a obține o probă pentru analiza HPLC.

3.3.2. Determinarea simultană a echinacozidei și verbascozidei cu HPLC-UV

Analiza cromatografică lichidă a fost efectuată pe un sistem Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonia) format din două unități de livrare a solvenților LC-20ADXR, o pompă LC-20AD, o SIL-20ACXR auto un prelevator de mostre, un cuptor cu coloană CTO-20AC, un detector DAD SPD-M20A, un degazator DGU-20A3R și un controler CBM-20.

O coloană Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) utilizată pentru separările cromatografice a fost menținută la 35 ◦C. Faza mobilă a constat din acetonitril (A) și 0.1% acid formic apos (B) și a fost livrată urmând programul de gradient după cum urmează: 0–7 min, gradient liniar de 10–20% O; 7–15 min, 20% A; și 15–20 min, gradient liniar de 20–10% A. Debitul fazei mobile a fost de 0,4 mL/min. Monitorizarea UV a fost efectuată la 330 nm.

3.3.3. Determinarea simultană a manitolului, zaharozei, glucozei și fructozei cu HPLC-ELSD

HPLC a fost efectuată pe un sistem LC Agilent seria 1100 (Palo Alto, CA, SUA) constând dintr-un degazor G1322A, o pompă cuaternară G1311A, un autosampler G1311A, un controler de temperatură pe coloană G1316A și un detector DAD G1315B.

O coloană Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) a fost folosită pentru separări cromatografice și menținută la o temperatură a coloanei de 25 °C. Faza mobilă a fost compusă din acetonitril și apă (77:23, v/v) și un aliat izocratic furnizat la un debit de 0,7 ml/min. Efluentul a fost monitorizat folosind un detector de împrăștiere a luminii prin evaporare (ELSD) cu parametri impliciti.

3.4. Prelucrarea datelor

TQ Analyst (versiunea 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, SUA) a fost utilizat pentru a efectua împărțirea seturilor de calibrare și validare, pretratarea matematică a spectrelor, stabilirea modelelor de calibrare și alte calcule . Origin (versiunea 9.1) a fost folosită pentru realizarea figurilor.

4. Concluzii

În acest studiu, am propus o metodă rapidă și nedistructivă pentru analiza simultană aechinacozidă, verbascozidă, manitol, zaharoză, glucoză și fructozăîn C. tubulosa de către NIRS. Analizele valorilor RMSEC, coeficientului de corelație, RMSEP și Rp au demonstrat că modelele NIR cantitative stabilite ar putea fi utilizate pentru a prezice cu precizie conținutul celor șase componente eficiente selectate în C. tubulosa. În comparație cu HPLC, metoda NIRS raportată în acest studiu poate economisi timp și muncă semnificativă, menținând în același timp capacitatea de analiză cantitativă satisfăcătoare. Prin urmare, metoda raportată aici are potențialul de a fi utilizată în controlul calității C. tubulosa și, astfel, de a ghida dezvoltarea tehnologiei de cultivare și proces pentru C. tubulosa.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU ÎMBUNĂTĂŢIREA FUNCŢIEI SEXUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%