Cauza bolii cronice de rinichi (CKD) - Anemia

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

PARTEA Ⅰ: Boala renală cronică proteinurică este asociată cu durata de viață modificată a celulelor roșii din sânge, deformabilitate și metabolism

Rosi Bissinger, Travis Nemkov și colab.

Dezvoltareaanemieeste o complicație tipică a avansatboală cronică de rinichi(CKD) și este asociată cu o calitate deteriorată a vieții¹și risc crescut de evenimente cardiovasculare²si spitalizare,³precum şi declinul cognitiv.⁴Severitateaanemiea fost privit ca un predictor independent al mortalității atât în ​​CKD dependentă de dializă, cât și în cazul non-dializă (boală cronică de rinichi) pacienţi.⁵Fiziopatologia bolii renale asociateanemieeste complex și implică deficit de fier și eritropoietină (EPO) în cadrul unei inflamații de grad scăzut, care, la rândul lor, compromit eritropoieza normală în CKD (boală cronică de rinichi) pacienţi.⁶În BRC avansat (boală cronică de rinichi), răspunsul EPO este inadecvat de scăzut în raport cu gradul deanemie.^7,8 Prevalența ridicată a deficitului de fier concomitent în CKD (boală cronică de rinichi) este o consecință a perturbării homeostaziei fierului.⁹ Un mecanism neglijat al pierderii de fier în CKD (boală cronică de rinichi) este proteinuria, care poate duce la pierderi urinare de fier legat de transferină (până la 0,3 mg/zi) atunci când proteinuria atinge intervalul nefrotic.¹⁰Un alt factor la care se crede că contribuieanemieîn CKD (boală cronică de rinichi) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >acum 60 de ani.^6,11,12

Beneficiul Cistanche: tratarea bolilor renale și îmbunătățirea funcției renale

Un studiu recent folosind un test de respirație cu monoxid de carbon a demonstrat că durata de viață a RBC a scăzut progresiv de la 120 de zile la pacienții cu IRC în stadiul 1 (boală cronică de rinichi) până la 60 de zile la pacienții cu BRC în stadiul 5 (boală cronică de rinichi).¹³ În special, transfuzia de RBC alogene de la donatori sănătoși la CKD (boală cronică de rinichi) pacienții a fost urmată de eliminarea rapidă a eritrocitelor transfuzate fără dovezi de hemoliză.¹²Un mecanism plauzibil pentru această observație poate fi stimularea morții celulare asemănătoare apoptozei în eritrocite anucleate, denotă un model de leziune în care integritatea membranei celulare nu este compromisă și conținutul citoplasmatic rămâne intact.¹⁴RBC care suferă moartea celulară prezintă diverse modificări morfologice care rezultă din leziuni citoscheletice, cum ar fi formarea de bule de suprafață, pierderea elasticității membranei și/sau deshidratarea celulară.¹⁵La nivel molecular, moartea RBC este asociată cu acumularea intracelulară de Ca2+, starea de energie celulară alterată și defalcarea asimetriei fosfolipidelor, ducând în cele din urmă la exteriorizarea fosfatidilserinei (PS) pe membrana plasmatică exterioară.^15,16Ca o consecință, macrofagele și celulele dendritice specializate recunosc rapid eritrocitele externate de PS, ceea ce duce la fagocitoza eritrozei și catabolismul lor în splină și ficat.¹⁷Din cauza fiziopatologiei confuze aboală de rinichi– asociatanemiela oameni, studiile pe animale sunt justificate pentru a identifica mecanismele care contribuie. Nefropatie indusă de doxorubicină (DIN) la șoarecii 129S1/SvImJ¹⁸și șoareci cu deficit inductibil de podocină (Nphs2Dipod)¹⁹sunt 2 modele care se caracterizează prin inducerea proteinuriei în intervalul nefrotic în câteva zile, progresia spre insuficiență renală după 3 săptămâni și moartea în 6 până la 7 săptămâni.^19–21Ambele modele de șoarece recapitulează în mod eficient toate etapele IRC umană (boală cronică de rinichi). În studiul de față, am testat dacă insuficiența renală progresivă la acești șoareci cu proteinuricboală de rinichiafectează durata de viață a RBC și contribuie laanemie. În paralel, am examinat fenotipul RBC din sângele extras din CKD (boală cronică de rinichi) pacienți cu proteinurie cu gamă nefrotică.

CKD (boală cronică de rinichi) șianemie: CISTANCHE

METODE

Informații detaliate despre materiale și metode sunt furnizate în Materiale și metode suplimentare.

Studii la șoarece

Experimentele au fost efectuate pe 8-șoareci sălbatici 129S1/SvImJ de ambele sexe (Charles River). DIN a fost indus printr-o singură injecție de doxorubicină (14,5 mg/g greutate corporală), așa cum s-a descris anterior.^18,22Pentru a controla efectul mielotoxic al doxorubicinei care nu are legătură cu dezvoltarea nefropatiei, șoarecii C57BL/6 rezistenți la doxorubicină au fost, de asemenea, supuși aceluiași protocol de tratament.²³ În plus, experimente similare au fost efectuate pe șoareci în vârstă de 8-săptămână, cu ștergere inductibilă a podocinei (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) sau șoareci Nphs2Dipod, care au fost tratați cu doxiciclină timp de 14 zile.¹⁹Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și Legea Germană pentru Bunăstarea Animalelor, cu aprobarea autorităților locale (Regierungspräsidium Tübingen, numere de aprobare M12/17 și M17/19G). ). Designul experimental al studiilor la șoarece este prezentat în figura suplimentară S1.

Pacienții

Studiul pacientului a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki și a fost aprobat de comitetul local de etică al Spitalului Universitar Tübingen (556/2018BO2). Probele de sânge și urină cu litiu-heparină au fost obținute de la pacienți cu proteinurie în intervalul nefrotic și rata de filtrare glomerulară păstrată (GFR; stadiile 1-2; n ¼ 10) și de la pacienți cu RFG redus (CKD ().boală cronică de rinichi) stadiul 3–5; n ¼ 15) la Spitalul Universitar Tübingen. Ca grup de control, sângele de la voluntari sănătoși potriviți în funcție de vârstă și sex (n ¼ 25) a fost furnizat de banca de sânge a Spitalului Universitar din Tübingen. Toate probele umane au fost recoltate după acordul informat. Caracteristicile clinice ale pacienților sunt menționate înTabelul 1.

Tabelul 1|Caracteristicile pacienților cu CKD (boală cronică de rinichi) și ale donatorilor de sânge sănătoși

Analize de citometrie în flux

Diferiți parametri ai morții celulelor RBC au fost determinați prin citometrie colegi.¹⁴ Pentru a determina durata de viață a RBC in vivo, 25 ml de colorant ester succinimidilic al 5,6-carboxifluorescein diacetat [5(6)-CFDA, SE] au fost injectați la o concentrație de 9,96 mM (solubilizat în dimetilsulfoxid) în retro-orbital plexul de tip sălbatic 129S1/SvImJ și șoareci injectați cu doxorubicină, așa cum s-a descris anterior.24 La momentele indicate, sângele a fost extras din plexul retroorbital al șoarecilor și procentul de 5(6)-CFDA, SEþ celulele au fost detectate prin analize de citometrie colegi. În cele din urmă, datele au fost analizate folosind software-ul FlowJo (FlowJo LLC).

Deformabilitatea RBC și ektacitometrie cu gradient osmotic

Deformabilitatea RBC a fost măsurată utilizând Analizorul de celule cu rotație optică asistat de laser (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), care a fost descris în detaliu în altă parte.²⁵Analizele de ektacitometrie a gradientului osmotic (cosmos can) au fost, de asemenea, efectuate folosind LORCA Max Sis și au măsurat deformabilitatea în diferite condiții osmotice.²⁶

Examen histologic

Pentru colorarea cu hematoxilină și eozină, splinele și femurale au fost colorate cu hematoxilină și eozină. Toate lamele au fost colorate cu anticorpul primar Ter119 (BD Pharmingen; diluție 1:500). Pentru colorarea periodică cu acid-Schiff, felii de 2,5-mm grosime alerinichiau fost colorate cu reactiv acid periodic Schiff (Carl Roth) și hematoxilină (Abcam). Colorația May-Grünwald-Giemsa (metoda Pappenheim) a fost efectuată pentru a determina modificările formei RBC, așa cum s-a descris anterior.²⁷ Izolarea glomerulilor a fost realizată prin utilizarea unei abordări de biotinilare și sortare celulară.¹⁹Pentru detectarea proteinelor podocinei, a fost aplicat un anticorp de la Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Carl Roth) a fost folosit pentru a colora nucleele.

Metabolomice de cromatografie lichidă-spectrometrie de masă de performanță ultra-înaltă de la RBC de șoarece

Analizele au fost efectuate așa cum au fost publicate anterior.²⁸Pe scurt, platforma analitică folosește un sistem de cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță Vanquish (Thermo Fisher Scientific) cuplat online la un spectrometru de masă Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche trateaza bolile de rinichi cauzate de anemie

analize statistice

Datele sunt furnizate ca medii aritmetice SEM sau ca mediană cu intervalul intercuartil (percentila 25-75) cu n reprezentând numărul de animale utilizate sau, respectiv, de pacienți incluși. Datele au fost testate pentru normalitate cu testul Kolmogorov-Smirnov, testul D'Agostino și testul Shapiro-Wilk. Varianțele au fost analizate prin testul Bartlett pentru variații egale. Posttestul de comparație multiplă Tukey sau Dunn, testul t Student neîmperecheat sau testul U Mann-Whitney a fost efectuat de GraphPad Prism 8 (Software GraphPad). P < 0,05="" cu="" 2-="" testarea="" cu="" coadă="" a="" fost="" considerată="" semnificativă="" din="" punct="" de="" vedere="" statistic.="" grafice="" suplimentare="" au="" fost="" reprezentate="" prin="" graphpad="" prism="">

REZULTATE

Boala renală proteinurică experimentală induceanemiela șoareci După inducție, șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN și Nphs2Dipod au dezvoltat proteinurie în intervalul nefrotic (Figura 1a și Figura suplimentară S2C) și insuficiență renală progresivă caracterizată prin niveluri ridicate de uree în plasmă începând cu ziua 20 (Figura 1b și Figura suplimentară S2D). În primele 10 zile, șoarecii au experimentat creșterea în greutate corporală cu ascită (Figura 1c și Figura suplimentară S2E), reflectând retenția de sodiu cauzată de excreția de serin proteaze sau proteinurie.¹⁸După inversarea spontană a retenției de sodiu, acești șoareci au pierdut în mod constant în greutate. La șoarecii cu DIN și la șoarecii Nphs2Dipod, imaginile de microscopie ușoară, capturate după 10 zile, au evidențiat modificări histomorfologice tipice în concordanță cu scleroza glomerulară segmentară focală (Figura 1d și Figura suplimentară S2B). Acestea au fost absente la șoarecii C57BL/6 injectați cu doxorubicină (Figura 1d). Tratamentul cu doxorubicină a indus o scădere puternică a hemoglobinei, numărului de eritrocite și hematocritului (Figura 1e–g) începând cu ziua 10 la șoarecii 129S1/SvImJ și C57BL/6, care la cei din urmă au fost normalizați în zilele 20 și 30. În schimb, pe zilele 20 și 30, șoarecii 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină și cu deficit de podocină au dezvoltat progresivanemie, caracterizat prin volum corpuscular mediu redus (Figura 1h) și hemoglobină redusă (Figura suplimentară S2F), sugerând căanemieeste asociat cu insuficiență renală progresivă și nu cu tratamentul cu doxorubicină.

Figura 1|Funcția rinichilor și anemie deschisă la șoarecii 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină.(a–d) Șoarecii 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină au dezvoltat (a) proteinurie ridicată, (b) creșterea progresivă a concentrației plasmatice de uree, (c) creșterea tranzitorie a greutății corporale și (d) modificări histomorfologice tipice care indică scleroza glomerulară segmentară focală în ziua 10 (colorare cu acid periodic – Schiff; bară ¼ 10 mm). (e–h) În plus, acești șoareci s-au dezvoltatanemiereflectată de (e) un nivel scăzut al hemoglobinei, (f) un număr mai scăzut de globule roșii (RBC), (g) niveluri scăzute de hematocrit și (h) scăderea volumului corpuscular mediu. (a–d) Șoarecii C57BL/6 injectați cu doxorubicină nu au prezentat niciun semn de leziuni renale și (e–g)anemieîn ziua 10 a fost normalizat în zilele 20 și 30. Sunt afișate mijloacele aritmetice SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Anemia în boala renală proteinurică experimentală nu este cauzată de eritropoieza compromisă

Ambele modele de șoareci anemici au afișat o creștere semnificativă a procentului de reticulocite circulante (Figura 2a și Figura suplimentară S3C). Concentrațiile plasmatice de EPO au crescut dramatic în ziua 10 la 129S1/SvImJ cu DIN și șoarecii sănătoși C57BL/6, dar au fost normalizate din nou în zilele 20 și 30 (Figura 2b). La șoarecii cu deficit de podocină, concentrațiile plasmatice de EPO au crescut în ziua 10 și au rămas crescute în zilele 20 și 30 (Figura suplimentară S2H). În analizele histologice din măduva osoasă și splină, numărul de celule precursoare eritroide în comparație cu precursorii mieloizi a crescut în ziua 30 (Figura 2d-g), indicând eritropoieza stimulată la șoarecii anemici 129S1/SvImJ cu DIN.

Figura 2|Eritropoieza este stimulată la șoarecii cu anemie 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină. (a) Anemiela șoarecii 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină a avut loc în ciuda numărului crescut de reticulocite în zilele 2{{30}} și 30. (b) Concentrația plasmatică de eritropoietină a fost foarte crescută în ziua 10 la șoarecii 129S1/SvImJ și C57BL/6 cărora li s-a injectat doxorubicină, dar a fost normalizată din nou în zilele 20 și 30. (c–e) Cuantificarea numerelor absolute de (c) celule mieloide și (d) eritroide din măduva osoasă. Raportul (e) dintre celulele mieloide și eritroide la șoarecii 129S1/SvImJ sănătoși și injectați cu doxorubicină în măduva osoasă a arătat un număr mai mare de celule precursoare eritroide la șoarecii 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină în ziua 3{5{{52 }}}}. (f,g) Histologia (f) splinei și (g) măduvei osoase au arătat o creștere a celulelor precursoare eritroide, observată chiar și la măriri mai mici, la șoarecii 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină (panourile din dreapta) în comparație cu șoarecii sănătoși (panourile din stânga). ) în ziua 30. (f,g) Imunohistochimia Ter119 (panourile inferioare) a susținut descoperirile de hematoxilină și eozină (H&E). Ter119 este pozitiv în precursorii eritroizi (celule nucleate) și în celulele roșii din sânge (celule nenucleate). Bară ¼ 100 mm; inserții ¼ 25 mm. Sunt afișate mijloace aritmetice SEM. *P <0,05, **p=""><0,01 și="" ***p=""><0,001 indică="" o="" diferență="" semnificativă="" între="" șoarecii="" 129s1/svimj="" sănătoși="" și="" 129s1/svimj="" injectați="" cu="" doxorubicină;="" ##p=""><0,01 și="" ####p=""><0,0001 indică="" o="" diferență="" semnificativă="" față="" de="" valoarea="" inițială="" a="" șoarecilor="" 129s1/svimj="" injectați="" cu="" doxorubicină;="" și="" §p=""><0,05, §§p=""><0,01 și="" §§§§p=""><0,0001 indică="" o="" diferență="" semnificativă="" între="" șoarecii="" 129s1/svimj="" injectați="" cu="" doxorubicină="" și="" șoarecii="" c57bl/6="" injectați="" cu="">

Beneficiul deCistanche: tratarea bolilor de rinichi și îmbunătățirea funcției renale

Durata de viață redusă a eritrocitelor este cauza principală a anemiei în boala renală proteinurică experimentală

Externalizarea PS pe foița exterioară a membranei plasmatice RBC este un indicator al morții celulare și un promotor al eritrofagocitozei.¹⁴Moartea celulelor RBC a fost cuantificată utilizând analize de sortare a celulelor activate de fluorescență ale PS de suprafață legată de anexina V fluorescentă.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >De {{0}}ori mai mare în ziua 20 la șoarecii cu DIN (4,16 la sută și 0.86 la sută ) în comparație cu șoarecii sănătoși (1.{{7 }} la sută și 0.11 la sută ) (Figura 3a). În mod similar, șoarecii Nphs2Dipod au prezentat o creștere de aproximativ 2-ori a expunerii la PS (1,27 la sută și 0,20 la sută) în comparație cu șoarecii sănătoși (0,58 la sută și 0,05 la sută) în ziua 30 (Figura suplimentară S3A). Se știe că RBC-urile sunt eliminate din circulație de către macrofagele care locuiesc în splină.17 Prin urmare, această observație poate explica raportul mai mare splină/greutate corporală a șoarecilor Nphs2Dipod (Figura suplimentară S2G), în care de două ori mai multe RBC sunt degradate în comparație cu cele sănătoase. șoareci C57BL/6. Deoarece proteinuria în intervalul nefrotic duce la disproteinemie29, am investigat în continuare dacă moartea crescută a celulelor RBC poate fi stimulată de o componentă din plasma șoarecilor cu DIN. După cum este prezentat în Figura 3b, expunerea la PS în zilele 10 și 20 a fost de două ori mai mare după incubare (30 de minute la 37 de minute).^OC) RBC sănătoși în plasma șoarecilor 129S1/SvImJ injectați cu doxorubicină în comparație cu incubarea în plasmă a șoarecilor sănătoși. influxul de Ca2+ în RBC, mediat de canale de cationi neselective dependente de tensiune și independente de tensiune,^30,31este unul dintre regulatorii cheie ai morții celulelor RBC. În RBC-urile colectate în zilele 20 și 30 de la șoarecii 129S1/SvImJ cu DIN, concentrațiile intracelulare de Ca2+ au fost crescute (Figura 3c); acest fenomen a fost recapitulat la șoarecii Nphs2Dipod în ziua 20 (Figura suplimentară S3B). În ambele modele de șoarece, a existat o corelație negativă semnificativă a procentului de eritrocite PS-pozitive, cu severitateaanemiereflectată de nivelurile de hemoglobină (Figura 3d și Figura suplimentară S3D). Mai mult, a existat o corelație semnificativă cu afectarea rinichilor reflectată de concentrația de uree în plasmă (Figura 3e și Figura suplimentară S3E) și într-o măsură mai mică cu proteinurie (Figura 3f și Figura suplimentară S3F). Pentru a compensa pierderea RBC înanemie, formarea de noi RBC a fost stimulată la ambii șoareci, așa cum este indicat de procentul crescut de reticulocite circulante și a fost corelată semnificativ cu magnitudinea eritrocitelor care expun PS (Figura 3g și Figura suplimentară S3G).

Figura 3|Șoarecii cu nefropatie indusă de doxorubicină dezvoltă o moarte crescută a celulelor roșii din sânge (RBC) mediată de nivelurile crescute de calciu intracelular.(a) Externalizarea fosfatidilserinei (PS), reflectând moartea RBC, a fost îmbunătățită în zilele 20 și 3{0 după inducerea nefropatiei induse de doxorubicină. (b) Incubarea eritrocitelor sănătoase în plasmă luate în zilele 10 și 2{0 de la acești șoareci a condus la externalizarea PS. (c) Externalizarea PS a fost însoțită de niveluri sporite de calciu intracelular ale RBC luate în zilele 20 și 3{{30}} după inducție. (d–g) Procentul (d) de RBC care expun PS a fost corelat cu nivelurile de hemoglobină, afectarea rinichilor indicată de (e) concentrația de uree în plasmă și (f) proteinurie, precum și cu (g) ​​formarea reticulocitelor. (d–g) Datele includ fiecare punct de timp (0, 10, 20 și 30 de zile) al fiecărui șoarece sănătos 129S1/SvImJ și 129S1/SvImJ cu nefropatie indusă de doxorubicină. Sunt afișate mijloace aritmetice SEM. **P <0,01, ***p=""><0,001 și="" ****p=""><0,0001 indică="" o="" diferență="" semnificativă="" între="" șoarecii="" 129s1/svimj="" sănătoși="" și="" 129s1/svimj="" injectați="" cu="" doxorubicină="" (in.);="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01 și="" ####p=""><0,0001 indică="" o="" diferență="" semnificativă="" față="" de="" valoarea="" inițială="" a="" șoarecilor="" 129s1/svimj="" injectați="" cu="" doxorubicină;="" și="" §§§§p=""><0,0001 indică="" o="" diferență="" semnificativă="" între="" șoarecii="" 129s1/svimj="" injectați="" cu="" doxorubicină="" și="" șoarecii="" c57bl/6="" injectați="" cu="" doxorubicină.="" crea,="" creatinina;="" mfi,="" intensitatea="" medie="" a="">

Beneficiul deCistanche: tratarea bolilor de rinichi și îmbunătățirea funcției renale

CLICK AICI PENTRU PARTEA Ⅱ