Cum influențează polizaharidul Cistanche Deserticola absorbția osoasă?

Contact: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Polizaharidul Cistanche deserticola atenuează osteoclastogeneza și resorbția osoasă prin inhibarea semnalizării RANKL și a producției de specii reactive de oxigen

Dezhi Song și colab

Osteoporoza este o boală metabolică caracterizată prin osteopenie și deteriorarea microstructurală osoasă. Osteoclastele sunt celulele efectoare primare care degradează matricea osoasă și funcția lor anormală duce la dezvoltarea osteoporozei. Acumularea speciilor reactive de oxigen (ROS) în timpul metabolismului celular promovează proliferarea și diferențierea osteoclastelor, prin urmare, joacă un rol important în osteoporoză.Cistanchedeserticolapolizaharidă(CDP) posedă antitumoral,antiinflamatorși activitate antioxidantă. Cu toate acestea, impactul osteoclastelor CDPon este neclar. În acest studiu, colorarea cu fosfatază acidă rezistentă la tartrat, imunofluorescența, reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă și analiza Westernblot au fost utilizate pentru a demonstra că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a inhibat osteoclastogeneza și resorbția hidroxiapatitei. În plus, CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)de asemenea, a inhibat expresia genelor marker de osteoclaste, inclusiv Ctsk, Mmp9 și Acp5, și nu a avut nici un efect asupra activatorului receptor al expresiei factorului nuclear κB (RANK). Analizele mecaniciste au dezvăluit că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)crește expresia enzimelor antioxidante pentru a atenua producția de ROS mediată de RANKL în osteoclaste și inhibă factorul nuclear al celulelor T activate și activarea protein kinazei activate de mitogen. Aceste rezultate sugerează că CDP poate reprezenta un medicament candidat pentru tratamentul osteoporozei cauzate de activitatea excesivă a osteoclastelor.

CUVINTE CHEIEresorbtia osoasa,Cistanchedeserticolapolizaharide, MAPK, osteoclaste, specii reactive de oxigen

1|INTRODUCERE

Echilibrul dintre formarea osoasă, mediată de osteoblaste, și resorbția osoasă, mediată de osteoclaste, joacă un rol vital în menținerea homeostaziei metabolice osoase (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Când resorbția osoasă depășește formarea osoasă, apare osteoporoza, care se caracterizează prin reducerea masei osoase și leziuni microstructurale osoase (Ikeda, 2008). Osteoporoza este o boală frecventă la persoanele în vârstă și la femeile aflate în postmenopauză, iar patogeneza acesteia nu a fost pe deplin elucidată (Cooper & Melton, 1992). Deficiența de estrogen este o cauză principală a osteoporozei (Manolagas, O'Brien și Almeida, 2013). În plus, speciile reactive de oxigen (ROS) pot fi induse de activatorul receptorului ligandului factorului nuclear κB (RANKL) și sunt asociate cu formarea osteoclastelor (Yip și colab., 2005), și astfel pot contribui la dezvoltarea osteoporozei (Manolagas, 2010). Unele studii au descoperit că deficiența de Nrf2-antioxidant crește nivelurile de ROS și promovează diferențierea osteoclastelor indusă de RANKL (Hyeon, Lee, Yang și Jeong, 2013). Prin urmare, reducerea producției de ROS în timpul diferențierii osteoclaste ar trebui evaluată ca o strategie terapeutică pentru tratamentul osteoporozei.

Osteoclastele sunt derivate din linia monocitară sau macrofagehematopoietică și sunt singurele celule multinucleate care realizează resorbția osoasă (Teitelbaum, 2000). Prin urmare, cercetările care implică formarea osteoclastelor sunt de mare importanță în dezvoltarea de tratamente eficiente pentru bolile metabolismului osos (Lorenzo, 2017). Factorul de stimulare a coloniilor de macrofage (M-CSF) și RANKL, produse de osteoblaste și celulele T activate, sunt citokine importante care reglează osteoclastogeneza (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induce expresia factorului nuclear al celulelor T activate (NFATc1), care este un factor critic de transcripție activ în timpul formării osteoclastelor (Ishidaet al., 2002). NFATc1 activat promovează expresia genelor marker ale osteoclastelor, cum ar fi fosfataza acidă rezistentă la tartrat (TRAcP) și catepsina K (CTSK) care reglează osteoclastogeneza și funcția osteoclastelor (Balkan și colab., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistanchedeserticolapolizaharidă(CDP) este izolat din tulpinile cărnoase aleCistancheși are efecte de reglare imunitară, antitumorale, antiîmbătrânire și alte efecte farmacologice (Guo și colab., 2016; Jia, Guan, Guo și Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a avut un efect inhibitor asupra producției de oxid nitric (NO) indusă de lipopolizaharide în celulele microgliale de șoarece (celule BV-2; Nan și colab., 2013). În plus, extractul bogat în afeniletanoizi (ECD) deCistanchea îmbunătățit capacitatea de înot a șoarecilor prin scăderea leziunilor musculare, întârzierea acumulării de acid lactic și îmbunătățirea stocării de energie (Cai et al., 2010). Cu toate acestea, efectele CDP asupra funcției și activității osteoclastelor rămân necunoscute.

În acest studiu, am demonstrat că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)inhibă diferențierea RANKL-inducedosteoclaste și resorbția osoasă. Mecanismul de bază a fost acel CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)îmbunătățește expresia enzimelor antioxidante pentru a atenua producția de ROS și apoi suprimă cascadele de semnalizare a NFAT activat de RANKL și a proteinei kinazei activate de mitogen (MAPK). Aceste rezultate sugerează că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)ar putea fi utilizat pentru a trata osteoporoza cauzată de resorbția osoasă osteoclastică excesivă.

2|MATERIALE ȘI METODE

2.1|Materiale

CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)(puritate > 98 la sută) a fost achiziționat de la Solarbio (Beijing, China) și preparat la o concentrație stoc de 1 mM în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Anticorpii sunt specifici pentru c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2,TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilați (p)-ERK, p-p38, p-JNK și ‐actina au fost obținuți de la Moș Crăciun Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Anticorpii la V-ATPaza d2 au fost produși așa cum a fost descris anterior (H. Feng și colab., 2009). Sistemul de testare 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazoliu (MTS) și luciferaza a fost obținut de la Promega (Sydney, Australia). M-CSF recombinant a fost achiziționat de la R&D Systems (Minneapolis, MN). Proteina GST-rRANKL recombinantă a fost exprimată și purificată așa cum s-a descris anterior (Xu și colab., 2000).

2.2|Cultură de celule

Celulele RAW264.7 (celule macrofage de șoarece) au fost obținute din American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) și cultivate în mediu esențial minim modificat (Thermo FisherScientific, Scoresby, Australia) suplimentat cu 10% ser fetal, 2 mM de L-glutamina , 100 U/ml de penicilină și 100 ug/ml de streptomicină (mediu complet). Monocitele (BMM) derivate din măduva osoasă au fost izolate de la șoareci C57BL/6J de 6 săptămâni, care au fost eutanasiați conform procedurilor aprobate de Comitetul de etică a animalelor al Universității din Australia de Vest (RA/3/100/1244). Oasele lungi au fost disecat fără țesuturi moi și măduva osoasă a fost spălată din femur și tibie, care a fost apoi cultivată într-un mediu complet în prezența M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Test de osteoclastogeneză

BMM-urile au fost plasate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri la o densitate de 6 × 103 celule per godeu și tratate cu un mediu complet care conține M-CSF (50 ng/ml) și GST-rRANKL (100 ng/ml), în prezența sau absența concentrații variabile de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>trei nuclee) au fost identificate ca osteoclaste.

2.4|Teste de citotoxicitate

BMM-urile au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 6 × 103 celule per godeu și au rămas peste noapte pentru a adera. În ziua următoare, celulele au fost incubate cu concentrații variate de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă). După încă 48 de ore, soluţia MTS (20 ui/godeu) a fost adăugată şi incubată cu celule timp de 2 ore. Absorbanța la 490 nm a fost determinată cu un cititor de microplăci (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Colorare imunofluorescentă

BMM-urile au fost însămânțate la o densitate de 6 × 103 celule per godeu în prezența M-CSF (50 ng/ml) peste noapte. Celulele au fost apoi stimulate cu M-CSF și GST-rRANKL (100 ng/ml) până la formarea osteoclastelor mature. Teosteoclastele au fost apoi tratate cu concentrații variate de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)timp de 48 ore înainte de fixare cu 4% paraformaldehidă, permeabilizare cu 0,1% Triton X-100-PBS și blocare cu 3% albumină serică bovină în PBS. Celulele pregătite au fost incubate cu faloidină conjugată cu rodamină timp de 45 de minute în închis la culoare pentru F-actină. Celulele au fost apoi spălate cu PBS, nucleele contracolorate cu 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) și montate cu lamele pentru microscopie confocală.

2,6|Testul de resorbție a hidroxiapatitei

Pentru a măsura activitatea osteoclastelor, BMM-urile (1 × 105 celule per godeu) cultivate pe plăci acoperite cu colagen cu șase godeuri (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) au fost stimulate cu GST-rRANKL (100 ng/ml) și M-CSF (50 ng/ml). ) până când au fost generate osteoclaste mature (Zhou et al., 2016). Celulele au fost apoi detașate ușor din placa folosind soluția de disociere a celulelor (Sigma-Aldrich) și un număr egal de osteoclaste mature au fost însămânțate pe godeuri individuale acoperite cu plăci cu 96 de godeuri acoperite cu hidroxiapatită (Corning Osteoassay, Corning, NY). Osteoclastele mature au fost incubate într-un mediu care conține GST-rRANKL și M-CSF cu sau fără CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)la concentratiile indicate. După 48 de ore, jumătate din godeuri au fost colorate imunohistochimic pentru activitatea TRAcP, așa cum este descris mai sus, pentru a evalua numărul de celule multinucleate per godeu. Godeurile rămase au fost albite timp de 10 minute pentru a îndepărta celulele și pentru a permite măsurarea zonelor resorbite. Zonele resorbite au fost fotografiate la microscopie cu lumină standard și software-ul Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) a fost utilizat pentru a cuantifica suprafața procentuală de hidroxiapatită resorbită de osteoclaste.

2,7|Testele reporterului luciferazei

Pentru a investiga activarea transcripțională NFATc1, celulele RAW264.7 au fost transfectate stabil cu un construct luciferasereporter care răspunde la NFATc1 (Cheng și colab., 2018; van der Kraan și colab., 2013). Celulele transfectate au fost cultivate în plăci cu 48 de godeuri la o densitate. .5 × 105 celule per godeu și pretratate cu diferite concentrații de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)timp de 1 oră. După pretratament, celulele au fost stimulate cu GST-rRANKL (100 ng/ml) timp de 24 de ore, iar activitatea luciferazei a fost măsurată utilizând sistemul de testare reporter luciferază conform protocolului producătorului (Promega).

2,8|Analiza cantitativă de reverstranscripție-reacție în lanț a polimerazei (RT-PCR).

ARN-ul total a fost izolat din celule folosind reactiv Trizol conform protocolului producătorului (Thermo Fisher Scientific). ADN-ul complementar a fost sintetizat folosind transcriptaza inversă a virusului leucemiei murine Moloney cu 1 ug de matriță ARN și primeri oligo-dT. Amplificarea prin reacția polimerază în lanț a secvențelor specifice a fost efectuată folosind următorul program: 94 de grade timp de 5 minute, urmat de 30 de cicluri de 94 de grade timp de 40 s, 60 de grade timp de 40 s și 72 de grade timp de 40 s și un pas final de extensie de 5 minute la 72 de grade. Informațiile detaliate ale primerilor specifici sunt prezentate în Tabelul 1. Nivelurile relative de ARN mesager au fost calculate prin normalizarea la expresia genei de întreținere Hmbs.

2,9|Analiza Western blot

BMM-urile au fost cultivate în mediu complet cu M-CSF în plăci cu șase godeuri și stimulate cu GST-rRANKL (100 ng/ml) pentru timpii indicați. Celulele au fost lizate în tampon de liză de radioimunoprecipitare și proteinele au fost rezolvate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă și transferate pe membrane de poli(fluorura de viniliden) (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Membranele au fost blocate în lapte degresat 5% timp de 1 oră și apoi testate cu diverși anticorpi primari specifici cu agitare delicată peste noapte la 4 grade. Membranele au fost spălate și apoi incubate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean. Reactivitatea anticorpilor a fost apoi detectată cu reactiv de chimioluminiscență îmbunătățită (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) și vizualizată cu un Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Detectarea ROS intracelular

Nivelurile intracelulare de ROS au fost detectate folosind un kit de analiză celulară de detecție a ROS cu diacetat de 2′,7′-diclorofluoresceină (Abcam, Melbourne, Australia). BMM-urile (5 × 103 celule per godeu) au fost cultivate în plăci cu 96 de godeuri și tratate cu RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) și CDP timp de 72 de ore. Nivelurile intracelulare de ROS au fost măsurate folosind diacetat de 2’,7’-diclorofluoresceină, care se oxidează în DCF fluorescent în prezența ROS. Celulele au fost spălate în tampon Hank și incubate la întuneric timp de 30 de minute cu 10 pM de DCFH-DA. Imaginile au fost obținute folosind microscopia confocală.

2.11|analize statistice

Toate datele sunt reprezentative pentru cel puțin trei experimente efectuate în triplicat, dacă nu se indică altfel. Datele sunt exprimate ca medie ± SD. Analiza unidirecțională a varianței, urmată de teste Student–Newman–Keulspost hoc au fost utilizate pentru a determina semnificația diferențelor dintre rezultate, cu p < 0.05="" considerat="">

3|REZULTATE

3.1|CDP inhibă dosteoclastogeneza indusă de RANKL și fuziunea osteoclastelor

Pentru a determina dacă CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)poate suprima osteoclastformarea indusă de RANKL, am efectuat mai întâi un test de osteoclastogeneză folosind BMM-uri de șoarece (Liu și colab., 2013; Song și colab., 2016). BMM-urile au fost tratate cu RANKL și M-CSF timp de 5 zile cu concentrații crescânde de CDP. CDP a redus numărul de celule multinucleate TRAcP pozitive atunci când concentrația de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a atins 5 µM sau mai mare (Figura 1a,b). Pentru a evalua CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)toxicitatea și să confirmăm că aceste rezultate nu au fost o reflectare a morții celulare sau a numărului, am efectuat un test MTS. BMM-urile au fost tratate cu RANKL și M-CSF timp de 48 de ore cu diferite doze de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă). CDP nu a avut niciun efect asupra proliferării BMM la o concentrație de 15 µMor mai puțin (Figura 1c).

Pentru a testa efectele CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)la fuziunea osteoclastelor, osteoclastele au fost induse cu tratament RANKL și M-CSF, cu sau fără doze variate de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă). Osteoclastele au fost colorate cu rodamină-faloidină și DAPI pentru a evalua numărul de nuclei per osteoclast (Figura 2a). Atât numărul de osteoclaste, cât și numărul mediu de osteoclaste nucleiper au scăzut după CDP.(Cistanchedeserticolapolizaharidă)tratament (5–10 µM; Figura 2b, c). Prin urmare, CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a avut efecte inhibitoare asupra osteoclastogenezei induse de RANKL și fuziunii osteoclastelor într-o manieră dependentă de doză.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)atenuează activitatea de resorbție a osteoclastichidroxiapatitei indusă de RANKL

A fost efectuat un test de resorbție a hidroxiapatitei pentru a detecta efectul CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)asupra funcției osteoclastelor (Figura 3a). După o incubație de 24 de ore, numărul de osteoclaste per godeu nu s-a schimbat în timp ce aria de resorbție a hidroxiapatitei a fost redusă semnificativ prin tratamentul cu 5 și 10 µM CDP în comparație cu grupurile de control (Figura 3b, c). Aceste rezultate demonstrează că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)are efecte puternic inhibitoare atât asupra formării osteoclastelor, cât și asupra activității de absorbție a osteoclastelor, fără efecte citotoxice.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)inhibă expresia genelor markerului osteoclast

Pentru a investiga în continuare efectele inhibitoare ale CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)asupra osteoclastogenezei și resorbției osoase osteoclastice, BMM-urile au fost tratate cu RANKL și M-CSF timp de 5 zile cu concentrații diferite de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă).RT-PCR a fost apoi efectuată pentru a detecta expresia genelor marker osteoclaste. Expresia Nfatc1, un factor de transcripție crucial în timpul osteoclastogenezei, a fost inhibată de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)într-o manieră dependentă de doză (Figura 4a). În plus, CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)(5 și 10 µM) au reglat în jos expresia genelor legate de resorbția osoasă, inclusiv Mmp9, Ctsk și Acp5 (Figura 4b-d).

3.4|CDP suprimă activitatea NFATc1 și expresia proteinei în aval

Pentru a examina efectul CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)pe activitatea NFATc1 indusă de RANKL, a fost efectuat testul de raportare al aluciferazei. Tratament cu CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă), la concentrații de 5 µM și mai mari, au inhibat semnificativ activitatea NFATc1 indusă de RANKL (Figura 5a). În plus, analizele Western blot au arătat că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a suprimat semnificativ expresia proteinei NFATc1 și c-Fos în BMM-urile tratate cu RANKL și M-CSF timp de 3 și 5 zile (Figura 5b). În plus, expresia proteinelor legate de funcția osteoclastelor, cum ar fi V-ATPaza-d2 și CTSK, a fost reglată în jos în prezența CDP.(Cistanchedeserticolapolizaharidă)comparativ cu grupurile de control. Cu toate acestea, CDP nu a avut niciun efect asupra expresiei RANK (Figura 5b).

3,5|CDP promovează expresia enzimelor antioxidante pentru a elimina producția de ROS în timpul osteoclastogenezei induse de RANKL

Pentru a explora mecanismul de bază al inhibării osteoclastogenezei dependente de CDP, BMM-urile au fost tratate cu RANKL (100 ng/ml) și M-CSF (50 ng/ml) împreună cu PBS sau CDP.(Cistanchedeserticolapolizaharidă)timp de 72 de ore. Am examinat efectul CDP asupra producției intracelulare de ROS stimulată de RANKL. Nivelurile intracelulare de ROS au fost crescute prin tratamentul RANKL, care a fost atenuat de CDP (5 și 10 µM; Figura 6a). Atât numărul de celule ROS pozitive, cât și intensitatea colorării cu ROS au fost scăzute prin tratamentul CDP într-o manieră dependentă de doză (Figura 6b, c). Analiza Western blot a arătat că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a promovat expresia tioredoxinei (TRX1) și glutation reductază (GSR) în timp ce a suprimat expresia oxidului nitric sintetazei inductibile (NOS2) în BMM-uri care au fost tratate cu RANKL și M-CSF timp de 3 zile (Figura 6d).

Pentru a explora în continuare dacă CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a suprimat diferențierea osteoclastelor prin reducerea producției de ROS, apoi am tratat BMM-urile cu peroxid (10 µM) pentru a imita starea ridicată a ROS în celule. BMM-urile au fost induse de RANKL și M-CSF timp de 3 zile, iar rezultatele analizei westernblot și RT-PCR au arătat că peroxidul a promovat expresia NFATc1 și c-Fos în comparație cu grupurile de control. În conformitate cu rezultatele din Figura 5, expresia NFATc1 și c-Fos a fost suprimată de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)în timp ce peroxidul a salvat efectul inhibitor al CDP (Figura 6e, f). Aceste date au indicat că CDP a reprimat expresia NFATc1 și c-Fos prin eliminarea producției de ROS.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)reprimă căile MAPK în timpul osteoclastogenezei induse de RANKL

Apoi, am investigat efectul CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)tratamentul pe expresia TRAF6 mediată de RANKL și activarea căii MAPK. După incubarea în mediu fără ser timp de 2 ore, BMM-urile au fost stimulate cu RANKL, cu sau fără CDP, timp de 60 de minute. Stimularea cu CDP (10 pM) nu a avut efect asupra expresiei TRAF6 și a atenuat fosforilarea JNK2 și ERK1/2 la 10 și 20 min (Figura 7). În plus, fosforilarea p38 a fost inhibată semnificativ de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)tratament de 60 de minute comparativ cu grupurile de control (Figura 7). Aceste date relevă faptul că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)suprimă căile de semnalizare MAPK induse de RANKL, în concordanță cu efectul său inhibitor asupra formării și activității osteoclastelor.

4|DISCUŢIE

Cistanche, cunoscut sub numele de „ginseng de deșert”, a atras multă atenție recent pentru capacitatea sa de a modula imunitatea și de a acționa protector în timpul îmbătrânirii și stresului oxidativ (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). S-a demonstrat că glicozidele substituite cu fenilpropanoid, componentele majore active ale Cistanche, inhibă activitatea NO în macrofage (Ahn, Chae, Chin și Kim, 2017). În plus, aCistancheextractul a redus stresul oxidativ în miocardul reperfuzat după ischemie și a jucat un rol semnificativ în inhibarea căilor apoptotice care conduc la cardioprotecție (Yu, Li și Cao, 2016). Ca o componentă importantă a Cistanche,CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)are o varietate de funcții farmacologice. Studiul nostru actual a descoperit că CDP a reprimat diferențierea și activarea osteoclastelor activate de RANKL prin atenuarea producției de ROS, precum și a activării NFAT și MAPK.

Ca fosfatază acidă, TRAcP există într-o varietate de celule și este abundent în osteoclaste și macrofage alveolare (Snipes, Lam, Dodd, Gray și Cohen, 1986). TRAcP este o enzimă caracteristică osteoclastelor, iar expresia sa este strâns legată de funcția osteoclastelor, considerată un indicator al activității osteoclastelor și al resorbției osoase (Minkin, 1982). În studiul nostru, CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a inhibat numărul de celule TRAcP pozitive, indicând faptul că osteoclastogeneza indusă de RANKL a fost blocată de CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă). Degradarea matricei osoase de către osteoclaste depinde de catepsină K (CTSK) și MMPs (Gruber, 2015). Aici, CDP a redus în mod semnificativ expresia genelor funcționale osteoclaste, cum ar fi Mmp9, Ctsk și Acp5.

Diferențierea și funcția osteoclastelor sunt reglementate de căi multiple de semnalizare (Boyle, Simonet și Lacey, 2003). După legarea la RANK, RANKL recrutează proteina adaptor TRAF6 pentru a activa expresia NFATc1, care este un factor de transcripție important pentru formarea osteoclastelor, care afectează expresia genei specifice osteoclastelor, inclusiv TRAcP și CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi și colab., 2002). În acest studiu, am constatat că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)nu a avut niciun efect asupra expresiei RANK și TRAF6 în osteoclaste. Cu toate acestea, CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a inhibat activarea NFATc1 indusă de RANKL în timpul osteoclastogenezei BMM. În plus, s-a demonstrat că ROS, produs de mitocondrii în procesul de livrare a electronilor, a promovat proliferarea și diferențierea osteoclastelor și a reglat degradarea matricei osoase (Ha et al., 2004). Un studiu recent a constatat că RANKL a indus importul nuclear Bach1 și a atenuat producția de enzime antioxidante mediată de Nrf2, crescând astfel expresia intracelulară a ROS și osteoclastogeneza la șoareci (Kanzaki și colab., 2017). În plus, a crescut generarea intracelulară de ROS prin formarea și activitatea dosteoclastelor amplificate de homocisteină (Koh și colab., 2006). Studiul nostru a descoperit că CDP a redus acumularea de ROS în osteoclaste prin inhibarea expresiei NOS2 și promovarea expresiei enzimelor antioxidante, cum ar fi TRX1 și glutation reductaza. NFATc1. De asemenea, am descoperit că peroxidul a salvat efectul inhibitor al expresiei CDPon NFATc1. Deci, datele noastre sugerează că CDP suprimă acumularea de ROS pentru a inhiba expresia NFATc1, apoi pentru a reprima formarea și funcționarea steoclastelor.

ERK, JNK și p38 aparțin familiei MAPK, care este, de asemenea, implicată în reglarea diferențierii osteoclastelor (Seger & Krebs, 1995). RANKL activează calea MAPK prin creșterea fosforilării ERK, JNK și p38 (Mizukami și colab., 2002). Am demonstrat că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)a reprimat fosforilarea mediată de RANKL a proteinelor cheie în calea MAPK, contribuind astfel la efectul inhibitor al CDP asupra expresiei genelor marker pentru osteoclaste. Din cunoștințele noastre, acesta este primul studiu care arată efectele inhibitoare ale CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)privind producția de ROS, NFAT și activarea MAPK, reprezentând noi mecanisme de acțiune ale CDP in vitro.

În rezumat, am demonstrat că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)atenuează osteoclastogeneza și resorbția hidroxiapatitei și expresia genelor marker de osteoclaste, inclusiv Ctsk, Mmp9 și Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)putea suprima producția de ROS mediată de RANKL, precum și activarea NFAT și MAPK (Figura 8). În mod colectiv, rezultatele noastre sugerează că CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)poate reprezenta un medicament candidat pentru tratamentul afecțiunilor legate de osteoclaste însoțite de supraproducție de ROS.

FIGURA 8 Schema schematică a CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)funcţia în diferenţierea osteoclastelor. CDP(Cistanchedeserticolapolizaharidă)suprimă producția de ROS indusă de RANKL, precum și activarea NFATc1 și MAPK, prin urmare inhibând osteoclastogeneza. CDP,Cistanchedeserticolapolizaharidă; MAPK, protein kinază activată de mitogen; NFATc1, factor nuclear al celulei T activate; RANKL, activator al receptorului factorului nuclear kBligand; ROS, specii reactive de oxigen [Figura de culoare poate fi vizualizată pe atwileyonlinelibrary.com]

MULȚUMIRI

Acest studiu a fost susținut de Fundația pentru Știința Naturii din China (81572164), Programul Național de Cercetare și Dezvoltare Tehnologică Cheie din China (2017YFC1103300), Fundația pentru Științe Naturii din provincia Guangxi (2016GXNSFAA380295) și Proiectul de cercetare științifică și tehnologică universitară din provincia Guangxi (KY2015YB05) ). Este, de asemenea, sprijinit parțial de proiectul Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards și Australian Health and Medical. Consiliul de Cercetare (NHMRC, nr. 1107828 și 1027932).

CONFLICTE DE INTERES

Autorii declară că nu există conflicte de interese

De la: 'Cistanchedeserticolapolizaharidăatenuează osteoclastogeneza și resorbția osoasă prin inhibarea semnalizării RANKL și a producției de specii reactive de oxigen de către Dezhi Song și colab.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684