Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Îmbunătățirea producției de glicozide feniletanoide de către un elicitor fungic în cultura suspensiei celulare de Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

Cuvinte cheie Cistanche deserticola, elicitor fungic,glicozidă feniletanoidă, cultura celulelor vegetale

Abstract
Când, în a 15-a zi de creștere, un elicitor dinFusarium solania fost adăugat la 40 mg l^-1spreCistanche deserticolaculturi de suspensie celulară, conținutul de echinacozidă, acteozidă și totalglicozide feniletanoide(PEG) în celulele cultivate toate crescut în următorii 27 d cu peste 100% la 15 mg g^-1wt uscat, 9 mg g-1 wt uscat și 57 mg g^-1wt uscat, respectiv. Biomasa finală (1,3 mg ml wt uscată^-1) nu a fost afectată.

Cistanche deserticola

Introducere

Cistanche deserticolaMarian. (Orobanchaceae), o planta nativa din China este utilizat pe scară largă în medicina tradițională pentru diverse tratamente, inclusiv utilizarea ca un sedativ sau un intensificator de răspuns imun (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Glicozide feniletanoide(PEG) sunt metaboliții bioactivi majori dinCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) și sunt compuse din mai multe componente, cum ar fi echinacoside, acteoside, cisacteoside, izoacteoside, 2-acetilacteoside, cistanoside A, și osmanthuside B (Wang et al. 2000). Odată cu creșterea cererii pentru aceste produse și scăderea rapidă aCistanche deserticolaplante, cultura celulară ar fi un mijloc alternativ atractiv de producție. Mulți elicitori (în special elicitori fungici) pot spori producția de metaboliți în cultura celulelor vegetale (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) a constatat că un elicitor fungic al Fusarium solani izolat de sistemele radiculare ale ambelorCistanche deserticolași gazda sa, Halaxylon ammodendron, ar putea îmbunătăți conținutul de aminoacizi în calli deCistanche deserticolaDar modificările conținutului peg-urilor în această linie de calus nu au fost menționate în studiul lor. În această lucrare, efectele unui elicitor de la F. solani asupra biosintezei PEG-urilor totale și a două PEG-uri bioactive principale (echinacozidă și acteosidă), precum și asupra modificărilor creșterii celulare au fost studiate în cultura de suspensie aCistanche deserticola.

Materiale și metode

Culturi de celule vegetale
Calusul a fost indus din cântare deCistanche deserticolași menținută pe mediul B5 gamborg (1968) suplimentat cu 0,5 mg acid indol-3-acetic l^-1, 2 mg kinetină l^-1,și 1 g hidrolizat de cazeină l^-1. pH-ul a fost ajustat la 6 înainte de sterilizare. Toate experimentele au fost efectuate în baloane de agitare de 250 ml, fiecare conținând un mediu de 100 ml pe un agitator rotativ (120 rpm și 25 °C) sub întuneric. Inoculul a fost de aproximativ 100 g wt l proaspăt^-1.

conținutul efectiv al cistanche deserticola--glicozidă feniletanoidă

Pregătirea elicitorului fungic

Separarea tulpinii ciupercilor, Fusarium solani și pregătirea elicitorului fungic au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Diferite cantități (echivalente de carbohidrați) de elicitor fungic au fost adăugate la culturile de balon de agitare pe 15 d (perioada totală de cultură a fost de 42 d).

Acumularea de biomasă și testul viabilității
Celulele dintr-un balon de agitare au fost spălate cu apă distilată și liofilizate la o greutate constantă. WT uscat a fost astfel determinată. Viabilitatea celulară (procentul de celule viabile dintr-o populație celulară) a fost determinată prin reducerea clorurii de tetrazoliu de 2,3,5-trifenil (Towill & Mazur 1975).

glicozidă feniletanoidădecistanche deserticola

Determinarea conținutului de echinacozidă, actozidă și totalăglicozide feniletanoide(Cuie)
Extracția PEG-urilor a fost efectuată în conformitate cu metoda Du & Liu (1993). LiofilizatCistanche deserticolacelulele au fost extrase cu etanol 70% (v/v). Fracțiunea de etanol a fost concentrată, degresată cu acetat de etil saturat cu apă și apoi levigată cu n-butanol saturat cu apă. Fracțiunea n-butanol a fost concentrată, dizolvată în apă, încărcată într-o coloană de rășină macroporă (AB-8, produs chimic al Universității Nankai, Tianjin, China) și eluată cu apă și metanol, succesiv. Fracțiunea metanolului a fost colectată, iar conținutul total de PeG a fost determinat prin utilizarea echinacozidei ca standard la 334 nm. Echinacozidul și actosidul au fost determinate prin utilizarea coloanei Nova Pak C18 (250 × 4,6 mm) într-un sistem HPLC (ape) cu detector UV (334 nm).

Rezultatele

Efectul elicitorului fungic asupra acumulării de biomasă și a biosintezei totale a PEG Efectele elicitorului fungic asupra biomasei celulare și acumularea totală de PEG-uri au depins de doza adăugată (echivalenți carbohidrați). După cum se arată în figura 1, doze mai mici de elicitor au fost favorabile wt uscat deCistanche deserticolaCelule. Vârful a fost cu elicitorul la 20 mg l^-1(dându-se 1,76 mg ml wt uscat^-1).
Acumularea totală de peg-uri a fost îmbunătățită semnificativ de elicitorul fungic la între 20 mg l^-1și 80 mg l^-1. Elicitor la 40 mg l-1 a obținut cel mai mare randament (57 mg g^-1), care a fost de peste două ori mai mare decât cea obținută în cultura de control non-elicitor. Experimentul ulterior a folosit elicitorul fungic la 40 mg1^-1.

Fig. 1. Greutatea celulelor uscate și acumularea totală de PEG-uri în cultura celulară de suspensie deCistanche deserticolaca răspuns la diferite doze de elicitor fungic. Un elicitor fungic a fost adăugat la mediu pe 15 d. Probele au fost prelevate după încă 27 d. ▲, Greutatea finală a celulelor uscate; ◆, conținutul total al PeG. Valorile sunt mijloace de rezultate triplicate, iar barele de eroare reprezintă abateri standard.

Cursul de timp al creșterii celulelor și biosinteza PEGs
Figura 2 prezintă evoluția în timp a viabilității celulare și biosinteza PEG (echinacozidă și acteozidă) a celulelor de suspensie după ce culturile au fost supuse unei 40 mg l^-1elicitor fungic pe 15 d. În următoarele 27 d de cultură, echinacozidă și acteosidă, cele două peg-uri bioactive principale dinCistanche deserticola, ambele au crescut considerabil. Pe 39 d s-au realizat acumulări maxime, ajungând la 14,7 mg g^-1wt uscat și 8,9 mg g^-1wt uscat, respectiv. Nu s-a observat o diferență semnificativă în viabilitatea celulară între culturile tratate cu elicitor și control.

Fig. 2. Viabilitatea celulară și biosinteza echinacozidă și acteozidă în cultura celulară de suspensie aCistanche deserticoladupă tratament cu 40 mg l^-1elicitor fungic. Elicitorul fungic a fost adăugat în mediu pe 15 d.◆, Echinacoside tratate cu elicitor; ◇, echinacozid-control; ●, acteoside tratate cu elicitor;○,

acteoside-control; ▲, viabilitatea celulară tratată cu elicitor;△ , controlul viabilității celulare. Valorile sunt mijloace de rezultate triplicate, iar barele de eroare reprezintă abateri standard.

Discuție

Multe componente derivate din ciuperci (fragmente de perete celular, polizaharide, oligozaharide, glicoproteine etc.) au fost folosite ca diferiți elicitori fungici în producția secundară de metaboliți cu multe specii de celule vegetale. În această lucrare, omogenatul (compus în principal din polizaharide) din tulpina ciuperca Fusarium solani izolate din sistemele radiculare deCistanche deserticolași Halaxylon ammodendron sa dovedit a fi un elicitor eficient pentru biosinteza PeGs în cultura celulară aCistanche deserticola. Utilizarea acestui elicitor pentru a stimula sinteza PEG în celule nu numai că a fost semnificativă, dar a fost expusă la scurt timp după elicitare. Această concluzie a fost de acord cu unele studii anterioare privind cultura celulelor vegetale (Wang et al. 2001).

În studiul anterior al Li et al. (1998), când un elicitor fungic de la F. solani a fost adăugat la mediul de cultură, calus indus din semințele deCistanche deserticolaar putea rămâne în viață în subcultura ulterioară pe termen lung, iar producția de iridoide ar putea fi îmbunătățită. Acesta a indicat că celulele cultivate ar putea sintetiza metaboliți secundari ai rezistenței la boli atunci când sunt atacate de microorganisme. Deși iridoidele nu au fost determinate în experimentul nostru, am arătat că polizaharidele din F. solani ar putea fi folosite ca elicitori fungici eficienți în producția de PEG-uri cuCistanche deserticolaCelule.

conținutul efectiv al cistanche deserticola--glicozidă feniletanoidă

De la: ' Îmbunătățireaglicozide feniletanoideproducția de către un elicitor fungic în cultura suspensiei celulare deCistanche deserticola" de Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotehnologie Scrisori 25: 1437-1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Tipărit în Țările de Jos.

Referinţe

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Studiul efectelor puternice aleCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (C.A. Mey) G. Beck. și Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. China J. Chin. Mater. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Determinareaglicozide feniletanoideînCistanche deserticolaprin spectrofotometrie de rășină macrovesiculară. Nat. Prod. Res. Dezvolta. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Cerințe nutritive ale culturilor de suspensie de celule rădăcină de soia. Exp. Celula Res. 50: 151-158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Studiul constituenților chimici și efectele farmacologice aleCistanche deserticolaMarian. și Cistanche salsa (C.A. Mey) G. Beck. Bărbie. Tradit. Iarbă. Droguri 26: 143-146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Efectul elicitor de Fusarium solani asupra conținutului de aminoacizi deCistanche deserticolaCalus. China J. Nord-Vest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) Studii de reducere a clorurii de 2,3,5-trifeniltrazoliu ca un test de viabilitate pentru culturile de tesut vegetal. Poate. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Accesoriu de productia de Taxol și excreția în cultura de celule Taxus Chinensis prin elicitare fungice și mediu de reînnoire. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Analizaglicozidă feniletanoidăîn extractul de ierburi Cistanchis de LC/ESI- MS/MS. Acta Pharm. Sin. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Inhibarea oxidului nitric de feniletanoide în macrofage activate. Eur. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Efectele acidului salicilic asupra fungice induse de elicitor membrana-peroxidarea lipidelor și producția de Taxol în culturi de suspensie celulară de Taxus Chinensis. Proc. Biochem. 37: 477–482.