Cum să preveniți și să reduceți formarea pietrelor la rinichi?

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Partea Ⅰ Ⅱ: Eversiune de fosfatidilserină reglată de fosfolipide scramblase activată de semnalizarea TGF-1/Smad în stadiul incipient al formării pietrelor la rinichi

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Introducere

Urolitiaza este una dintre cele mai frecvente boli care afectează oamenii și este asociată cu multiple complicații urologice [1]. Se pare că oxalatul de calciu (CaOx) dăunează celulelor tubulare renale cultivate, după care fosfatidilserina (PS) a membranei celulare se întoarce din stratul interior în stratul exterior in vitro pentru a juca un rol important înPiatra la rinichiformarea [2]. Descoperiri similare au fost raportate de diferite studii [3-6]realizate la nivel celular. Cu toate acestea, mecanismul care stă la baza externalizării PS în celulele tubulare renale cauzate de deteriorarea mediată de CaOx rămâne neclar. Studiile anterioare au arătat că o concentrație mare de oxalat de calciu duce la supraproducția de specii reactive de oxigen (ROS) [7], care ulterior contribuie la exteriorizarea PS în celulele tubulare renale pentru a duce la nuclearea și creșterea cristalelor de CaOx [8]. ROS și peroxidarea lipidelor activează puternic fosfolipidele scramblase (PLSCR)[9], în timp ce expunerea la ROS scavengers, cum ar fi glutation, coenzima Q10 sau idebenona (un omolog sintetic al coenzimei Q10), reduce activarea PLSCR în boala polichistică de rinichi [10] . PLSCR, care este ancorat de membrana celulară [11], funcționează ca una dintre cele trei enzime de răsturnare a fosfolipidelor capabile să catalizeze mișcarea rapidă în două sensuri a PS pe ambele părți ale membranei de-a lungul unui gradient de concentrație [12]. În condiții fiziologice, membrana celulară este într-o stare asimetrică, iar PLSCR nu are efect asupra membranei [13]. Cu toate acestea, în urma leziunii celulelor eucariote, PLSCR este activat și mută PS din stratul interior în cel exterior [14,15]. În plus, supraexprimarea celulelor K1 din ovarul de hamster chinezesc PLSCRin stimulează externalizarea PS, sporind mișcarea către exterior a PS la suprafața celulei în timpul apoptozei [16]. Prin urmare, am emis ipoteza că PLSCR este, de asemenea, implicat în exteriorizarea PS în membrana celulelor tubulare renale prin activarea ROS.

Un mecanism molecular potențial al producției de ROS indusă de oxalat are loc prin inducerea semnalizării TGF- 1/Smad, care poate juca un rol în producerea ROS [17,18]. Într-adevăr, semnalarea TGF- 1/Smad este implicată într-o multitudine de boli de rinichi, cum ar fi glomerulonefrita, fibroza interstițială renală și nefrolitiaza[19]. Mai mult decât atât, celulele mononucleare tratate cu TGF- 1 prezintă PSexternalizare în membrana celulară determinând răsturnarea PS din stratul interior spre stratul exterior [20]. Cu toate acestea, din cunoștințele noastre, relația dintre semnalizarea TGF- 1/Smad și PSeversion în membranele celulelor tubulare renale rămâne necunoscută. Am emis ipoteza că TGF- 1 participă la eversia PS în membranele celulelor tubulare renale prin activarea PLSCR în stadiul incipient al șobolanului.Piatra la rinichiformare mediată de ROS.

Prin urmare, am investigat dacă semnalizarea TGF- 1/Smad stimulează exteriorizarea PS prin activarea ROS și dacă TGF activează PLSCR în membrana celulelor tubulare renale în stadiul incipient alPiatra la rinichidezvoltarea in vitro și in vivo, punând astfel o bază teoretică pentru etiologiaPiatra la rinichiformare.

Faceți clic pe Cistanche DHT pentru boli de rinichi

Materiale și metode

Model de șobolan al formării de pietre la rinichi de CaOx în stadiu incipient

Șaizeci de șobolani Wistar masculi în vârstă de 3-luni, cu o greutate de 200±20 g, au fost furnizați de Centrul pentru Animale Experimentale de la Universitatea Medicală din Harbin și găzduiți la temperatura camerei (22 grade ±2 grade ) și 50-70 procente de umiditate. După 3 zile de reproducere adaptivă, au fost împărțiți aleatoriu în trei grupuri (20 de șobolani/grup) - martor,Piatra la rinichi, șiPiatra la rinichiplus SB431542 (un inhibitor al căii de semnalizare TGF- 1/Smad).

Piatra la rinichiformarea este inițiată ca o modificare patologică precoce după leziunea celulelor tubulare renale [21,22]. Pentru a studia acest proces de rănire, un model de șobolan în stadiu incipientPiatra la rinichiformarea a fost stabilită, deoarece o abordare standardizată nu a fost încă raportată. Pentru a observa modificările timpurii după leziunea celulelor tubulare renale, am aplicat metoda raportată de Liet al. [23]. Pe scurt, șobolanilor din grupul de control li s-au administrat 2 ml de apă distilată zilnic prin gavaj oral, în timp ce șobolanii din grupul de control.Piatra la rinichigrupului li s-au administrat zilnic 2 ml de soluție de etilenglicol 1% și soluție de NHCl 1% prin gavaj oral. Șobolanii dinPiatra la rinichiplus grupul SB431542 au fost injectați intraperitoneal cu co-solvent SB431542 (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, China) la fiecare 7 zile [24]. Mâncarea și apă au fost furnizate ad libitum. În ziua 14, șobolanii au fost eutanasiați prin supradozaj cu anestezic (pentobarbital de sodiu, 200 mg/kg, prin injecție intraperitoneală) și rinichii lor au fost excizați. Rinichii stângi au fost conservați imediat în azot lichid pentru detectarea ulterioară a proteinei. Rinichii drepti au fost fixați, apoi deshidratați și încorporați în ceară de parafină. Toate studiile pe animale au fost efectuate conform Ghidului National Institutes of Health pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul de etică a utilizării animalelor din cadrul Primului Spital Afiliat al Universității Medicale din Harbin (Număr de aprobare: 2020005, Harbin, China).

Formarea cristalelor în țesutul renal

Probele de țesut au fost colorate folosind metoda Pizzolato [23] și cristale de CaOx au fost observate la un microscop optic cu lumină polarizată (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, China). Regiunile Pizzolato-pozitive au fost măsurate și exprimate ca vârste permill ale suprafeței totale de țesut a secțiunilor transversale folosind ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, SUA).

Detectarea PS în membrana celulelor tubulare renale in vivo prin citometrie în flux

Expunerea la PS a celulelor epiteliale renale a fost evaluată utilizând un test de colorare cu anexină V marcat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), așa cum a fost descris anterior [2]. Celulele au fost observate (în fiecare grup) sub un microscop laser confocal (Olympus, Tokyo, Japonia). Cantitatea de externalizare PS a fost determinată ca procent de celule pozitive pentru anexină V. Fluorescența anexinei V a probelor a fost măsurată folosind un citometru de flux (excitație 488 nm/emisie 530 nm; Beckman Coulter, Brea, CA, SUA).

Măsurarea nivelurilor de TGF- 1 și Smad7 în membrana celulelor tubulare renale prin Western blotting

După recuperarea probelor de țesut congelat, proteina a fost extrasă utilizând kitul de extracție a proteinelor din membrană naturală ProteoExtract(M-PEK)(MERCK Co., Kenilworth, NJ, SUA), iar concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind un test de proteine ​​Bio-Rad. kit (Hercules, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Ulterior, 40ug de proteină au fost încărcate pe un gel SDS-poliacrilamidă 8% (gel de stivuire 100 V, gel de rezoluție 200 V) timp de 1 oră la un curent constant al electrodului de 300 mA. Proteinele din gel au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză (Kexing Co., Beijing, China), blocate timp de 1 oră la 37 de grade în lapte praf degresat 5% și incubate peste noapte la 4 grade C cu TGF 1 anti-șobolan de oaie ( anticorpi ab208466; Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și Smad7 (66.478; Proteintech, Wuhan, China) [25]. S-a adăugat anticorp secundar anti-oaie de iepure marcat cu peroxidază de hrean (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Beijing, China) și incubat la 37 de grade timp de 1 oră. Semnalul a fost detectat folosind reactivul de chemiluminiscență îmbunătățită (Abcam). Benzile pozitive au fost analizate folosind software-ul de analiză a densității optice gel Gel-Pro 4.0 și a fost măsurată densitatea optică cumulativă (valoarea IOD), valoarea R reprezentând conținutul relativ de proteine, după cum urmează: valoarea IOD de referință R{30}} PLSCR (țintă)/valoarea IOD de referință a GAPDH (proteina de referință).

Cultura celulară și interferența ARN

O linie de celule epiteliale renale (celule MDCK, CCL34, pasaje 53-90; ATCC, Manassas, VA, SUA) a fost crescută în mediu Eagle modificat de Dulbecco suplimentat cu antibiotice (10{{1{{14} }}} U/mL penicilină, 100 mg/mL streptomicina; Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA) și 10% ser fetal bovin (Life Technologies Co.) la 37 de grade într-o atmosferă de 5% CO, și subcultivat cu 0,25% tripsină și acid etilendiaminotetraacetic 1 mM (Life Technologies Co., CA, SUA). Celulele au fost tratate cu CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) timp de 2 ore și cu 0,5 mM CaOx și 100 ug/mL anticorp neutralizant anti-TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis) , MN, SUA) timp de 2 ore. Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare.

Pentru a determina rolul eversiei PLSCRin PS, celulele epiteliale tubulare renale au fost transfectate cu siARN PLSCR [26]. siRNA a fost proiectat și sintetizat de Anhui General Biological System (Anhui, China; vezi tabelul 1). LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) a fost utilizat pentru transfecție conform instrucțiunilor producătorului . După 24 de ore de transfecție, celulele au fost digerate cu tripsină, centrifugate la 1000 x g timp de 5 minute, spălate de două ori cu PBS și centrifugate din nou. Supernatantul a fost aruncat, iar peletul a fost suspendat în PBS pentru a forma o suspensie unicelulară de densitate 1 x 10 grade celule/ml. Rata pozitivă a expresiei FAM (carboxifluoresceină) a fost de 93 la sută ± 5 la sută determinată prin citometrie în flux. Pentru a evalua în continuare relația dintre TGF 1 și PLSCR, celulele au fost tratate cu 0,5 mM CaOx sau 10ng/mL TGF- 1 timp de 2 ore și ulterior transfectate cu PLSCR siARN.

Măsurarea nivelului PLSCR în membranele celulelor tubulare renale prin western blot

Proteina a fost extrasă folosind un kit de extracție a proteinelor cu membrană naturală ProteoExtract (Chemical Book Co., Beijing, China), iar concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind un kit de testare a proteinelor Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Beijing, China). Ulterior, 40 ug de proteină au fost încărcate pe un gel SDS-poliacrilamidă 8% (gel de stivuire 100 V, gel de rezoluție 200 V) timp de 1 oră la un curent constant de 300 mA. Proteinele din gel au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză (Kexing Co., Shenzhen, China) și blocate cu lapte degresat 5% timp de 1 oră la 37°C și incubate peste noapte la 4 grade cu anticorp monoclonal PLSCR de oaie anti-șobolan (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, China). S-a adăugat apoi anticorp secundar anti-oaie de iepure marcat cu peroxidază de hrean (1:400) și amestecul a fost incubat la 37 grade C timp de o oră. După spălarea membranei, semnalul a fost detectat cu un reactiv de chemiluminiscență îmbunătățită (Abcam, Guang-zhou, China). Benzile pozitive au fost analizate folosind software-ul de analiză a densității optice Gel-Pro 4.0gel și a fost măsurată valoarea IOD, valoarea R reprezentând conținutul relativ de proteină așa cum este descris mai sus.

Tabelul 1 secvențe siARN pentru PLSCR

Măsurarea distribuției membranei fosfatidilserinei

Cantitatea de eversie PS membrana celulară a fost determinată folosind metoda de stingere a fluorescenței descrisă de Kim și colab.[27] și echipa noastră de cercetare [2], cu nitrobenzen-2-oxa{-1,3-diazol (NBD, Shanghai, China) ca sondă de fluorescență. După marcarea PS din stratul exterior al membranei celulare cu NBD, celulele au fost cultivate în PBS conţinând 5 mM diizopropilfluorofosfat. După aceea, a fost adăugat PBS care conţine oxalat de calciu (1,0 mM) şi celulele au fost incubate la 37 de grade. O cantitate egală de suspensie celulară a fost descărcată la fiecare 10 minute, iar intensitatea fluorescenței a fost înregistrată folosind un spectrofluorometru RF-5000 (Shimadzu, Kyoto, Japonia). Setarile spectrofluorometrului au fost urmatoarele: latimea fantei de 10 nm pentru o lungime de unda de emisie de 530 nm; și lățimea fantei de 5 nm pentru o lungime de undă de excitație de 470 nm. Apoi, valoarea medie a fluorescenței (FT) a fost înregistrată în anii 50. Intensitatea medie de fluorescență redusă (FD) a fost de asemenea înregistrată după utilizarea unei soluții de ditionit pentru a stinge fluorescența NBD din stratul exterior al celulei. După aceea, s-a adăugat 1 procente (g/v) Triton X-100 pentru a permeabiliza membrana celulară. Fluorescența NBD din stratul interior al membranei celulare a fost apoi stinsă și intensitatea fluorescenței (FO) a fost înregistrată. Procentul de NBD-PS din lobulii interiori a fost calculat ulterior folosind următoarea ecuație: procentul de vârstă NBD-PS interiorizat=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Procentul de externalizare PS a fost determinat conform principiului utilizat pentru măsurarea internalizării NBD-PS. Procentul de NBD-PS în lobulii externi a fost de asemenea calculat folosind următoarea ecuație: procentul de NBD-PS în lobulii exteriori=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

analize statistice

Variabilele continue sunt exprimate ca medie±abatere standard. Au fost utilizate un test de sumă de rang pereche non-parametric, testul t și testul chi-pătrat. Toate analizele au fost efectuate folosind software-ul SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA). Rezultate cu P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Rezultate

Semnalizarea TGF- 1/Smad stimulează externalizarea PS in vivo

Formarea cristalelor în țesutul renal al modelului de șobolan

Pentru a stabili un model de șobolan în stadiu incipientPiatra la rinichiformarea, etilenglicol și clorură de amoniu au fost administrate în stomacul șobolanilor timp de 2 săptămâni, apoi fiecare secțiune de rinichi a fost examinată cu un microscop digital. În eșantioanele grupului de control, au fost observate structuri tubulare renale normale fără formare de cristale în ziua 14 (Fig.1A). Când țesutul renal dinPiatra la rinichigrupul a fost observat la microscopie, tubii renali au aparut dilatati cu microcristale vizibile; acumularea ocazională de cristale de CaOx a fost observată în unii tubuli renali, indicând stabilirea cu succes a unui model de șobolan în stadiu incipient.Piatra la rinichiformarea și generarea leziunii celulelor tubulare renale.

Prezența PS în membrana celulelor tubulare renale

Anexina V-FITC, o moleculă fluorescentă care se leagă de PS de pe suprafața celulei, este utilizată pe scară largă pentru a detecta redistribuirea PS. În studiul nostru, celulele MDCK în controlul normal,Piatra la rinichi, șiPiatra la rinichiplus grupurile SB431542 au fost observate la un microscop laser confocal (Fig.1B). Rata de eversiune PS a crescut înPiatra la rinichigrupul comparativ cu cel din grupul de control (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">Piatra la rinichiplus grupul SB431542 a arătat un nivel bazal mai scăzut de externalizare PS decât cei din grupulrinichipiatrăgrup (P<0.05, fig.="" 1c,="">

Măsurarea nivelurilor TGF- 1 și Smad7

Nivelul TGF- 1 înPiatra la rinichigrupul a fost cuantificat prin western blot. Un western blot tipic este prezentat în Fig.2A împreună cu analiza densitometrică a nivelului TGF- 1. Valorile au fost normalizate la cele ale controlului și exprimate ca raport dintre TGF- 1 și tubulină. Adăugarea de etilenglicol și NH Cl a crescut semnificativ nivelul TGF- 1 și a scăzut nivelul Smad7 în comparație cu cele din celulele de control (Fig.2A); totuși, tratamentul cu SB431542 plus etilenglicol și NH Chemat a scăzut semnificativ nivelul TGF- 1 și a crescut nivelul Smad7 în comparație cu cele din celulele tratate cu etilenglicol și NH,Cl.

TGF activează activitatea PLSCR în membrana celulară a tubului renal in vitro

PLSCR

Nivelul PLSCR a fost evaluat prin western blot. Celulele au fost tratate cu CaOx timp de 2 ore. Nivelul PLSCR a fost neglijabil în celulele de control, dar a crescut semnificativ în grupul CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Mișcarea spre interior afectată NBD-PS

Am determinat mișcările spre interior și spre exterior ale PS în membrana celulelor epiteliale tubulare renale pentru a evalua activitatea PLSCR. Pentru a evalua dacă PLSCR influențează mișcarea PS de la foița exterioară la foița interioară a membranei plasmatice, am integrat PS marcat fluorescent (NBD-PS) în prospectul exterior al membranei plasmatice și am monitorizat interiorizarea acestuia (Fig.3). Cantitatea de NBD-PS interiorizată de celulele MDCK în grupele de control și CaOx a fost de aproximativ 46,2 la sută și, respectiv, 17,8 la sută. Prin urmare, rata de internalizare a PS în celulele grupului CaOx a fost semnificativ mai mică decât cea din celulele grupului de control (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Fig. 1 Formarea cristalelor și externalizarea PS au fost observate în grupele martor, calculi renali și calculi renali plus SB431542.

(A) Formarea cristalelor în țesutul renal în ziua 14; săgeata indică structuri microcristaline. (B) Celulele MDCK au fost observate prin microscopie laser confocală.

(C) Diagrame citometrice în flux ale ratei de eversiune. (D) Rata de eversiune (la sută). Triunghiul indică P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">Piatra la rinichigrup

Mișcare NBD-PS îmbunătățită spre exterior

Pentru a determina dacă transportul către exteriorul PS este afectat de oxalat, celulele MDCK au fost marcate intracelular cu NBD-PS și s-a determinat amploarea mișcării sale către prospectul exemple-mic. Mediul de incubare a conținut albumină serică bovină (1 procente g/v), care a extras rapid NBD-PS exprimat la suprafață. Aproximativ 34,5% din NBD-PS a migrat către prospectul exterior în celulele de control, în timp ce rata transferului de PS în exterior în celulele grupului CaOx a fost crescută la 75,3% în comparație cu cea a totalului NBD-PS etichetat interior, care a fost semnificativ mai mare decât că în celulele grupului de control (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Fig.2 Expresia TGF- 1/Smad în grupele martor, calculi renali și pietre la rinichi plus SB431542 și expresia PLSCR în membrana celulelor tubulare renale.

(A)TGF- 1/Expresie Smad. (B) Niveluri relative ale fosfolipidelor scramblase (PLSCR) și blot reprezentativ cu expresia normalizată la cea a GAPDH.P<>

Triunghiul indică P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

CLICK AICI PENTRU PARTEA Ⅱ