HPLC pentru determinarea simultană a patru componente glicozide de feniletanol în bucăți de decoct Cistanche Herba și extracte de Cistanche Tubulosa

Rezumat: Obiectivul acestui studiu este de a stabili acromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)metoda pentru determinarea simultana a patru feniletanol glicozide inCistanches Herba bucăți decoctșiExtracte de Cistanche tubulosa. Condițiile cromatografice au folosit o coloană Inertsil ODS{{{0}} (25{0 mm × 4,6 mm, 5 µm), cu o fază mobilă constând din acetonitril {{{{0},1% acid formic soluție folosind gradient de eluție. Debitul a fost stabilit la 1,0 mL/min, temperatura coloanei a fost menținută la 30 grade și lungimea de undă de detecție a fost de 330 nm cu un volum de injecție de 1{ {27}} µL. Linearitatea zonei de vârf cu concentrații a variat de la 2,53 la 201,60 µg/mL pentru diferite glicozide, cu coeficienți de corelație (r) mai mari de 0,9993. Limitele de detectare (LOD) și cuantificare (LOQ) au fost între 0,2249 și 1,1004 µg/mL și, respectiv, 0,3101 până la 0,8161 µg/mL. Metoda a demonstrat o bună precizie, stabilitate și repetabilitate cu valori RSD mai mici de 3,0%. Ratele medii de recuperare au variat între 97,70% și 100,95%, indicând acuratețea și eficacitatea metodei pentru cuantificarea simultană a acestor componente în probe.

Cuvinte cheie:Cromatografie lichidă de înaltă performanță,Cistanches Herba, bucăți de decoct,Extracte de Cistanche tubulosa, glicozide feniletanol, determinarea conținutului.

HETIAN DICHENCAMERA LIMITĂ MICROBIANĂ

Cistanche, cunoscut și sub numele de Rou Cong Rong și Desert Ginseng, aparține familiei Orobanchaceae și este folosit în medicina tradițională pentru tulpinile sale cărnoase acoperite cu solzi. Parazitează rădăcinile plantelor Chenopodiaceae, cum ar fi Haloxylon și Tamarix, și se găsește în principal în regiunile aride din Mongolia Interioară, Qinghai, Xinjiang și Ningxia din China. A fost listat pentru prima dată în textul clasic pe bază de plante „Shennong Bencao Jing” ca o plantă de calitate superioară. Cistanche are gust dulce și sărat, este cald în natură și este asociat cu meridianele rinichilor și intestinului gros. Este cunoscut pentru beneficiile sale în întărirea rinichilor și yang, hidratarea intestinelor și ameliorarea constipației, protejarea ficatului, anti-îmbătrânire, combaterea oboselii și creșterea imunității. Din punct de vedere clinic, este adesea folosit pentru a trata afecțiuni precum deficiența de rinichi yang, constipația prin deficiență de sânge, infertilitatea la femei, genunchii și spatele slabi și declinul memoriei. Cistanche este venerat ca „Ginsengul deșertului” și un „medicament prețios”.

Planta conține glicozide feniletanol, terpene iridoide, alcaloizi, lignani și alte componente, echinacozidul și actozidul fiind glicozide feniletanol reprezentative cunoscute pentru efectele lor în îmbunătățirea proprietăților yang, anti-îmbătrânire, antioxidante și îmbunătățirea memoriei. Aceste componente reprezintă baza principală pentru efectele medicinale ale Cistanche și sunt, de asemenea, indicatori cheie pentru evaluarea și controlul calității în ediția 2020 a Farmacopeei Chineze.

Au existat rapoarte privind determinarea conținutului de feniletanol glicozide la speciile Cistanche folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), dar acestea s-au limitat la materiale brute și felii Cistanche. În prezent, nu există standarde naționale pentru extractul de Cistanche tubulosa, iar determinarea conținutului acestuia nu a fost raportată. Cercetarea noastră preliminară a constatat că Cistanche tubulosa din Xinjiang conține în principal patru feniletanol glicozide reprezentative: echinacozidă, izoacteozidă, acteozidă și tubulozidă A. Acest studiu a stabilit o metodă HPLC pentru determinarea simultană a acestor patru componente atât în ​​bucățile de decoct Cistanche, cât și în extractele de Cistanche tubulosa, urmărind să evalueze mai bine calitatea bucăților de decoct Cistanche și să ajute la stabilirea standardelor de calitate pentru extractele sale. Raportul este după cum urmează.

1 Instrumente și reactivi

1.1 Instrumente

• Cromatograf lichid de înaltă performanță LC-20AT, inclusiv un detector cu matrice de diode (Shimadzu, Japonia)

• Balanță electronică AB135-S (Mettler Toledo, Elveția)

• KQ-500DE curățător cu ultrasunete (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Sistem de apă ultrapură Aike (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Reactivi

• Substanțe standard de Pinorezinol diglucozidă (număr lot S-003-01904003), izomucronulatol 7-O-glucozidă (număr lot Y-073-11803024), Mucronulatol 7-O-glucozidă (număr lot M{ {6}}) și Tubuloside A (număr de lot G-066-11812016), toate achiziționate de la Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., cu o puritate de peste 98%.

• Acetonitril și metanol de calitate cromatografică, acid formic de calitate analitică, apa a fost ultrapură.

• Patru loturi de bucăți de decoct Cistanches Herba (cod S1, S2 din Mongolia Interioară; cod S3, S4 din Xinjiang) au fost toate achiziționate de la patru farmacii din Urumqi.

• Extractele de Cistanche tubulosa (cod S5, extracție cu apă uscată în felii inactivate cu enzime; cod S6, extracție cu alcool în felii uscate inactivate cu enzime; cod S7, extracție legată de rășină cu alcool în felii uscate inactivate cu enzime) au fost toate achiziționate de la Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co ., Ltd.

2 Metode și rezultate

2.1 Condiții cromatografice

• Coloană cromatografică: coloană Inertsil ODS-3 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Faza mobilă: Acetonitril (A) - 0, 1% soluție apoasă de acid formic (B) cu o eluție în gradient (de la 17% A la 20% A în 0-12 min, 20% A până la 22% A peste 12-30 min, 22% A până la 17% A peste 30-35 min)

• Debit: 1,0 mL/min

• Lungime de undă de detectare: 330 nm

• Temperatura coloanei: 30 de grade

• Volumul de injectare: 10 µL

  

Laboratorul Fizico-chimic Hetia Dichen

2.2 Prepararea soluției

• Soluție standard mixtă: Se cântărește cu precizie fiecare dintre cele patru standarde și se transferă în baloane cotate separate de 10 ml, se aduce la volum cu metanol 50% pentru a obține soluții standard unice cu concentrații de 1,008, 1,011, 1,012 și 1,012 mg/L pentru Pinorezinol diglucozid, Tubulozid A, Mucronulatol 7-O-glucozid și, respectiv, Isomucronulatol 7-O-glucozid. Se măsoară o cantitate adecvată din fiecare, se combină într-un balon cotat de 10 ml, se aduce la volum cu 50% metanol, se amestecă bine pentru a prepara o soluție standard mixtă cu concentrații de 201,60, 50,55, 101,20 și, respectiv, 50,60 µg/mL și se filtrează. printr-un filtru cu membrană de 0,45 µm.

• Soluție de probă: Aproximativ 1,0 g de pulbere de bucată de decoct Cistanches Herba (trecut printr-o sită nr. 4) este cântărit cu precizie și transferat într-un balon cotat de 1{{1{0}}0 ml chihlimbar . Adăugați exact 50 ml de metanol 50%, cântăriți, extrageți ultrasonic timp de 40 de minute cu o putere de 250 W și frecvența de 35 kHz, răciți, cântăriți din nou și completați masa pierdută cu 50% metanol. Se amestecă bine, se filtrează și se colectează filtratul. Treceți printr-un filtru cu membrană de 0,45 µm pentru a obține soluția de probă Cistanches Herba. În mod similar, se prepară soluția de probă de extract de Cistanche tubulosa folosind aproximativ 0,2 g de pulbere de extract.

1. Echinacozidă 2. Tubulozidă A 3. Acteozidă 4. Izoacteozidă A. Soluție mixtă de referință B. Soluție de testare de bucăți de decoct Cistanches Herba C. Soluție de testare de extract de Cistanche Tubulosa

2.3 Examinarea metodologică

Testul de adecvare a sistemului: Au fost prelevate volume adecvate din trei soluții din secțiunea 2.2 în condițiile cromatografice prezentate în secțiunea 2.1 și au fost înregistrate cromatogramele. Rezultatele au indicat că numărul teoretic al plăcii pentru vârful echinacozidului ar trebui să fie nu mai mic de 3000, cu grade de separare mai mari de 1,5, indicând o bună separare de bază. Consultați Figura 1 pentru detalii.

Evaluarea liniarității: volume precise ale soluției mixte de referință din secțiunea 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 și 10.0 mL ) au fost transferate în baloane cotate de 10 mL, aduse la volum cu metanol 50%, amestecate bine și utilizate pentru a crea o serie de soluții mixte de referință. Tocmai 10 µL din aceste soluții au fost injectate în condițiile cromatografice din secțiunea 2.1. Au fost înregistrate zonele de vârf și regresia liniară a fost efectuată utilizând concentrațiile componentelor (X, pg/mL) ca variabilă independentă și zonele de vârf (Y) ca variabilă dependentă. Ecuațiile de regresie și intervalul de liniaritate pot fi găsite în tabelul 1.

Limite de detectare și cuantificare: Au fost prelevate volume precise ale soluției mixte de referință din secțiunea 2.2, diluate în mod corespunzător și analizate în condițiile cromatografice din secțiunea 2.1. Concentrațiile corespunzătoare raporturilor semnal-zgomot de 3:1 și 10:1 au fost utilizate ca limite de detecție și, respectiv, de cuantificare. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1.

Test de precizie: Un volum adecvat de soluție mixtă de referință din secțiunea 2.2 a fost analizat de șase ori consecutiv în condițiile cromatografice din secțiunea 2.1. Valorile RSD pentru zonele de vârf ale echinacozidei, tubulozidei A, actozidei și izoacteozidei au fost de 1,31%, 0,91%, 1,58% și, respectiv, 0,58% (n {{12} }), indicând o bună precizie a instrumentului.

Test de stabilitate: Soluțiile de probe de testare au fost preparate și lăsate la temperatura camerei timp de 0, 2, 4, 6, 8, 12 și 24 de ore înainte de a fi analizate în condițiile secțiunii 2.1. Valorile RSD pentru zonele de vârf ale echinacozidei, tubulozidei A, actozidei și izoacteozidei au fost de 1,84%, 2,18%, 1,05% și, respectiv, 1,55% (n=7), indicând faptul că soluțiile de testare au fost stabile în cameră. temperatura de până la 24 de ore.

Test de repetabilitate: O probă (ID: S2) a fost cântărită cu precizie și împărțită în șase porțiuni. Fiecare porțiune a fost preparată ca soluție de probă de testare conform metodei din secțiunea 2.2 și analizată în condițiile cromatografice din secțiunea 2.1. Conținutul mediu de echinacozidă, tubulozidă A, acteozidă și izoacteozidă a fost de 0,779%, 0.{02{0%, 0,155% și, respectiv, 0,074% , cu valori RSD de 1,21%, 3,12%, 2,65% și 2,96% (n=6), demonstrând o bună repetabilitate a metodei.

Test de recuperare: O cantitate cunoscută de probă (ID: S2) a fost prelevată și împărțită în nouă porții. Fiecare porțiune a fost adăugată cu concentrații scăzute, medii sau mari ale soluțiilor de referință individuale, preparate conform metodei din secțiunea 2.2 și analizate în condițiile cromatografice din secțiunea 2.1. Au fost înregistrate zonele de vârf și au fost calculate ratele de recuperare. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.

Laboratorul HPLC Hetian DiChen

2.4 Determinarea conținutului eșantionului

Au fost preparate volume adecvate din fiecare lot de probe ca soluții de testare conform metodei din secțiunea 2.2, apoi analizate în condițiile cromatografice din secțiunea 2.1. Fiecare probă a fost testată în trei exemplare, au fost înregistrate zonele de vârf și s-a calculat conținutul probelor. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3.

3 Discuție

În acest studiu, a fost folosit un detector cu matrice de diode și au fost efectuate scanări ale soluțiilor de referință mixte și ale soluțiilor de probe de testare în intervalul de lungimi de undă de la 200 la 450 nm. Rezultatele au arătat că echinacozida și acteozida au prezentat absorbție maximă la 330 nm, tubulozida A la 331 nm și izoacteozida la 327 nm. În plus, făcând referire la ediția din 2020 a Farmacopeei Chineze, care specifică o lungime de undă de detecție de 330 nm pentru echinacozidă și acteozidă, s-a observat că multe componente au vârfuri cromatografice semnificative și valori ridicate de răspuns la 330 nm, ducând la selectarea a 330 nm ca lungimea de undă de măsurare finală.

Din rezultatele determinării conținutului bucăților de decoct Cistanches Herba, s-a constatat că echinacozidul a avut cel mai mare conținut atât în ​​Cistanche tubulosa, cât și în desertul Cistanche, urmat de actozidă, în timp ce tubulozida A și izoacteozida au avut conținuturi relativ mai mici. A existat o variabilitate semnificativă în conținutul celor patru componente glicozide de feniletanol și această variabilitate a fost, de asemenea, pronunțată între diferite loturi din aceeași locație sau locații diferite. Această variație poate fi atribuită unor factori precum mediul geografic, temperatura, clima și procesele de recoltare a materiilor prime, care afectează acumularea de constituenți chimici în plante. În timp ce componentele chimice ale Cistanche provenite din origini diferite sunt similare, concentrațiile acestor componente variază, ceea ce duce la diferențe în efectele lor. Prin urmare, este adecvat să se selecteze materiile prime pe baza eficacității lor pentru a obține rezultate clinice mai bune.

Pe scurt, metoda stabilită în acest studiu este simplă, rapidă, precisă și eficientă. Poate fi folosit pentru a determina simultan patru componente glicozide feniletanol în bucăți de decoct Cistanches Herba și extracte de Cistanche tubulosa. Rezultatele determinării conținutului pot reflecta nivelurile de calitate ale diferitelor loturi și ale diferitelor extrase din aceleași locații sau din locații diferite, oferind o bază teoretică pentru stabilirea standardelor de calitate relevante.

Tab. 2 Rezultatele testului de recuperare (n=9)

Tab. 3 Rezultatele determinării conținutului a patru glicozide feniletanoide din probe (%,n=3)

Beneficii Cistanche

Referinte:

1. 中文 (chineză) 1}}.
   英文 (engleză): Comisia Națională de Farmacopee. Farmacopeea Republicii Populare Chineze (Vol. 1) [M]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2020: 140-141.

2. 中文 (chineză): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (engleză): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng și colab. Studiu comparativ asupra amprentelor de Cistanche deserticola și Cistanche tubulosa [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (chineză): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (engleză): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui și colab. Comparația dintre Cistanche deserticola și Cistanche tubulosa [J]. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (chineză): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (engleză): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei și colab. Studiu asupra efectelor laxative și tonifiante rinichi-yang ale Cistanche deserticola și Cistanche tubulosa [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (chineză): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (engleză): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu și colab. Efectele Cistanche deserticola înainte și după procesare asupra funcției anti-îmbătrânire și imune la șobolani model în vârstă [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (chineză): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (engleză): Wu Bo, Fu Yumei. Studiu asupra efectului anti-peroxidare a lipidelor al glicozidelor Cistanche la șoareci în vârstă subacută [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (chineză): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (engleză): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying și colab. Studiu asupra efectului glicozidelor Cistanche asupra funcției de învățare și memorie la șoarecii normali [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (chineză): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (engleză): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Dezvoltarea industriei ecologice Cistanche deserticola pentru a promova civilizația ecologică în zonele deșertice vestice [J]. Modern Chinese Medicine, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (chineză): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (engleză): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei și colab. Analiza calitativă a glicozidelor și polizaharidelor feniletanoide din Cistanche deserticola de diferite origini [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (chineză): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (engleză): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu și colab. Determinarea componentelor active în Cistanche deserticola prin cromatografie lichidă ultraperformanță-spectrometrie de masă cu triplu quadrupol în tandem [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (chineză): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (engleză): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Studiu asupra tehnologiei de extracție rapidă a echinacozidei și verbascozidei în Cistanche deserticola [J]. Cercetare și dezvoltare în domeniul alimentar, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (chineză): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (engleză): Yu Yifan. Progresul cercetării privind constituenții chimici și activitățile farmacologice ale Cistanche [J]. Chemical Management, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (chineză): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (engleză): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Efectul Cistanche deserticola asupra anti-oboselii și memoriei la șoareci [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (chineză): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (engleză): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu și colab. Progresul cercetării privind constituenții chimici și efectele farmacologice ale Cistanche deserticola și analiza de predicție a markerilor săi de calitate [J]. Jurnalul Universității Liaoning de Medicină Tradițională Chineză, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (chineză): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (engleză): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Efectul Cistanche deserticola asupra factorilor imunitari și proteinelor legate de apoptoză la șobolani cu insuficiență ovariană prematură [J]. Jurnalul Chinez de Farmacologie Clinică, 20