Veziculele extracelulare hipoxice derivate din celule stem mezenchimale ameliorează fbroza renală după leziunea de ischemie-reperfuzie prin restabilirea oxidării acizilor grași mediată de CPT1A

Abstract

1. Fundal

Fibroza renală este un proces patologic comun al bolilor cronice de rinichi induse de factori multipli. Pretratamentul hipoxic al celulelor stem mezenchimale poate spori eficacitatea veziculelor extracelulare secretate (MSC-EVs) în diferite boli, dar nu este clar dacă acestea pot îmbunătăți mai bine fibroza renală. Cele mai recente cercetări au arătat că recuperarea oxidării acizilor grași (FAO) poate reduce fibroza renală. În acest studiu, ne-am propus să examinăm dacă pretratamentul hipoxic cu vezicule extracelulare MSC (Hypo-EV) poate îmbunătăți FAO pentru a restabili fibroza renală și a investiga mecanismul de bază.

2. Metode

Hipo-EV-urile au fost izolate din MSC derivate din placenta umană pretratată cu hipoxie (hP-MSC), iar Norm-EV-urile au fost izolate din hP-MSC cultivate în condiții normale. Am folosit modelul de fibroză renală indusă de ischemie-reperfuzie (I/R) in vivo. Șoarecii au fost injectați cu PBS, Hypo-EV-uri sau Norm-EV-uri imediat după intervenție chirurgicală și în ziua 1 post-operație. Funcția renală, patologia renală și fibroza renală au fost evaluate pentru evaluarea leziunilor renale. Pentru explorarea mecanică, oxidarea acizilor grași (FAO), modificările morfologice mitocondriale, producția de ATP și proteinele de masă mitocondriale au fost detectate in vivo. Potențialul membranei mitocondriale și producția de specii reactive de oxigen (ROS) au fost investigate in vitro.

3. Rezultate

Am descoperit că Hypo-EV conferă un efect terapeutic superior asupra recuperării leziunilor structurii renale, restabilirii funcției renale și reducerii fibrozei renale. Între timp, Hypo-EV-urile au îmbunătățit FAO mitocondrial în rinichi prin restabilirea expresiei unei enzime-cheie care limitează rata FAO, carnitina palmitoil-transferaza 1A (CPT1A). Din punct de vedere mecanic, îmbunătățirea homeostaziei mitocondriale, caracterizată prin repararea structurii mitocondriale, restaurarea masei mitocondriale și a producției de ATP, inhibarea stresului oxidativ și creșterea potențialului membranei mitocondriale, explică parțial efectul Hypo-EV-urilor asupra îmbunătățirii FAO mitocondriale și astfel atenuarea I/ R deteriorare.

4. Concluzii

Hipo-EV-urile suprimă fibroza renală prin restabilirea FAO mitocondrială mediată de CPT1A, efecte care pot fi obținute prin reglarea homeostaziei mitocondriale. Descoperirile noastre oferă un mecanism suplimentar de sprijin pentru dezvoltarea terapiei fără celule pentru fibroza renală.

5. Cuvinte cheie

Celula stem mezenchimale, hipoxică, vezicule extracelulare, mitocondriale, oxidarea acizilor grași, fibroză renală.

Click aici pentru a cumpara suplimentul Cistanche

Introducere

Boala cronică de rinichi (CKD) este o boală gravă care amenință sănătatea umană și este, de asemenea, o problemă publică globală importantă. Incidența globală, prevalența și decesul CKD sunt semnificative și în creștere, iar prevalența este de aproximativ 10% în rândul adulților din întreaga lume [1, 2]. Leziunea de ischemie-reperfuzie renală (I/R) este asociată cu fibroză renală și CKD progresivă [3, 4]. Fibroza renală este considerată un proces patologic obișnuit care duce la CKD și la boală renală în stadiu terminal. Cu toate acestea, în prezent nu există terapii eficiente care să prevină sau să inverseze cu succes fibroza [5].

Veziculele extracelulare derivate din celule stem mezenchimale (MSC-EVs) au fost raportate că joacă un rol regenerativ și antifibrotic în mai multe modele preclinice de CKD [6–9]. Cu toate acestea, randamentul scăzut al MSC-EV-uri este un factor limitator pentru producția la scară largă de terapii fără celule [10]. Precondiționarea hipoxiei stimulează activitățile paracrine ale MSC și crește funcția și producția de EV și este considerată o abordare de inginerie pentru îmbunătățirea potențialului terapeutic al EV [11, 12]. Un studiu recent a indicat că MSC-urile precondiționate de hipoxie sunt mai semnificative decât MSC-urile netratate în prevenirea fibrozei și inflamației renale [13]. Cu toate acestea, rolul EV-urilor derivate din MSC precondiționate de hipoxie în fibroza renală nu a fost încă stabilit.

Mecanismul patologic al fibrozei renale a fost revizuit în multe studii recente [14–16], în special în domeniul reglării metabolice [17]. Este bine cunoscut faptul că celulele tubulare proximale (PTC) sunt celulele cele mai solicitante de energie din rinichi și joacă un rol central în progresia fibrozei tubulointerstițiale [18, 19]. Oxidarea acizilor grași (FAO) este sursa primară de energie a PTC [19, 20]. Rezultatele studiilor de transcriptom la nivelul genomului au arătat că expresia enzimelor metabolice cheie și a regulatorilor de transcripție legate de FAO a fost semnificativ scăzută la modelele umane și de șoarece cu fibroză tubulointerstițială [20]. În plus, restabilirea metabolismului acizilor grași poate proteja șoarecii de fibroza tubulointerstițială [17, 20]. Un studiu recent a confirmat că supraexprimarea enzimei cheie limitatoare de viteză carnitin palmitoil-transferaza 1A (CPT1A) poate îmbunătăți FAO în celulele epiteliale tubulare renale, poate reduce expresia mediatorilor inflamatori și poate duce la atenuarea semnificativă a fibrozei în trei modele experimentale [21] ]. Prin urmare, terapiile vizate de FAO pot fi o strategie terapeutică potențial eficientă pentru reducerea fibrozei.

Mitocondriile joacă un rol indispensabil în reglementarea FAO. Un studiu anterior a indicat că astragalozidul IV poate îmbunătăți FAO prin reglarea activității mitocondriale în timpul îmbătrânirii [22]. Distrugerea homeostaziei mitocondriale joacă un rol important în afectarea precoce a bolii renale, repararea anormală după leziune și patogeneza CKD [23, 24]. În condiții fiziologice și patologice, diferite mecanisme se coordonează pentru a menține homeostazia mitocondrială, inclusiv apărarea antioxidantă, repararea ADN-ului mitocondrial, fuziunea și fisiunea mitocondrială, autofagia mitocondrială și biogeneza mitocondrială [25]. Mai multe studii au arătat că MSC-EV-urile pot atenua daunele mitocondriale prin stabilizarea ADN-ului mitocondrial [26], inhibarea fisiunii mitocondriale și stimularea apărării mitocondriale antioxidante și producția de adenozin trifosfat (ATP) în modelele de leziune renală acută (AKI) [27, 28] . Studiile anterioare au indicat că tratamentul cu Hypo-EVs a avut efecte mai bune asupra promovării angiogenezei, proliferării și migrației și inhibând inflamația și apoptoza decât tratamentul cu Norm-EVs [29-31]. Cu toate acestea, cercetătorii nu au determinat în mod concludent dacă rezultatele terapeutice ale Hypo-EV în fibroză depind de homeostazia mitocondrială.

Scopurile acestui studiu au fost (1) să exploreze dacă pretratamentul hipoxic al veziculelor extracelulare derivate din MSC (Hypo-EVs) are un efect mai bun anti-fibroză; (2) pentru a determina dacă Hypo-EV-urile ameliorează fibroza indusă de reperfuzie de ischemie prin îmbunătățirea FAO mediată de CPT1A; (3) să examineze dacă efectul protector al Hypo-EV-urilor asupra FAO este legat de reglarea homeostaziei mitocondriale.

Pudra de Cistanche

Metode

1. Cultura celulară și precondiționarea hipoxiei

MSC derivate din placenta umană (hP-MSC) au fost furnizate de Institutul Fundației, Academia Chineză de Științe Medicale și cultivate în mediu Dulbecco modificat/amestec de nutrienți F-12 (DMEM/F12, Gibco) cu 10% Ser fetal bovin (FBS, Corning) suplimentat cu 100 U/mL penicilină-streptomicina (Gibco) și menținut la 37 de grade într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. După ce hP-MSC a atins o confluență de 60% -70%, mediile de cultură au fost înlocuite cu FBS sărăcit în exozomi (SBI, 50A-1) și au fost cultivate la 37 de grade, 5% CO2, 21% O2 sau la 1% la sută O2, 94 la sută N2 și 5 la sută CO2 pentru încă 48 de ore. Mediul a fost apoi colectat pentru izolarea EV, iar EV-urile colectate din pretratarea hipoxică a MSC (1% O2) au fost numite Hypo-EV, iar MSC-ul normal (21% O2) a fost numit Norm-EV. Doar hP-MSC din pasajele 6-10 au fost folosite pentru experimente ulterioare.

2. Cultură celulară și tratament

Celulele epiteliale tubulare proximale renale umane (HK-2, ATCC, SUA) au fost cultivate în DMEM/F12 cu 10% FBS și suplimentate cu 100 U/mL penicilină-streptomicină. Celulele au fost menținute la 37 de grade într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2. Am folosit două abordări pentru a imita CKD in vitro. Modelul de hipoxie/reoxigenare celulară (H/R) a fost realizat așa cum a fost raportat anterior [32]. Pe scurt, celulele HK-2 au fost expuse unei stări hipoxice (37 de grade, 1% O2, 94% N2 și 5% CO2) timp de 12 ore în mediu fără glucoză și ser pentru a induce leziuni hipoxice. Ulterior, mediul a fost înlocuit și celulele au fost plasate în condiții normale (21 la sută O2) pentru reoxigenare 24 de ore. Grupul de control a fost cultivat în condiții normale (21 la sută O2) conform designului experimental. O altă metodă a fost incubarea celulelor HK-2 cu factor de creștere transformant beta-1 (TGF{- 1) la o concentrație finală de 10 ng/mL timp de 48 de ore, așa cum a fost raportat anterior [13]. În timpul reoxigenării sau timpului stimulat cu TGF- 1-, au fost adăugate celulelor Norm-EV sau Hypo-EV (100 ug/mL de mediu nutritiv).

3. Izolarea și identificarea MSC‑EV

EV-urile derivate din MSC au fost izolate folosind o metodă de ultracentrifugare diferențială. Pe scurt, mediul de cultură a fost centrifugat la 4 grade, după cum urmează: 500×g timp de 10 min, la 2,000×g timp de 20 min și 10,000×g timp de 30 min. Mediul a fost filtrat printr-un filtru de 0,22-μm înainte de ultracentrifugare la 100,000xg timp de 2 ore. În cele din urmă, granulele EV au fost resuspendate în PBS și ultracentrifugate pentru încă 2 ore pentru a elimina proteinele contaminante, iar apoi EV-urile purificate au fost recoltate în PBS și depozitate la -80 de grade pentru utilizare ulterioară. Concentrațiile de proteine ​​ale Norm-EV și Hypo-EV au fost examinate utilizând un test de proteine ​​​​acid bicinchoninic (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Structura tipică a membranei bistrate în formă de sferă a EV-urilor a fost observată folosind microscopia electronică cu transmisie (TEM). Western blotting a fost folosit pentru a examina calitatea EV-urilor, iar distribuția de dimensiune a EV-urilor a fost examinată prin împrăștiere dinamică a luminii (DLS).

Cistanche tubulosa

4. Experimente pe animale

Șoarecii masculi C57BL/6 SPF (7-9 săptămâni) au fost furnizați de Sibeifu Experimental Animal Science and Technology (Beijing, China) și au fost hrăniți adaptiv timp de 4 zile în centrul pentru animale de la Spitalul General Chinez PLA înainte de experiment. Șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în patru grupuri: grupele de control, soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), Norm-EVs și Hypo-EVs. Șoarecii din grupurile PBS, Norm-EVs și Hypo-EVs au fost supuși la ischemie-reperfuzie renală așa cum s-a descris anterior [33, 34]. Pe scurt, șoarecii au fost anesteziați cu pentobarbital (50 mg/kg) prin injecție intraperitoneală. Părul dorsal de deasupra rinichiului de șoarece a fost curățat și apoi au fost expuse vasele pediculelor renale bilaterale. Pentru a induce ischemie renală, artera renală stângă a fost fixată cu o clemă vasculară netraumatică timp de 30 de minute și rinichiul drept a fost îndepărtat simultan. Ulterior, reperfuzia a fost inițiată prin eliberarea clemei. Rinichii au fost observați timp de 5 minute pentru a asigura reperfuzia după îndepărtarea clemei. Masa de operație și temperatura camerei au fost menținute la 37 de grade în timpul intervenției chirurgicale. În modelele de tratament, 100 ug de Norm-EVs sau Hypo-EVs în 0,15 ml de solvent PBS au fost administrate prin injectare în vena coadă imediat după intervenție chirurgicală și ziua (D) 1 postoperație în grupurile Norm-EVs și, respectiv, Hypo-EVs. Același volum de PBS a fost administrat prin injectare în vena cozii în grupul PBS. Șoarecii au fost uciși la D 2, D 7 și D 14 după intervenție chirurgicală (Fig. 1a).

5. Internalizarea MSC‑EV

Pentru a verifica dacă EV-urile ar putea fi internalizate de rinichii răniți. Colorarea fluorescentă Dil (Yeasen) a fost efectuată pentru a marca EV-urile. Norm-EV-urile sau Hypo-EV-urile (200 ug) care au fost dizolvate în 100 μL de PBS au fost incubate cu 4 μM de Dil la 37 de grade timp de 1 oră. Coloranții nelegați au fost apoi îndepărtați folosind o coloană de spin exosome (Invitrogen). Di/Norm-EV-urile și Dil/Hypo-EV-urile au fost suspendate în PBS pentru utilizare ulterioară. Dil/Norm-EVs sau Dil/HypoEVs (100 ug) au fost injectate intravenos într-un model de șoareci cu leziuni de ischemie-reperfuzie (I/R) prin vena cozii imediat după intervenție chirurgicală și pe D 1 după operație, așa cum s-a menționat mai sus. În zilele 1, 3, 5 și 7, șoarecii au fost fotografiați imediat folosind Living Image Software 4.4 (PerkinElmer). Mai mult, rinichii au fost colectați și observați pe un sistem de imagistică optic pe D 7. Toate semnalele de imagistică de bioluminiscență (BLI) au fost măsurate prin radiația medie din regiunile de interes (ROI).

6. Microscop electronic cu transmisie (TEM)

Un total de 1 mm3 de țesut renal a fost fixat în 2,5% glutaraldehidă (pH 7,4) la 4 grade timp de 24 de ore. Apoi, țesutul a fost fixat cu acid osmiu 1% timp de 2-3 ore, deshidratat cu acetonă și etanol și încorporat cu rășină epoxidica. După aceea, un ultramicrotom a fost folosit pentru a prepara secțiuni ultrasubțiri cu o grosime de 60 nm, care au fost apoi colorate cu 3% acetat de uranil și citrat de plumb. În cele din urmă, secțiunea a fost observată sub un TEM (Japonia).

7. Analiza funcției renale

O probă de sânge a fost colectată din vena cozii pe D 3, iar nivelurile de azot ureic din sânge (BUN) la șoareci au fost testate folosind un kit adecvat (Biotest).

8. Evaluarea histopatologică renală

Țesuturile renale au fost fixate în formol 10% timp de 48 de ore, încorporate în parafină, secţionate la o grosime de 3 μm, colorate cu reactivi de colorare Masson printr-un protocol standard și observate folosind un microscop (Olympus, Tokyo, Japonia). Procentul de suprafață de depunere de colagen a fost calculat folosind software-ul ImageJ. Au existat cel puțin 10 câmpuri aleatorii care nu se suprapun pentru fiecare animal pentru punctaj.

9. Imunohistochimie

Secțiunile de rinichi încorporate în parafină au fost pretratate utilizând recuperarea antigenului mediată de căldură cu tampon citrat de sodiu (pH 6, soluție de extragere a epitopului 1) timp de 20 de minute, urmată de incubare cu anticorpi primari peste noapte la 4 grade. Secțiunile au fost apoi incubate cu un anticorp secundar biotinilat și 3,3'-diaminobenzidină (DAB) a fost utilizată ca cromogen. Secțiunile au fost apoi colorate cu hematoxilină și observate cu un microscop optic. Anticorpii primari utilizați au fost după cum urmează: CPT1A (ab128568, Abcam) și Vimentin (ab92547, Abcam).

10. Imunofluorescență

Celulele sau țesuturile au fost permeabilizate cu 0,2% Triton X-100 timp de 5 minute, blocate cu ser de oaie timp de 30 de minute și incubate cu actină musculară netedă (-SMA, 1:200, 55135, Anticorp Proteintech) sau colagen I (1:100, ab270993, Abcam) timp de 16-18 ore la 4 grade, urmat de incubare cu anticorp secundar conjugat cu Cy3 (roșu) la temperatura camerei timp de 1 oră. Nucleii au fost contracolorați cu DAPI. Colorarea fluorescentă a secțiunilor de țesut a fost fotografiată prin microscopie confocală de fluorescență.

11. Analiza Western blot

Rinichii, celulele sau peletele EVs au fost lizate în tampon de liză RadioImune Precipitation Assay (RIPA) care conține fluorură de fenilmetilsulfonil (PMSF), iar suspensia supernatantă obținută după centrifugare a fost măsurată folosind un kit de analiză a proteinei BCA (Thermo Fisher Scientific). Probe de proteine ​​de aceeași calitate (20 ug/bandă) au fost adăugate la un gel de poliacrilamidă de dodecil sulfat de sodiu cu 10% sau 12% (SDS-PAGE) și apoi transferate din gelurile SDS-PAGE pe membrane. Membrana a fost blocată timp de 2 ore la temperatura camerei cu o soluție de cazeină 1X și apoi incubată cu anticorpi primari la 4 grade împotriva următoarelor proteine: -SMA (ab7817, Abcam), vimentină (ab92547, Abcam), gliceraldehidă 3- fosfat dehidrogenază (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), actină ({20536-1-AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), complex succinat dehidrogenază de sulf de fier subunitatea B (SDHB) , 10620-1-AP, Proteintech), subunitatea IV de citocrom c oxidază (COXIV, ab202554, Abcam) și ATPB ({17247-1-AP, Proteintech). Membrana a fost apoi incubată cu anticorpul secundar corespunzător timp de 1,5 ore la temperatura camerei și spălată de trei ori. Imaginile au fost analizate folosind software-ul ImageJ.

12. Reacție cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (RT-qPCR)

Mai întâi, ARN-ul a fost extras din celulele lizate sau din țesutul renal folosind reactiv Trizol (Invitrogen), iar apoi ARN-ul a fost sintetizat la cADN conform instrucțiunilor producătorului folosind kitul ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). Reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real a fost efectuată utilizând SYBR Select Master Mix (Life Technologies) și un sistem de detectare RT-qPCR (ABI). Primerii pentru următoarele gene au fost sintetizați: PPAR înainte TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, invers GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 înainte AATGCAGCGGTCTTAGCACT, inversă CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, inversă CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 înainte CATCGT ACCCACCATGCACT, inversă CTCCTTCCCAATGCC GTTCT, 18S AGCTATCATGACCCAGTG inversă și expresia inversă a GCTATCATGCATGCAGG, fiecare genă țintă a fost normalizată de gena 18S și calculată de 2-ΔΔCT metodă.

13. Măsurarea potențialului membranei mitocondriale

Potențialul membranei mitocondriale (MMP) a fost detectat folosind JC-1 (Beyotime). Mai întâi, soluția de lucru pentru colorarea JC-1 a fost obținută prin adăugarea a 8 ml de apă ultrapură pentru fiecare 50 μL de JC-1 (200X), care a fost agitată violent pentru a se dizolva complet, și apoi 2 ml de JC{{ S-a adăugat 7}} tampon de colorare (5X). În al doilea rând, celulele dintr-o placă cu șase pori au fost spălate de două ori în PBS, apoi s-a adăugat 1 ml de soluție de lucru de colorare JC-1 și s-a lăsat timp de 20 de minute la 37 grade C. În cele din urmă, celulele au fost spălate din nou cu PBS. şi s-au adăugat 2 ml de soluţie de cultură celulară. Imaginile vizualizate au fost obținute cu ajutorul microscopiei cu fluorescență.

Cistanche capsule

14. Detectarea speciilor reactive de oxigen mitocondriale (ROS).

Generarea ROS mitocondrială a fost măsurată prin microscopie cu fluorescență folosind Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). Soluția de lucru cu reactiv MitoSOX (2,0 mL, 5 μM) a fost adăugată pentru a acoperi celulele din plăcile cu șase pori, urmată de colorarea cu MitoSOX Red timp de 10 minute la 37 de grade. Apoi, celulele au fost spălate cu PBS de trei ori, iar imaginile vizualizate au fost obținute folosind microscopie cu fluorescență.

15. Detectarea ATP

Producția de ATP a fost determinată prin trusa de testare ATP îmbunătățită (Beyotime, China, Cat. No: S0027) conform protocolului producătorului.

16. Analiză statistică

Cuantificarea și graficele au fost analizate folosind GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, SUA) și prezentate ca medie ± eroarea standard a mediei. Diferențele dintre mai multe grupuri au fost analizate folosind analiza varianței (ANOVA), iar semnificația statistică a fost stabilită la P < 0.05.

Discuţie

În acest studiu, ne-am concentrat pe FAO în fibroza renală și am identificat enzimele metabolice (CPT1A) și regulatorii de transcripție (PGC1, PPAR) ai FAO, ceea ce a indicat că Hypo-EV-urile pot inversa tulburarea metabolismului acizilor grași în rinichiul fibrotic cauzată de I. /R. Mai mult, am descoperit că Hypo-EV-urile exercită un efect profund asupra FAO mediată de CPT1A, care este parțial atribuită reglării homeostaziei mitocondriale.

În ultimii ani, un număr tot mai mare de studii au raportat efectul protector renal al modelelor MSC-EV in vivo de CKD și o cantitate mică de date disponibile au demonstrat că EV-urile au fost superioare sau la fel de eficiente în renoprotecție în comparație cu MSC-ul părinte [43] . Tratamentul MSC-EVs în CKD este la început, iar mecanismul complex nu a fost pe deplin demonstrat. AKI este unul dintre factorii majori ai CKD, care duce la stadiul final de boală renală [44], iar leziunea renală I/R este un factor major pentru AKI, așa că selectăm modelul de fibroză indusă I/R pentru a descoperi mecanismul molecular potențial care modul în care MSC-EV previne fibroza renală.

Randamentul scăzut al MSC-EV-uri este un factor limitator pentru producția pe scară largă de terapii fără celule. Astfel, au fost studiate diferite abordări potențiale de creștere a randamentului EV, inclusiv optimizarea condițiilor de cultură MSC, schele tridimensionale bazate pe matrice extracelulară și reglarea biogenezei EV [10]. Printre acestea, condiționarea hipoxică a MSC este o metodă validă pentru a crește efectul tratamentului cu EV în diferite boli, cum ar fi vindecarea fracturilor osoase [30], vindecarea rănilor diabetice [29] și repararea miocardului [45]. Studiul nostru oferă dovezi pentru acțiunea îmbunătățită de hipoxie a EV secretate de MSC. Mai mult, arătăm, de asemenea, că EV-urile hipoxice precondiționate derivate din MSC au un efect anti-fibroză și de protecție renală mai mare decât Norm-EV-urile în CKD indusă de I/R. Datele privind miARN-urile din Hypo-EV în comparație cu Norm-EV-urile au fost bine raportate. Numeroase studii au raportat că conținutul de miARN a fost responsabil pentru efectele benefice ale Hypo-EV în multe boli [30, 46]. În comparație cu Norm-EV-urile, 215 miARN-uri au fost reglați în sus și 369 miARN-uri subreglați în Hypo-EV-uri derivate din adipos, care reglează în principal metabolismul celular, diferențierea și funcția TGF [29]. Cu toate acestea, mecanismul prin care Hypo-EV-urile reglează funcția metabolismului rămâne prost înțeles în CKD. Un corp mare de literatură indică faptul că FAO este redusă în fibroza renală și contribuie la patogeneza acesteia [47]. În conformitate cu rapoartele, studiul nostru a arătat că expresia genică a enzimelor metabolice cheie legate de FAO (CPT1A, CPT2 și ACOX2) și factorii de reglare a transcripției FAO (PPAR și PGC1) au fost semnificativ scăzute în fibroza renală indusă de I/R.

Mai mult, restabilirea metabolismului lipidic este o strategie potențială pentru tratarea fibrozei renale [48]. Supraexprimarea CPT1A în tubii renali contribuie semnificativ la câștigul funcției în FAO și are ca rezultat protecția funcției renale și a fibrozei prin prevenirea disfuncției mitocondriale, diferențierea TEC și inflamația în modelele animale CKD [21]. Datele noastre au arătat că Hypo-EV-urile ar putea inversa FAO deteriorat în fibroza indusă de I/R, ceea ce sugerează că efectele terapeutice ale Hypo-EV în fibroza renală sunt parțial rezultatul restabilirii FAO.

Insuficiența semnalizării PPAR renale a scăzut activitatea căii FAO și a agravat dezvoltarea fibrozei renale [49]. Administrarea de fenofibrat, un agonist PPAR, a restabilit defectul de oxidare a grăsimilor și fibroza tubulointerstițială în CKD [50, 51]. PGC-1 este un coactivator al PPAR în controlul transcripțional al capacității FAO mitocondriale [39]. Am investigat dacă HypoEV-urile pot crește semnalizarea PPAR și pot restabili FAO în leziuni I/R. Rezultatele noastre au arătat că nu au existat diferențe evidente în expresia PGC-1 și PPARa între Norm-EV și Hypo-EV. Prin urmare, trebuie să existe și alți factori care favorizează apariția acestui proces. Mitocondriile sunt puterea pentru FAO pentru a genera energie pentru celulă [52]. Disfuncția mitocondrială este critică în patogenia fibrozei renale [53]. Restaurarea homeostaziei mitocondriale a apărut ca o strategie terapeutică promițătoare pentru a preveni leziunile renale și pentru a accelera repararea rinichilor [25]. Studii recente au indicat că MSC-EV-urile au un efect protector asupra leziunilor mitocondriale cauzate de AKI, care protejează TEC-urile împotriva insultei prin reducerea fragmentării mitocondriale, normalizarea potențialului membranei mitocondriale și inversarea deleției mitocondriale și a defectelor OXPHOS mitocondriale [26, 27]. Rezultatele noastre au arătat că tratamentul cu Hypo-EVs a recuperat o schimbare anormală a morfologiei mitocondriale, a crescut masa mitocondrială și a îmbunătățit funcția mitocondrială în rinichii fibrotici. Descoperirile noastre indică faptul că efectele Hypo-EV asupra FAO pot fi obținute prin reglarea homeostaziei mitocondriale.

Există unele limitări în studiul nostru. De exemplu, datele noastre demonstrează că Hypo-EV-urile au efecte antifibrotice mai bune la șoarecii cu leziuni I/R decât Norm-EV. Cu toate acestea, nu am determinat expresia diferențială a conținutului dintre Norm-EV și Hypo-EV și nici nu am evaluat modul specific prin care Hypo-EV afectează homeostazia mitocondrială în acest studiu.

Cistanche beneficiază

Concluzii

În rezumat, datele noastre indică faptul că Hypo-EV-urile inhibă semnificativ fibroza renală prin restabilirea FAO mediată de CPT1, iar aceste efecte pot fi obținute prin reglarea homeostaziei mitocondriale. Descoperirile noastre oferă un sprijin mecanic suplimentar pentru dezvoltarea terapiei fără celule pentru fibroza renală.

Referințe

1. Kalantar-Zadeh K, Jafar TH, Nitsch D, Neuen BL, Perkovic V. Boală cronică de rinichi. Lancet. 2021;398(10302):786–802.

2. Xie Y, Bowe B, Mokdad AH, Xian H, Yan Y, Li T, Maddukuri G, Tsai CY, Floyd T, Al-Aly Z. Studiul Analysis of the Global Burden of Disease evidențiază global, regional și național tendințe ale epidemiologiei bolii renale cronice din 1990 până în 2016. Kidney Int. 2018;94(3):567–81.

3. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Leziuni renale acute. Lancet. 2019;394(10212):1949–64.

4. Zheng Z, Li C, Shao G, Li J, Xu K, Zhao Z, Zhang Z, Liu J, Wu H. Repararea dezadaptativă tubulară mediată de Hippo-YAP/ MCP-1 promovează inflamația în recuperarea eșuată renală după AKI ischemic. Moartea celulară Dis. 2021;12(8):754.

5. Yan H, Xu J, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Definirea țintelor terapeutice pentru fibroza renală: exploatarea biologiei patogenezei. Biomed Pharmacother. 2021;143:112115.

6. Shi Z, Wang Q, Zhang Y, Jiang D. Veziculele extracelulare produse de celulele stem mezenchimale din măduva osoasă atenuează fibroza renală, în parte prin inhibarea căii RhoA/ROCK, într-un model de șobolan UUO. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):253.

7. Kholia S, Herrera Sanchez MB, Cedrino M, Papadimitriou E, Tapparo M, Deregibus MC, Bruno S, Antico F, Brizzi MF, Quesenberry PJ, Camussi G. Veziculele extracelulare derivate din celule stem mezenchimale ameliorează leziunea renală la nephistolochic acid. . Front Cell Dev Biol. 2020;8:188.

8. Birtwistle L, Chen XM, Pollock C. vezicule extracelulare derivate din celule stem mezenchimale pentru salvarea leziunii renale. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6596.

9. Huang Y, Yang L. Celulele stem mezenchimale și veziculele extracelulare în terapia împotriva bolilor de rinichi. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):219.

10. Phan J, Kumar P, Hao D, Gao K, Farmer D, Wang A. Ingineria celulelor stem mezenchimale pentru a-și îmbunătăți eficacitatea și randamentul exozomului pentru terapia fără celule. J Vezicule extracelulare. 2018;7(1):1522236.

11. Bister N, Pistono C, Huremagic B, Jolkkonen J, Giugno R, Malm T. Hipoxia și veziculele extracelulare: o revizuire a metodelor, încărcăturii veziculare și funcțiilor. J Vezicule extracelulare. 2020;10(1): e12002.

12. Yang Y, Lee EH, Yang Z. Celule stem mezenchimale condiționate de hipoxie în aplicarea de regenerare a țesuturilor. Tissue Eng Partea B Rev 2021.

13. Ishiuchi N, Nakashima A, Doi S, Yoshida K, Maeda S, Kanai R, Yamada Y, Ike T, Doi T, Kato Y, Masaki T. Celulele stem mezenchimale precondiționate de hipoxie previn fibroza renală și inflamația în ischemie-reperfuzie şobolani. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):130.

14. Panizo S, Martinez-Arias L, Alonso-Montes C, Cannata P, Martin-Carro B, Fernandez-Martin JL, Naves-Diaz M, Carrillo-Lopez N, Cannata-Andia JB. Fibroza în boala cronică de rinichi: patogeneză și consecințe. Int J Mol Sci. 2021;22(1):408.

15. Humphreys BD. Mecanismele fibrozei renale. Annu Rev Physiol. 2018;80:309–26.

16. Nastase MV, Zeng-Brouwers J, Wygrecka M, Schaefer L. Targeting renal fibrosis: mechanisms and drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev. 2018;129:295–307.

17. Zhao X, Kwan JYY, Yip K, Liu PP, Liu FF. Vizând dereglarea metabolică pentru terapia fibrozei. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(1):57–75.

18. Qi R, Yang C. Celulele epiteliale tubulare renale: mediatorul neglijat al fibrozei tubulointerstițiale după leziune. Moartea celulară Dis. 2018;9(11):1126.

19. Gewin LS. Fibroza renală: primatul tubului proximal. Matrix Biol. 2018;68:248–62.

20. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, Chinga F, Park AS, Tao J, Sharma K, Pullman J, Bottinger EP, Goldberg IJ, Susztak K. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells are un rol cheie în dezvoltarea fibrozei renale. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

21. Miguel V, Tituana J, Herrero JI, Herrero L, Serra D, Cuevas P, Barbas C, Puyol DR, Marquez-Exposito L, Ruiz-Ortega M, Castillo C, Sheng X, Susztak K, Ruiz-Canela M, Salas-Salvado J, Gonzalez MAM, Ortega S, Ramos R, Lamas S. Supraexpresia tubulului renal Cpt1a protejează de fibroza renală prin restabilirea homeostaziei mitocondriale. J Clin Invest. 2021;131(5):e140695.

22. Luo Z, Wang Y, Xue M, Xia F, Zhu L, Li Y, Jia D, Chen S, Xu G, Lei Y. Astragaloside IV ameliorează metabolismul grăsimilor în ficatul șoarecilor îmbătrâniți prin direcționarea activității mitocondriale. J Cell Mol Med. 2021;25(18):8863–76.

23. Bhargava P, Schnellmann RG. Energetica mitocondrială în rinichi. Nat Rev Nephrol. 2017;13(10):629–46.

24. Jiang M, Bai M, Lei J, Xie Y, Xu S, Jia Z, Zhang A. Disfuncția mitocondrială și tranziția AKI la CKD. Am J Physiol Renal Physiol. 2020;319(6): F1105–16.

25. Tang C, Cai J, Yin XM, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Dong Z. Controlul calității mitocondriale în leziunea și repararea rinichilor. Nat Rev Nephrol. 2021;17(5):299–318.

26. Zhao M, Liu S, Wang C, Wang Y, Wan M, Liu F, Gong M, Yuan Y, Chen Y, Cheng J, Lu Y, Liu J. Veziculele extracelulare derivate din celule stem mezenchimale atenuează deteriorarea și inflamația mitocondrială prin stabilizarea ADN-ului mitocondrial. ACS Nano. 2021;15(1):1519–38.

27. Cao H, Cheng Y, Gao H, Zhuang J, Zhang W, Bian Q, Wang F, Du Y, Li Z, Kong D, Ding D, Wang Y. Urmărirea in vivo a veziculelor extracelulare derivate din celule stem mezenchimale care se îmbunătățesc funcția mitocondrială în leziunea de ischemie-reperfuzie renală. ACS Nano. 2020;14(4):4014–26.

28. Gu D, Zou X, Ju G, Zhang G, Bao E, Zhu Y. Veziculele extracelulare derivate din celulele mezenchimale stromale ameliorează afectarea acută de ischemie-reperfuzie renală prin inhibarea fisiunii mitocondriale prin miR-30. Celulele Stem Int. 2016;2016:2093940.

29. Wang J, Wu H, Peng Y, Zhao Y, Qin Y, Zhang Y, Xiao Z. Exosomii hipoxiei derivați de celule stem adipoase promovează vindecarea de înaltă calitate a plăgii diabetice implică activarea căilor PI3K/Akt. J Nanobiotehnologie. 2021;19(1):202.

30. Liu W, Li L, Rong Y, Qian D, Chen J, Zhou Z, Luo Y, Jiang D, Cheng L, Zhao S, Kong F, Wang J, Zhou Z, Xu T, Gong F, Huang Y, Gu C, Zhao X, Bai J, Wang F, Zhao W, Zhang L, Li X, Yin G, Fan J, Cai W. Exozomii hipoxici derivați de celule stem mezenchimale promovează vindecarea fracturilor osoase prin transferul miR{{2} }. Acta Biomater. 2020;103:196–212.

31. Rong Y, Zhang J, Jiang D, Ji C, Liu W, Wang J, Ge X, Tang P, Yu S, Cui W, Cai W. Pretratamentul hipoxic al veziculelor extracelulare mici mediază repararea cartilajului în osteoartrita prin administrarea miR{ {1}}a-5p. Acta Biomater. 2021;122:325–42.

32. Yang C, Chen Z, Yu H, Liu X. Inhibarea perturbatorului de tăcere telomerică 1-Asemenea ischemiei renale atenuate și fibrozei induse de leziuni de reperfuzie prin blocarea stresului oxidativ mediat de PI3K/AKT. Drug Des Devel Ther. 2019;13:4375–87.

33. Qian Y, Qian C, Xie K, Fan Q, Yan Y, Lu R, Wang L, Zhang M, Wang Q, Mou S, Dai H, Ni Z, Pang H, Gu L. Semnalizarea receptorului P2X7 promovează inflamația în celule parenchimatoase renale care suferă de leziune de ischemie-reperfuzie. Moartea celulară Dis. 2021;12(1):132.

34. Hu MC, Shi M, Gillings N, Flores B, Takahashi M, Kuro OM, Moe OW. Alfa-Klotho recombinant poate fi profilactic și terapeutic pentru progresia bolii renale acute până la cronice și cardiomiopatia uremică. Rinichi Int. 2017;91(5):1104–14.

35. Dubois V, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B. Contribuții distincte, dar complementare ale izotipurilor PPAR la homeostazia energetică. J Clin Investig. 2017;127(4):1202–14.

36. Desvergne B, Wahli W. Peroxisome proliferator-activated receptors: nuclear control of metabolism. Endocr Rev. 1999;20(5):649–88.

37. Libby AE, Jones B, Lopez-Santiago I, Rowland E, Levi M. Receptorii nucleari în rinichi în timpul sănătății și bolii. Mol Aspecte Med. 2021;78:100935.

38. Bougarne N, Weyers B, Desmet SJ, Deckers J, Ray DW, Staels B, De Bosscher K. Molecular actions of PPARalpha in lipid metabolism and inflammation. Endocr Rev. 2018;39(5):760–802.

39. Vega RB, Huss JM, Kelly DP. Coactivatorul PGC-1 cooperează cu receptorul alfa activat de proliferatorul peroxizomal în controlul transcripțional al genelor nucleare care codifică enzimele mitocondriale de oxidare a acizilor grași. Mol Cell Biol. 2000;20(5):1868–76.

40. Li SY, Susztak K. Rolul receptorului gamma activat de peroxizomi activat 1alfa (PGC-1alfa) în boala renală. Semin Nefrol. 2018;38(2):121–6.

41. Fransen M, Lismont C, Walton P. Conexiunea peroxizom-mitocondrie: Cum și de ce? Int J Mol Sci. 2017;18(6):1126.

42. Aparicio-Trejo OE, Avila-Rojas SH, Tapia E, Rojas-Morales P, Leon-Contreras JC, Martinez-Klimova E, Hernandez-Pando R, Sanchez-Lozada LG, PedrazaChaverri J. Chronic impairment of mitochondrial bioenergetics and beta -oxidarea promovează tranziția experimentală AKI la CKD indusă de acidul folic. Free Radic Biol Med. 2020;154:18–32.

43. Eirin A, Lerman LO. Vezicule extracelulare derivate din celule stem/stromale mezenchimale pentru boala cronică de rinichi: am ajuns încă? Hipertensiune. 2021;78(2):261–9.

44. Kurzhagen JT, Dellepiane S, Cantaluppi V, Rabb H. AKI: un factor de risc din ce în ce mai recunoscut pentru dezvoltarea și progresia CKD. J Nephrol. 2020;33(6):1171–87.

45. Zhu J, Lu K, Zhang N, Zhao Y, Ma Q, Shen J, Lin Y, Xiang P, Tang Y, Hu X, Chen J, Zhu W, Webster KA, Wang J, Yu H. Funcții reparatorii miocardice de exozomi din celulele stem mezenchimale sunt îmbunătățite prin tratamentul cu hipoxie a celulelor prin transferul de microARN-210 într-un mod dependent de nSMază2-. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(8):1659–70.

46. ​​Zhu LP, Tian T, Wang JY, He JN, Chen T, Pan M, Xu L, Zhang HX, Qiu XT, Li CC, Wang KK, Shen H, Zhang GG, Bai YP. Exozomii derivați de celule stem mezenchimale provocați de hipoxie facilitează repararea cardiacă prin prevenirea mediată de miR-125b a morții celulare în infarctul miocardic. Teranostice. 2018;8(22):6163–77.

47. Xie YH, Xiao Y, Huang Q, Hu XF, Gong ZC, Du J. Rolul căii CTRP6/AMPK în fibroza renală prin promovarea oxidării acizilor grași. Eur J Pharmacol. 2021;892:173755.

48. Chen YY, Chen XG, Zhang S. Drugability of lipide metabolism modulation against renal fibrosis. Acta Pharmacol Sin. 2021.

49. Chung KW, Lee EK, Lee MK, Oh GT, Yu BP, Chung HY. Deteriorarea PPARalpha și a căii de oxidare a acizilor grași agravează fibroza renală în timpul îmbătrânirii. J Am Soc Nephrol. 2018;29(4):1223–37.

50. Han SH, Malaga-Dieguez L, Chinga F, Kang HM, Tao J, Reidy K, Susztak K. Deleția Lkb1 în celulele epiteliale tubulare renale duce la CKD prin modificarea metabolismului. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):439–53.

51. Jao TM, Nangaku M, Wu CH, Sugahara M, Saito H, Maekawa H, Ishimoto Y, Aoe M, Inoue T, Tanaka T, Staels B, Mori K, Inagi R. ATF6alpha downregulation of PPARalpha promovează tubulointerstitial indus de lipotoxicitate fibroză. Rinichi Int. 2019;95(3):577–89.

52. Spinelli JB, Haigis MC. Contribuțiile multiple ale mitocondriilor la metabolismul celular. Nat Cell Biol. 2018;20(7):745–54.

53. Chung KW, Dhillon P, Huang S, Sheng X, Shrestha R, Qiu C, Kaufman BA, Park J, Pei L, Baur J, Palmer M, Susztak K. Leziunile mitocondriale și activarea căii STING duc la inflamație renală si fibroza. Cell Metab. 2019;30(4):784–99.

Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1, Qianqian Chen1, Yinghua Zhao4, Liangmei Chen5, Xu Wang1 și Xiangmei Chen1,2

1 Departamentul de Nefrologie, Primul Centru Medical al Spitalului General Chinez PLA, Institutul de Nefrologie al Armatei de Eliberare a Poporului Chinez, Laboratorul Cheie de Stat al Bolilor de Rinichi, Centrul Național de Cercetare Clinică pentru Boli de Rinichi, Laboratorul Cheie de Cercetare a Bolilor de Rinichi din Beijing, Beijing, China.

2 Departamentul de Nefropatie, Al doilea Spital al Universității Jilin, Changchun, China.

3 Institutul de Cercetare a Rinichilor, Centrul Național de Cercetare Clinică pentru Geriatrie și Divizia de Nefrologie, Spitalul West China al Universității Sichuan, Chengdu, China.

4 Școala de Medicină Clinică, Universitatea Tsinghua, Beijing, China.

5 Departamentul de Nefrologie, Primul Spital Afiliat al Universității Jinan, Guangzhou, China.