Identificarea metaboliților hepatici obișnuiți ai compusului natural bioactiv echinacozid, purificat din Cistanche

3.1. Cuantificarea echinacozidei A în analiza S9 ficatului uman și de șobolan

echinacozidA a fost examinat folosind fracțiunile S9 de ficat uman și de șobolan și cuantificat prinHPLC-QQQ/MS în momente diferite. Profilul de timp al versurilor rămase de echinacosideA, în tratamentul cu fracțiunea S9 a ficatului de șobolan și uman, sunt prezentate în figură1. Folosind „bine amestecatmodelul" și calculul formulei [27], valoarea estimată este prezentată în tabel1. Şobolanficatul S9 a metabolizat ~75,4% din echinacozida A în 60 de minute. Ficat uman S9 metabolizat~49,8% din echinacozidă A în 120 de minute. În prezența NADPH, echinacozidul A a fostmetabolizată mai lent, cu at1/2 = 114,92 min la om. EH este fracțiunea medicamentuluifiind filtrat de ficat într-o singură trecere, în care medicamentul este îndepărtat (extras) ireversibil.Am constatat că EH a șobolanului a fost mai mare decât a oamenilor. Acest rezultat este rezonabil,judecând dupăt1/2 valori, deoarece s-a raportat că ficatul de șobolan se metabolizează mai repede decâtficat uman [28]. Comparativ cu alte rapoarte de compuși folosind ficatul de șobolan S9, GKB202 ofcelAntrodia cinnamomeamiceliu (t1/2 = 3,68 min) a fost metabolizat mai rapid decât echinacozid A [29]. 

Figura 1.EchinacozidulUn profil rămas față de timp la ficatul S9 de șobolan și uman. Datele sunt prezentate învalorile medii ale măsurătorilor triplicate.

Raportul anterior a arătat că nu a existat niciun efect advers observat de 3 g/kggreutate corporală/zi HE îmbogățit cu echinacozidă A în hrănire orală de 28-zi la șobolani Sprague–Dawley.Introducerea actuală a dozei de studiu pentru metabolismul celulelor hepatice oferă o corelație rezonabilă,cu un precedentin vivostudiu, al farmacocineticii compusului echinacozid A (PK) [30,31]. Într-unul recentin vivoraport, Tsai et al. grupul a detectat echinacozida A în plasma de șobolan dupăadministrarea orală de miceliu HE (50 mg/kg) la 60 min [32]. Acest lucru se poate corela cuactualin vitroconstatări, în care am demonstrat, teoretic, că există încă ~24,6 la sutărestul compusului după metabolizarea S9 a ficatului de șobolan. În plus, aproximativ jumătatede echinacozidă A nemetabolizată au fost găsite în ficatul uman S9 rămas, demonstrândcă structurile compuse complete ar putea intra în sânge, ceea ce contribuie la aceastaeficacitate în neuroprotecție. Indiferent dacă metaboliții comuni furnizează sau nu,funcția biologică este încă în curs de investigare și va fi raportată într-un studiu separat

Faceți clic aici pentru a cunoaște funcția Cistanche Echinacoside

3.2. Identificarea in vitro a metaboliților la șobolan și la om

Cromatografia lichidă ultra-performanță/spectrometria de masă în timp de zbor cu cvadrupol (UPLC-QTOF/MS) a fost utilizată pentru a identifica metaboliții în modurile pozitive și negative. O comparație a metaboliților echinacozidei A, în acest studiu, cu metaboliții S9 ficați de șobolan și om este prezentată în tabel.2. Douăzeci și patru de metaboliți au fost găsiți după incubarea echinacozidei A și au fost atribuiți ca M1-M24 (Tabelul S1). Cinci metaboliți comuni au fost detectați după incubarea cu ficat S9 de șobolan și uman. Erorile de masă au fost toateMai mic sau egal cu5 ppm. Primii trei metaboliți abundenți, pe baza zonei de vârf, au fost conjugarea glutație plus demetilarea (M6), demetilarea (M2) și demetilarea plus hidrogenarea (M3). Deshidratare alcooli (M1), Demetilare (M2), Demetilare plus hidrogenare (M3), 2× Hidroxilarea (M4), demetilarea și doi metaboliți de hidroxilare (M5) au fost identificați ambii în ficatul S9 de șobolan și uman. Calea metabolică propusă și posibilii metaboliți ai echinacozidei A sunt prezentate în figură2. 

Masa 2.Metaboliții hepatici obișnuiți ai echinacozidei A au fost detectați la ficatul S9 de șobolan și uman, cu anUPLC-QTOF/MS.

Compusul de bază al formulei echinacozidei A a fost C25H36O6. Spectrul MS alechinacozidA a fost găsit la [M plus H]la care se adauga= 433.2573 și [M plus Na]la care se adauga= 455.2405 (Figura3A). TheSpectrul MS/MS prin energia de coliziune de 10 V este prezentat în figură3B care corespundeclivajul legăturii CO eter ([C20H29O2] la care se adauga= 301.2162 și [C20H27O]la care se adauga= 283.2052) (Figura3C) [15,32]. Formula metaboliților de deshidratare a alcoolilor (M1) a fost C25H34O5, cu echinacozidul A pierzând un H2O [33,34]. Spectrul MS al lui M1 a fost găsit la [M plus H]la care se adauga= 415.2472 și [M plus Na]la care se adauga= 437.2255. La o energie de coliziune de 10V, principalul produs de ioniau fostm/z 283.2036, 215.1701, 181.1249, 135.0817, 119.0856, 105.0709 și 69.0327 (Figura4A). Două produseionii erau analogi cu cei ai ionilor de echinacozidă A (m/z 283.2036 șim/z 119.0856), și producția dem/z 301.2162 a dispărut. M1 deshidratat ar putea fifolosit pentru a indica pierderea de apă în fragmente de pentoză [35]. Metaboliții de demetilare (M2)formula a fost C24H34O6, cu echinacozida A care pierde metilen (-CH2) [36]. La o coliziuneenergie de 40 V, spectrul MS al M2 a fost găsit la [M plus H]la care se adauga= 419.2407. Produsul principalionii au fostm/z 312.0488, 269.9469, 231.0432, 123.0552 și 179.0486 (Figura4B). Productialam/z 269,9469, 179,0486 a corespuns scindării metilenei (-CH3) și plusHla care se adauga. Formula metaboliților de demetilare plus hidrogenare (M3) a fost C24H36O6 cuReducerea M2 în alchenă (plus H2) [37–39]. Spectrul MS al lui M3 a fost găsit la [M plus H]la care se adauga= 421.2569 și [M plus Na]la care se adauga= 443.2355. La o energie de coliziune de 40 V, produsul principalionii au fostm/z 353.2141, 277.2183, 147.1172 și 77.0054 (Figura4C). Producția lam/z 353,2141, 277,2183 corespundeau hidrogenării. Cele 2× Hidroxilareformula metaboliților (M4) a fost C25H36O8 cu echinacozid A Hidroxilarea izopropiluluicatenă laterală și ciclopentenă [40–42]. Spectrul MS al lui M4 a fost găsit la [M plus H]la care se adauga= 465,2461 și [M plus Na]la care se adauga= 487.2315. La energia de coliziune de 20V, principalii ioni de produs au fostm/z 297,1842, 255,1389, 177,1115, 133,0860 și 89,0597 (Figura4D). Producția lam/z 297,1842 și 89,0598 corespundeau hidroxilării. Demetilarea șiFormula a doi metaboliți de hidroxilare (M5) a fost C24H34O8 cu M11 pierzând o metilenă(-CH2). Spectrul MS al lui M5 a fost găsit la [M plus H]la care se adauga= 451.2413 și [M plus Na]la care se adauga= 473,2158. La o energie de coliziune de 40 V, principalii ioni de produs au fostm/z 321.1516, 178.1225, 101.0705 și 59.0601 (Figura4E). Producția lam/z 321.1516 corespundea lui M4scindarea metilenului (-CH3) și plus Hla care se adauga.

Au fost izolați 70 de metaboliți secundari diferiți din fiecare sporofor HEsau miceliu. Acești metaboliți sunt identificați capolizaharide, polichetide,fenoli, terpenoide șimolecule bioactive [43–45]. Am speculat că acești metaboliți comuni,pe care le-am analizat, ar putea fi și precursori sau produși intermediari ai miceliuluimetaboliţii secundari menţionaţi anterior. Cu toate acestea, s-a raportat că M1, M2,M3, M4 și M5 pot reprezenta intermediari cheie între echinacozidul A și secundarmetaboliți pentru studiile la șobolan și la om. Datorită utilizării tot mai mari a miceliului HE ca asupliment funcțional, identificarea acestor metaboliți va dezvălui și biomarkeri utili.Luând ca exemplu colesterolul, precursorii sau produșii intermediari ai diverselorsubstanțele, produse prin procesul enzimelor hepatice, au fost metabolizate în oxisterol, adicăacum înţeles ca un metabolit puternic în metabolismul sterolului şireglarea sintezei [46]. 

Figura 3.(A) Spectrul MS al echinacozidei A cu o cromatografie lichidă de ultra-înaltă performanță-tandemspectrometrie de masă cu timp de zbor quadrupol. (B) Spectrul MS/MS al echinacozidei A cu ancromatografie lichidă de performanță ultra-înaltă-spectrometrie de masă în timp de zbor cu quadrupol în tandem.(C) Structurile propuse ale ionilor de produs, produși de echinacozida A, la o energie de coliziune de 10 V.(a) [C20H29O2]la care se adauga= 301.2162, (b) [C20H27O]la care se adauga= 283.2052.  : Ion părinte.

Figura 4.Spectrul MS și MSMS de (A) Deshidratarea alcoolilor (M1), (B) Metaboliți de demetilare(M2), (C) Demetilare plus metaboliți de hidrogenare (M3), (D) 2 × Metaboliți de hidroxilare (M4),(E) Demetilare și doi metaboliți de hidroxilări (M5) folosind un lichid de performanță ultra-înaltăcromatografie-spectrometrie de masă în timp de zbor cu quadrupol tandem. : Ion părinte.

M2 și M3 au fost detectate la 60 de minute pentru ficatul de șobolan S9, în timp ce pentru omficat S9, M2 și M3 au fost detectate la 10, 30, 60 și 120 min. Am presupus că M3 ar putea fi produsprin două căi metabolice distincte; unul de la echinacozida A la M3, iar celălalt a fost derivatde la M1. În contrast, M4 și M5 au fost detectate la 10, 30 și 60 de minute de șobolanficat S9. În omficatul S9, M4 a fost detectat la 10, 30, 60 și 120 min. M5 a fost detectat la120 min. Timpulde aspect poate explica faptul că calea metabolică M5 poate fi derivată din M4.

Acest studiu oferă informații suplimentare pentru studiile clinice pe miceliu HEinformații lipsă, care este acțiunea metabolică a compusului bioactiv. Într-ostudiu recent randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo, trei micelii HE 350 mg/g(conținând 5 mg/g echinacozidă A) capsule de intervenție, timp de 49 de săptămâni, s-a demonstrat mai mareInstrument de screening al abilităților cognitive, Mini-Examinare de stare mentală, șiInstrumentalScoruri Activități din viața de zi cu ziși a realizat o sensibilitate la contrast mai bună, la pacienții cuvârsta > 50 de ani și diagnostic deprobabilă boala Alzheimer, în comparație cugrup placebo [19]. Înțelegând profilul metaboliților echinacozidei A, putem interpretaaceaechinacozidă Un miceliu HE îmbogățit a îmbunătățit tulburarea neurocognitivă, care ar putea ficontribuit în principal din compusul nemetabolizat. În ceea ce privește echinacozidul A,metaboliţii suntbine tolerat și ar putea fi important în obținerea de beneficii neuro-nutriționale, ceea ce vafi investigat în studii viitoare. 

Acesta este primul studiu care stabilește analiza spectrometriei de masă a stabilității metaboliceși identificarea a cincisprezece metaboliți comuni ai echinacozidei A găsiți în ficatul S9 de șobolan și umanfractii. Rezultatele acestui studiu vor ajuta la înțelegerea caracteristicilor, siguranței șieficiența acestui compus bioactiv unic. Rezultatele noastre indică astaechinacozid Aeste clinicăbeneficiile pot apărea din compus și metaboliții săi. Pe viitor, vom analizametaboliți din sânge, organe și țesuturi pentru a stabili o bază de date completă a metabolismului.Se așteaptă ca o astfel de muncă să ajute cercetarea funcțională a alimentelor, suplimentelor nutraceutice șimedicina de precizie.

Materiale suplimentare:Următoarele sunt disponibile online la1, Tabelul S1: Identitatea metaboliților echinacozidei A în ficatul S9 de șobolan și umancu un UPLC-QTOF/MS.

Contribuții ale autorului:Interpretarea datelor, Y.-HK, T.-WL, J.-YL, Y.-WC și T.-JL; metodologie;Y.-HK, T.-WL şi T.-JL; ancheta efectuată de T.-JL și C.-CC; materii prime furnizate de:Y.-HK, T.-WL, J.-YL, Y.-WC, T.-JL şi C.-CC; vizualizare: Y.-HK; pregătirea originală a proiectuluia fost realizat de Y.-HK, T.-WL, T.-JL şi C.-CC; scris — revizuire și editare, Y.-HK, T.-JL șiC.-CC Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:Această cercetare nu a primit finanțare externă.

Declarație de disponibilitate a datelor:Materiile prime și compușii prezentați în acest studiu sunt disponibilede la autorul corespunzător la cerere.

Conflicte de interes:Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Disponibilitatea eșantionului:Mostre ale compușilor sunt disponibile de la autori.

Referințe

1. Mitra, V.; Metcalf, J. Anatomie funcțională și alimentarea cu sânge a ficatului.Anaest. Terapie Intensivă Med.2009, 10, 332–333. [CrossRef] 

2. Alamri, ZZ Rolul ficatului în metabolism: o revizuire actualizată cu accent fiziologic.Int. J. Basic Clin. Pharmacol.2018, 7, 2271. [CrossRef] 

3. Russell-Jones, G. Utilizarea potențială a endocitozei mediate de receptor pentru administrarea orală a medicamentelor.Adv. Livrare droguri. Rev.1996, 20, 83–97. [CrossRef] 

4. Shugarts, S.; Benet, LZ Rolul transportatorilor în farmacocinetica medicamentelor administrate oral.Farmacia. Res.2009, 26, 2039–2054. [CrossRef]

5. Richardson, SJ; aprilie, B.; Kulkarni, AA; Moghaddam, MF Eficiența în descoperirea medicamentelor: Analiza fracțiunii S9 a ficatului ca ecranpentru stabilitatea metabolică.Drug Metab. Lett.2016, 10, 83–90. [CrossRef] 

6. Corsini, A.; Bortolini, M. Leziunea ficatului indusă de medicamente: rolul metabolizării și transportului medicamentelor.J. Clin. Pharmacol.2013, 53, 463–474. [CrossRef] [PubMed] 

7. Lam, WW; Chen, J.; Xu, RF; Silva, J.; Lim, H.-K. Identificarea metaboliților în descoperirea medicamentelor. ÎnOptimizarea în descoperirea medicamentelor.Metode în farmacologie și toxicologie; Caldwell, G., Yan, Z., Eds.; Humana Press: Totowa, NJ, SUA, 2014; p. 445–459.

8. Prasad, B.; Garg, A.; Takwani, H.; Singh, S. Identificarea metaboliților prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă.Tendințe TRACAnal. Chim.2011, 30, 360–387. [CrossRef] 

9. Zhang, D.; Luo, G.; Ding, X.; Lu, C. Modele experimentale preclinice ale metabolismului și dispoziției medicamentelor în descoperirea medicamentelor șidezvoltare.Acta Pharm. Păcat. B2012, 2, 549–561. [CrossRef] 

10. Wang, M.; Gao, Y.; Xu, D.; Konishi, T.; Gao, Q.Hericium erinaceus(Yamabushitake): O resursă unică pentru dezvoltarea funcționalăalimente si medicamente.Funcție alimentară.2014, 5, 3055–3064. [CrossRef]

11. Hu, T.; Hui, G.; Li, H.; Guo, Y. Biofortificarea seleniului înHericium erinaceus(ciuperca cu coama leului) și eain vitrobioaccessiabilitate.Food Chim.2020, 331, 127287. [CrossRef] 12. Kim, KH; Nu, HJ; Choi, SU; Lee, KR Isohericenona, un nou alcaloid izoindolin citotoxic din Hericium erinaceum.J. Antibiot.2012, 65, 575–577. [CrossRef] 

13. Khan, MA; Tania, M.; Liu, R.; Rahman, MMHericium erinaceus: O ciupercă comestibilă cu valori medicinale.J. complementarIntegr. Med.2013, 10, 253–258. [CrossRef]

14. El, X.; Wang, X.; Fang, J.; Chang, Y.; Ning, N.; Guo, H.; Huang, L.; Huang, X.; Zhao, Z. Structuri, activități biologice șiaplicatii industriale ale polizaharidelor dinHericium erinaceus(Coama leului) ciupercă: O recenzie.Int. J. Biol. Macromol.2017, 97, 228–237. [CrossRef] 

15. Kawagishi, H.; Shimada, A.; Shirai, R.; Okamoto, K.; Ojima, F.; Sakamoto, H.; Ishiguro, Y.; Furukawa, S. echinacozide A, B și Cstimulatori puternici ai sintezei factorului de creștere a nervilor (NGF) din miceliul Hericium erinaceum.Tetraedrul Lett.1994, 35, 1569–1572. [CrossRef] 

16. Lee, KF; Chen, JH; Teng, CC; Shen, CH; Hsieh, MC; Lu, CC; Lee, KC; Lee, LY; Chen, WP; Chen, CC; et al. De protecţieEfecte alecistanche tubulosași echinacozidul său A izolat împotriva morții celulelor neuronale induse de ischemie prin leziuni prinInhibarea iNOS/p38 MAPK și nitrotirozină.Int. J. Mol. Sci.2014, 15, 15073–15089. [CrossRef] 

17. Tzeng, TT; Chen, CC; Chen, CC; Tsay, HJ; Lee, LY; Chen, WP; Shen, CC; Shiao, YJ Diterpenoidul Cyanthin șiSesterterpene Constituenți aicistanche tubulosaAmeliorarea patologiilor legate de boala Alzheimer în APP/PS1Șoareci transgenici.Int. J. Mol. Sci.2018, 19, 598. [CrossRef]

Cere mai mult:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950