Imaginirea rinichilor: de la microscopie luminoasă la super-rezoluție
Mar 17, 2022
Contact: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelotti1,2, Giulia Antonelli1,2 Carolina Conte1,2și Paola Romagnani1,2
ABSTRACT
Realizările importante înrinichimecanismele fiziologice și fiziopatologice pot fi atribuite în mare măsură progresului în tehnologia microscopiei. Multe din ceea ce știm despre arhitecturarinichise bazează pe descrierile fundamentale ale microscopiştilor anatomici utilizând microscopia cu lumină şi ulterior pe analiza ultrastructurală furnizată de microscopia electronică. Aceste două tehnici au fost folosite pentru primele sisteme de clasificare a bolilor renale și pentru actualizările constante ale acestora. Mai recent, o serie de tehnici noi de imagistică a adăugat analiza în dimensiuni suplimentare ale timpului și spațiului. Microscopia confocală ne-a permis să vizualizăm secvențial secțiuni optice de-a lungul axei z, iar disponibilitatea unui software de analiză specific a oferit o redare tridimensională a specimenelor de țesut mai groase. Microscopia multifotonice ne-a permis să investigăm simultanrinichifuncția și structura în timp real. Microscopia imagistică cu fluorescență-durată de viață ne-a permis să studiem distribuția spațială a metaboliților. Microscopia cu super-rezoluție a crescut sensibilitatea și rezoluția până la niveluri la scară nanometrică. Cu microscopia crio-electronică, cercetătorii ar putea vizualiza biomoleculele individuale la niveluri atomice direct în țesuturi și pot înțelege interacțiunea lor la niveluri subcelulare. În cele din urmă, spectrometria de masă cu desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice a permis măsurarea a sute de molecule diferite în același timp pe secțiuni de țesut la rezoluție înaltă. Această recenzie oferă o prezentare generală a disponibiluluirinichistrategii de imagistică, cu accent pe posibilul impact al celor mai recente îmbunătățiri tehnologice.
Cuvinte cheie:imunohistochimie,rinichibiopsie, podocite,proximalătubul, celule stem
Cistanche herba pentru boli de rinichi, faceți clic aici pentru a obține mostra
INTRODUCERE
Therinichieste necesară o complexitate structurală fascinantă pentru a-și îndeplini diversele funcții fiziologice. La început, studiindrinichia fost limitată la observații macroscopice și contribuția lor la diagnosticul bolilor renale a fost incontestabil limitată. Au fost descrise manifestări clinice, dar mecanismele patogenetice subiacente au fost necunoscute. Realizările în înțelegerea fiziologiei și fiziopatologiei rinichilor pot fi atribuite în mare măsură progresului continuu în domeniul microscopiei. Incercari derinichiimagistica a început cu mult timp în urmă [1]. În 1666, anatomistul Malpighi a examinatrinichițesut cu un microscop cu lumină care a avut o putere estimată la 25-30 și a descris pentru prima dată glomerulul ca „o glandă în care urina a fost separată de sânge”[2]. Această contribuție a fost ignorată până în 1842, când structurile nefronilor au fost dezlegate cu un microscop cu lumină de 10 ori mai puternic de Sir William Bowman. Bowman a descoperit capsula periglomerulară (numită mai târziu capsula Bowman) ca fiind conectată anatomic cu prima parte a tubului [3]. În 1862, Jacob Henle a descris segmentul tubului în formă de ansă care i-a luat numele, conectând tubul cortical și papila renală.
Datorită introducerii microscopiei cu lumină, o clasificare histomorfologică arinichibolia devenit posibil [1]. Șansa de a observa ceea ce se întâmplă în rinichii bolnavi a permis să înțelegem că modificările patologice au variat considerabil între pacienții cu manifestări clinice similare. Cu toate acestea, primele studii privind modificările patologice ale țesutului renal au fost efectuate pe probe de autopsie, conducând în principal la descrierea bolilor cronice. Lipsa de informații despre evoluția patologiilor renale și problema tehnică a fenomenelor autolitice, corelate cu utilizarea țesuturilor post-mortem, au limitat cunoașterea bolilor umane. În 1951, introducerea luirinichibiopsia a permis observarea directă și studiul nu numai a bolilor renale cronice, ci și acute. Între timp, microscopia a devenit treptat mai sofisticată, cu sensibilitate și rezoluție crescute progresiv până la niveluri la scară nanometrică. În această revizuire, vom oferi o privire de ansamblu asupra descoperirilor fundamentale ale rinichilor, făcute posibile de progresele în tehnologia microscopiei, cu accent pe posibilitățile care evoluează din cele mai recente dezvoltări tehnice.
IMUNOPATOLOGIA VIZUALIZARE A RINCHIULUI
Imunomarcare și microscopie cu fluorescență
Posibilitatea de a obține un fragment reprezentativ de țesut viu a permis aplicarea unor tehnici emergente care necesitau conservarea maximă a țesuturilor, cum ar fi metodele imunohistochimice (fluorescente mai întâi, apoi enzimatice). De fapt, în 1950, Coons a dezvoltat metoda de etichetare a anticorpilor cu izocianat de fluoresceină, adică imunofluorescența, fără a distruge capacitatea de a reacționa specific cu antigenele lor tisulare. De atunci, imunofluorescența a fost încorporată în procedura de diagnosticare pentru evaluarea probelor de biopsie renală congelate. Pentru prima dată, aceste tehnici au permis observarea imunoglobulinelor intrarenale (Ig) și a depozitelor de complement la pacienții afectați de glomerulonefrită, contribuind la discriminarea diferitelor patofiziologii care stau la baza anumitor leziuni tisulare nespecifice, de exemplu, în glomerulonefrita semilună [4]. În plus, posibilitatea de a observa un model de colorare caracteristic și cuplarea fluoresceinei cu alți anticorpi decât imunoglobulina G (IgG) a condus la recunoașterea depozitelor de imunoglobuline A (IgA) în nefropatia IgA, precum și a depozitelor de complement în glomerulonefrita post-infecțioasă. și glomerulonefrita membranoproliferativă [4].
Microscopie confocală
Microscopia cu fluorescență a suferit îmbunătățiri tehnice considerabile odată cu introducerea microscopiei confocale la sfârșitul anilor 1980. Elementele cheie în microscopia confocală sunt iluminarea punctuală focalizată și scanată peste specimen și o deschidere confocală variabilă (gaură) în fața detectorului care permite colectarea luminii doar dintr-o secțiune subțire din jurul planului focal (numită secțiune optică). Microscopia confocală a permis primele studii in vivo ale rinichilor în modele experimentale și observarea captării și transportului moleculelor fluorescente prin tubuli intacți.rinichidupa micropunctie. Acest lucru a permis studii ale funcției tubulare în condiții fiziologice și patologice [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, datorită limitei de difracție a luminii vizibile, fotoalbirii și fototoxicității.
ÎNȚELEGEREA BARIEREI DE FILTRARE GLOMERULARĂ: MICROSCOPIE ELECTRONĂ
Prima încercare de a depăși limita de rezoluție a microscoapelor cu lumină și fluorescență a fost în 1931, când Ernst Ruska și Max Knoll au inventat microscopul electronic (EM), care folosește un fascicul de electroni accelerați, în loc de un fascicul de lumină, ca sursă de excitație, și are o putere de rezoluție mai mare decât microscoapele cu lumină (până la 0.2 nm). Pentru această inovație, în 1986, Ernst Ruska a primit Premiul Nobel pentru Fizică. Datorită puterii crescute de rezoluție, a devenit în curând evident că glomerulul nu era doar un filtru mecanic, ci un organ extrem de complex compus din trei straturi: celule endoteliale, membrana bazală glomerulară (GBM) și podocite [9]. Transmisia EM (TEM) a permis vizualizarea celulelor glomerulare din interior [10] și a dezvăluit că celulele endoteliale aveau corpi celulari subțiri fenestrați, în timp ce podocitele aveau corpi celulari mari și extinderea proceselor „piciorului” primare și secundare ancorate la GBM și interconectate prin intermediul joncțiuni liniare (diafragma ușoară) (Figura 1B). În plus, scanarea EM (SEM), captând electroni retrodifuzați, a permis vizualizarea celulelor glomerulare de pe suprafața lor exterioară [10] și a dezvăluit că procesele piciorului ale podocitelor învecinate au interdigitat și au acoperit GBM (Figura 1C). EM a rămas un instrument puternic nu numai pentru înțelegerea ultrastructurii glomerulare normale, ci și pentru înțelegerearinichifiziologie și fiziopatologie [11]. Numeroase studii efectuate pe probe umane sau pe modele experimentale au relevat faptul că diferite procese ale bolii sunt asociate cu un set de modele distinctive de modificări ultrastructurale, ceea ce implică actualizări ulterioare asupra unui sistem de clasificare în evoluție arinichiboli. Abilitatea tehnică de a vizualiza o complexitate suplimentară a ultrastructurii rinichilor a susținut specializarea „nefropatologilor”.
O tehnică SEM recentă, bazată pe un detector extrem de sensibil, a permis studiul celei mai adânci porțiuni a diafragmei fante și a relevat că aceasta era caracterizată de pori cu dimensiuni diferite [12]. La șobolani, apariția proteinuriei a fost asociată cu pori mari, crescând posibilitatea ca modificările ultrastructurale ale diafragmei fantelor să fie cauzatoare pentru modificările permselectivității glomerulare [12]. Ca un alt progres tehnic, SEM cu fața blocată a permis trecerea de la o vedere 2D la o vedere 3D a barierei de filtrare glomerulară cu o rezoluție suficientă pentru a urmări nanostructura celor mai subțiri procese celulare la șoarecii sănătoși, șoarecii bolnavi și în timpulrinichidezvoltare [13, 14].
În cele din urmă, cuplarea EM la un sistem de microanaliza cu raze X (microscopie cu raze X) a permis o analiză elementară a celulelor sau părților de celule la nivel ultrastructural. Microscopia cu raze X folosește un TEM de scanare cu un fascicul de electroni îngust pentru a excita proba. Impactul electronilor de înaltă energie din fascicul cu atomii din specimene produce energie sub formă de fotoni de raze X. Acest semnal de raze X, colectat cu un detector semiconductor cu dispersie de energie, este utilizat pentru identificarea elementelor prezente în specimen, cu o rezoluție de, în cel mai bun caz, 30 nm. Înrinichiîn domeniu, microanaliza cu raze X a fost utilizată cu succes de Beck și Thurau pentru a studia transportul ionilor tubulari transepiteliali [15] și concentrația elementară intracelulară în celulele tubulare [16].
VIZUALIZAREA FIZIOLOGIEI RENALE CU MICROSCOPIE MULTIFOTONĂ
Microscopia multifoton (MPM) a oferit un progres suplimentar în domeniulrinichicercetare, adică posibilitatea de a investiga simultan funcția renală și relațiile de structură în timp real [17]. Spre deosebire de microscoapele ușoare convenționale, excitația cu doi fotoni depinde de absorbția simultană a doi fotoni cu lungimea de undă de excitație dublă necesară pentru a excita fluoroforul în excitația clasică cu un foton (Figura 1D). Utilizarea laserelor cu excitație cu infraroșu pulsat și cu energie scăzută disponibile comercial a crescut penetrarea profundă a țesuturilor și a minimizat fototoxicitatea (Figura 1D). Acest lucru a permis cercetătorilor să vizualizeze procesele celulare dinamice direct la animalele vii, o caracteristică care nu era realizabilă anterior cu nicio altă tehnică. MPM permite cuantificarea funcțiilor renale de bază și a modificărilor patologice, cum ar fi permeabilitatea glomerulară, fluxul sanguin vascular, rata de filtrare glomerulară cu un singur nefron și fluxul tubular [17] (Figura 1E și F). În plus, MPM permite studiul proceselor intracelulare ca răspuns la vătămare, inclusiv moartea și eliminarea celulelor, rularea leucocitelor și recrutarea și întreruperile GBM [17]. Alte îmbunătățiri tehnice au permis imagistica intravitală prelungită de la câteva zile la săptămâni [18] care, în combinație cu șoarecii transgenici care exprimă proteine fluorescente, au fost folosite pentru a urmări soarta celulelor individuale direct in vivo în rinichii sănătoși și răniți [19] și pentru a înțelegeți mai bine mecanismele turnover-ului și regenerării celulelor renale.
Tehnicile de imagistică fără etichete au fost, de asemenea, posibile cu MPM, exploatând autofluorescența naturală a hidratului de nicotinamidă adenin dinucleotide (NADH) pentru a studia starea redox a celulelor tubulare după leziune [20]. În plus, generarea a doua armonică din colagenul fibrilar a fost utilizată pentru a cuantifica depunerea de colagen, un marker al fibrozei renale [21]. Generarea a doua armonică este un proces optic neliniar în care doi fotoni de excitație cu aceeași lungime de undă interacționează cu structuri non-centrosimetrice din țesuturile biologice, cum ar fi colagenul sau microtubulii, și generează un nou foton cu jumătate din lungimea de undă.
O inovație recentă a microscopiei intravitale a fost introducerea unui endoscop multifotonic miniaturizat, utilizat cu succes pentru imaginea rinichilor la șoarecii vii anesteziați [22]. Acest MPM minim invaziv poate deschide calea pentru diagnosticarea in vivo în timp real, fără îndepărtarea țesuturilor și într-un timp foarte scurt.
RINICHIUL ÎN 3D: TEHNICI DE CURARE ȚESUTURILOR ȘI MICROSCOPIE DE EXPANSIUNE
În ciuda îmbunătățirilor tehnologice, una dintre limitele principale pentru imagistica volumetrică mai profundă este opacitatea țesutului renal, ceea ce face carinichiunul dintre cele mai dificile organe din punct de vedere optic. Acesta este motivul pentru care tehnicile de curățare a țesuturilor au suscitat mult interes [23]. Scopul acestor abordări este de a transforma un țesut opac într-unul transparent, păstrând proteinele și eventual markeri fluorescenți, pentru a imagini bucăți groase de țesut. Combinația de clarificare optică cu microscopia de ultimă generație oferă posibilitatea analizei morfometrice, precum cuantificarea volumului și numărului glomerulare, în țesuturi groase sau chiar în rinichiul intact [24]. Alte aplicații includ analiza segmentelor tubulare distincte [25], funcțiile acestora [26] și cuantificarea pierderii podocitelor [27].
Pentru a vizualiza volume mari de țesut și, în același timp, a rezolva detaliile structurale fine, a fost introdusă recent o nouă abordare tehnică, adică microscopia de expansiune (ExM). Ideea este de a extinde fizic un întreg organ 4- pentru a 5-plia, păstrând în același timp arhitectura generală și conținutul proteomului 3D. Folosind un polimer în expansiune, sintetizat direct în eșantion, moleculele mai apropiate decât limita de difracție a luminii sunt separate izotrop în spațiu la distanțe mai mari și, prin urmare, pot fi rezolvate optic chiar și cu un microscop fluorescent convențional. În plus, ExM oferă o transparență optică mai mare și reduce împrăștierea luminii, permițând vizualizarea unui volum mai mare de țesut. Folosind această abordare, localizarea mai multor proteine în diafragma cu fantă și GBM poate fi disecată chiar și cu un microscop confocal normal [28]. De exemplu, poate dezvălui ștergerea procesului piciorului la șoarecii proteinurici, atât în 2D, cât și în 3D, la o rezoluție nanometrică niciodată atinsă înainte [29]. Recent, ExM a fost utilizat pentru evaluarea histopatologică clinică a specimenelor încorporate în parafină deja colorate cu hematoxilină și eozină [30]. Această tehnică poate vizualiza ștergerea procesului piciorului la un nivel nanoscal care anterior era posibil numai cu EM. Progresele în imagistica volumetrică permit analiza 3D de înaltă rezoluție a întregului organ, astfel încât principala limitare a imaginii profunde este acum reprezentată de capacitatea anticorpilor de a pătrunde în țesut.
STUDIAREA PROFILULUI METABOL: MICROSCOPIE IMAGISTICA DOMENIUL FRECVENTA-FLUORESCENTA-DOMENIUL VIATA
Therinichieste un organ metabolic cu un conținut ridicat de mitocondrii. Forma redusă a NADH și a altor metaboliți sunt fluorescente în mod natural și această autofluorescență poate fi utilizată ca indice al stării redox [20]. Cu toate acestea, spectrele de emisie ale acestor fluorofori endogeni se suprapun și identificarea lor separat a fost imposibilă. Dar durata de viață a fluorescenței (adică scăderea în timp a fluorescenței) s-a dovedit a fi semnificativ diferită. Prin urmare, microscopia imagistică cu fluorescență pe durata de viață (FLIM) permite studiul profilurilor metabolice [31]. Recent, folosind o combinație de MPM și FLIM, a devenit posibil să se caracterizeze semnăturile metabolice specifice celulei și să se monitorizeze modificările metabolice in vivo în timpulrinichiboala [32]. Se așteaptă ca FLIM să ofere informații suplimentare desprerinichimetabolismul in vivo în sănătate și boală.
ÎMPINGEREA REZOLUȚIEI DIN PRIN LIMITE: IMAGINIREA RINNICULUI DE SUPER-REZOLUȚIE
Microscopia cu lumină standard se confruntă cu o limită a rezoluției optice dincolo de 200 nm. Noile tehnologii, denumite imagini de super-rezoluție, permit acum microscopia fluorescentă să imagineze dincolo de limita sa de difracție ca punct de plecare al erei nanoscopiei [33]. Aceste abordări combină rezoluția nanoscopică cu avantajele etichetării fluorescenței multicolore. Ca recunoaștere a impactului potențial al acestor inovații, Premiul Nobel pentru Chimie 2014 a fost acordat lui Eric Betzig, Stefan Hell și William Moerner „pentru dezvoltarea microscopiei cu fluorescență super-rezolvată”. Diferite strategii de imagistică de super-rezoluție pot fi aplicate pentru a aborda diferite întrebări biologice. Aceste abordări pot fi grupate în două categorii principale, în funcție de dacă super-rezoluția este exploatată la nivelul moleculelor individuale sau la ansambluri [33].
Tehnici bazate pe ansamblu
Tehnicile bazate pe ansamblu depășesc limita de difracție prin modularea temporală și spațială a fasciculului de lumină de excitație. Printre acestea, imagistica de epuizare a emisiilor stimulate de super-rezoluție (STED) folosește două lasere, un laser de excitație și un laser de epuizare suprapus, deplasat spre roșu (laser STED), cu o formă de gogoși, pentru a suprima emisia de fluorescență de la fluoroforii localizați în afara acestora. centrul excitatiei. Această suprimare se realizează prin emisie stimulată și permite colectarea doar a semnalului care provine dintr-un punct focal cu o dimensiune sub limita de difracție (Figura 2A). Imagistica STED a fost utilizată pentru a vizualiza diafragma fantei într-o formă clară opticrinichițesuturile (Figura 2B-c') și a permis localizarea distribuției spațiale a podocinei și nefrinei la scara nanometrică până la cel puțin 30 lm de adâncime [34]. În plus, posibilitatea de a observa și cuantifica ștergerea procesului piciorului într-un model experimental poate face imagistica STED utilă pentru studiile barierei de filtrare glomerulară [34].
Microscopia STED necesită protocoale specifice pentru pregătirea probelor, fluorofore speciale și pregătire tehnică. Din acest motiv, în ultimii ani s-a acordat mai multă atenție unei alte tehnici de super-rezoluție, microscopia cu iluminare structurată (SIM), care poate extinde limita de difracție cu un factor de doi atât lateral, cât și axial. SIM folosește o configurație de microscop cu câmp larg cu un model de iluminare cu dungi fine, permițând captarea informațiilor de înaltă frecvență (corespunzând detaliilor fine din eșantion) la frecvențe spațiale mai mici. Prin achiziționarea mai multor imagini cu modele de iluminare de diferite faze și orientări, o imagine de înaltă rezoluție poate fi reconstruită (Figura 3A). SIM este compatibil cu fluorofori standard, nu necesită pregătirea specifică a probei și permite vizualizarea 3D. Având în vedere toate aceste avantaje, au fost efectuate diferite studii pentru a evalua posibilitatea utilizării SIM ca instrument de diagnosticare rapidă [35], de exemplu, cu un timp de răspuns potențial mai scurt decât EM. Recent, un SIM 3D și procesarea automată a imaginilor au fost utilizate ca instrument de diagnostic rapid al ștergerii procesului piciorului folosind secțiuni de rutină cu parafină din biopsiile pacienților cu boală de modificare minimă [36] (Figura 3B și C). Această capacitate de a identifica cu succes modificări ale bolilor despre care se știe că prezintă patologie la scară nanometrică a confirmat SIM ca un instrument promițător pentru diagnosticarea de rutină.
Metode de imagistică bazate pe localizarea unei molecule unice
Aceste tehnici se bazează pe posibilitatea de a porni și dezactiva ciclic moleculele fluorescente individuale care sunt prea aproape pentru a fi rezolvate. În aceste abordări, moleculele dintr-o regiune limitată de difracție pot fi activate în diferite momente de timp, astfel încât să poată fi fotografiate individual și ulterior localizate cu precizie nanometrică prin găsirea computațională a centrelor lor (Figura 3D). Printre aceste abordări, microscopia de reconstrucție optică stocastică (STORM) a fost introdusă pentru prima dată înrinichicercetare în 2013, cu un studiu care a dezvăluit organizarea moleculară complicată a GBM la precizie nanometrică, inclusiv orientarea moleculelor în [37]. Într-un model de șoarece al unui sindrom nefrotic congenital rar, STORM a dezvăluit integrarea și orientarea corectă a lamininei 521 în GBM după injectarea intravenoasă, deschizând calea pentru opțiuni terapeutice avansate pentru pacienți [38]. Un alt studiu a descris organizarea citoscheletului de actină în podocite la o rezoluție la scară moleculară [39] (Figura 3E-I). Ca o nouă descoperire, podocitele conțin fascicule de actină contractilă conectate cu fascicule de actină necontractile în procesele piciorului. În modelele de leziuni ale podocitelor, structura actinei din procesele piciorului a fost dezasamblată, ducând la prăbușirea structurii contractile din corpul principal [39].
VIZUALIZAREA STRUCTURILOR 3D ALE BIOMOLECULELOR FUNDAMENTALE LA NIVEL ATOM: MICROSCOPIE CRYO-ELECTRONA
Până de curând, posibilitatea de a studia structura biomoleculelor fundamentale era limitată la microscopia electronică, cu o rezoluție de câțiva nanometri. Obstacole tehnice, cum ar fi deteriorarea probei prin fascicul de electroni intens, contrastul scăzut al imaginii și mișcările moleculei după interacțiunea cu electronii sau dificultățile de a conserva apa în probele biologice în vid aplicat în interiorul camerei EM, ceea ce face imposibilă rezolvarea moleculelor sub această dimensiune . Răcirea specimenului poate reduce evaporarea apei și daunele induse de electroni [40]. Din această idee, crio-EM a fost introdus în anii 1950. În urmă cu câțiva ani, introducerea unui nou detector de numărare cu un singur electron a împins în sfârșit rezoluția dincolo de limitele anterioare. În 2017, Premiul Nobel pentru Chimie a fost acordat lui Jacques Dubochet, Joachim Frank și Richard Henderson pentru „dezvoltarea microscopiei crio-electronice pentru determinarea structurii de înaltă rezoluție a biomoleculelor în soluție”. Aceste progrese permit acum determinarea structurală a biomoleculelor în soluție [41].
Înrinichicercetări, structurile proteinelor fundamentale au fost determinate la nivel atomic [42, 43]. Printre acestea, structura policistenei umane-2, ale cărei mutații sunt responsabile pentru polichistice autosomal dominante.rinichiboala [44] și structura potențialului receptor tranzitoriu de 6 canale ionice canonice, ale căror mutații cauzează FSGS la om [43], au fost determinate cu o rezoluție de câțiva angstromi [44].
ÎNȚELEGEREA BAZEI MOLECULARE ALE BOLILOR DE RINCHI: MICROSCOPIE INTEGRATIVĂ DE RINCHI
În ultimii câțiva ani s-a observat un interes crescut pentru abordările fără etichete capabile să cartografieze în mod specific și simultan spectrul total de molecule din țesuturi [45]. Printre acestea, spectrometria de masă cu desorbție/ionizare cu laser asistată de matrice (MALDI-IMS) permite măsurarea a sute de molecule diferite în același timp direct pe secțiuni de țesut la rezoluție înaltă. Într-un experiment MALDI-IMS, o secțiune de țesut subțire, înghețată sau încorporată în parafină, este acoperită cu o matrice care absoarbe energia laserului și promovează ionizarea analiților de țesut. Analiza în spectrometrul de masă generează un spectru pentru fiecare coordonată x/y. După măsurarea MALDI, aceeași secțiune de țesut poate fi colorată cu proceduri histochimice și imunohistochimice tradiționale pentru a integra modelul molecular cu detalii histologice. În cercetarea renală, MALDI-IMS este utilizat pentru a studia medicamente, metaboliți, lipide, peptide și proteine în țesuturile normale și bolnave [45].
Una dintre cele mai frecvente aplicații ale MALDI-IMS este identificarea markerilor moleculari pentru clasificarea carcinomului cu celule renale [46] și pentru a stabili marja reală dintre țesutul canceros și normal la nivel molecular, precum și histologic [47]. MALDI-IMS a fost, de asemenea, utilizat cu succes pentru a studia toxicitatea medicamentelor renale pentru a oferi detectarea precoce a substanțelor toxice.rinichimecanisme de deteriorare mediate de candidații farmaceutici [48]. Mai mult, MALDI-IMS este folosit pentru a studia lipidele și rolul lor în patologiile renale, cum ar fi nefropatia diabetică [49], leziunea renală acută [50] și polichistică.rinichiboala [51] și, de asemenea, să dezvăluie profiluri metabolice endogene pentru o înțelegere mai profundă a mecanismelor legate de boală [52]. Identificarea profilurilor moleculare a fost, de asemenea, finalizată pentru posibili biomarkeri care ar putea fi noi potențiali biomarkeri de diagnostic și prognostic [53, 54].
CONCLUZII ȘI PERSPECTIVE DE VIITOR
Îmbunătățirile constante ale tehnicilor de imagistică au rezolvat progresiv multe bariere tehnice critice înrinichicercetări și au permis o prezentare dinamică a structurii și funcției rinichilor normali și bolnavi. Într-adevăr, apariția noilor tehnologii de microscopie a permis descoperiri științifice fundamentale și, ulterior, ne-a schimbat viziunea asupra fiziologiei și fiziopatologiei rinichilor, care pot fi acum vizualizate în 3D și chiar filmate în videoclipuri, unde timpul reprezintă a patra dimensiune. Odată cu inovația tehnologică recentă a microscopiei de super-rezoluție și progresul tehnicilor de imagistică moleculară, cercetătorii pot acum vizualiza bio-molecule individuale direct în țesuturi și pot determina modul în care acestea interacționează la nivel celular și subcelular.
Posibilitatea de a aplica aceste instrumente în patologierinichispecimenele, concentrându-se pe detaliile moleculare și subcelulare din biopsiile clinice, ar trebui să ajute la reclasificarea bolilor. În prezent, nu este clar dacă și când acest lucru va crea un impact asupra diagnosticului bolii renale sau chiar asupra managementului pacientului.
FINANȚAREA
Finanțarea a fost oferită de Consiliul European pentru Cercetare în cadrul programului de cercetare și inovare Orizont 2020 al Uniunii Europene (acord de grant 648274).
REFERINȚE
1. Weening JJ, Jennette JC. Repere istorice în patologia renală. Virchows Arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666
3. Bowman W. Despre structura și utilizarea corpurilor malpighiene alerinichi, cu observatii asupra circulatiei prin acea glanda. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. Ascensiunea patologiei renale în nefrologie: structura luminează funcția. sunt JRinichiDis 2013; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. Microscopie de scanare laser confocală in vivo și micropunctură la șobolani intacți. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25
6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. Blocada CXCL12 regenerează de preferință podocitele pierdute în nefronii corticali prin țintirea unui mecanism de feedback intrinsec al podocitelor-progenitor.RinichiInt 2018; 94:1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. Hipertrofia celulelor tubulare legate de endociclu și proliferarea progenitoare recuperează funcția renală după acutărinichirănire. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Noi perspective asupra modelelor structurale întâlnite în glomeruloscleroza. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Anatomia funcțională arinichi. Hosp Pract 1978; 13
10. Liapis H. Microscopia electronică înrinichicercetare: a vedea înseamnă a crede. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. Strong ML, Evers P. A treia dimensiune în diagnosticul renal. Microscopia electronică cu scanare a rinichilor normali și anormali. S Afr Med J 1979; 55:174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. Imagistica ultrastructurii poroase a fantei de filtrare epitelială glomerulară. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K și colab. Vinculinul este necesar pentru a menține integritatea barierei glomerulare.RinichiInt 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. Procesul morfologic al dezvoltării podocitelor evidențiat de microscopia electronică cu scanare a blocului. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rick R, Dorge A, Beck FX și colab. Microanaliza cu raze X cu sondă de electroni a transportului de ioni transepiteliali.Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Concentrațiile elementare intracelulare în celulele tubulare renale. O analiză cu microsondă electronică. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Novel in vivo techniques to visualizerinichianatomie și funcție. Kidney Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. Excitația multifoton cu lungime de undă lungă este avantajoasă pentru intravitalrinichiimagistica.RinichiInt 2016; 89: 712–719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. Urmărirea soartei celulelor epiteliale glomerulare in vivo folosind imagini multifotonice în serie în noi modele de șoarece cu etichete fluorescente de descendență. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, et al. Imaginile multifotonice relevă diferențe în funcția mitocondrială între segmentele de nefron. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302
