Conjugații de anticorpi imunostimulatori determină activarea mieloidă robustă și imunitate antitumorală durabilă (Partea 1)

Pentru a afla mai multe informații, vă rugăm să contactațidavid.wan@wecistanche.com

Abstract

Receptorii înnăscuți de recunoaștere a modelelor, inclusiv receptorii de tip toll-like (TLR), pot modifica micromediul tumoral și pot primi imunitatea adaptativă anti-tumorală.Cu toate acestea, agoniştii TLR nu au fost bine toleraţi din cauza toxicităţilor asociate cu activarea imună pe scară largă după administrarea sistemică.Pentru a proiecta un tratament care este potrivit pentru livrare sistemică șicapabile să provoace un răspuns țintit pe tumoră, am dezvoltat o nouă clasă de conjugați de anticorpi stimulatori imuno-imunitar (ISAC) care cuprind un agonist TLR7/8 conjugat cu anticorpi care țintesc tumora.ISAC-urile anti-HER2 administrate sistemic au fost bine tolerate in vivo și au provocat activarea robustă a celulelor mieloide intratumorale, ducând la eliminarea tumorii și la memoria imunologică ulterioară.Potența in vitro și eficacitatea in vivo au necesitat activitate tandem condusă de funcționalitatea Fc intactă și agonismul TLR pentru a permite fagocitoza și imunitatea antitumorală mediată de celulele T.Memoria imunologică mediată de ISAC nu a fost limitată la HER2, deoarece șoarecii tratați cu ISAC au fost protejați de reprovocarea cu o tumoare HER2-negativă.Aceste rezultate oferă o justificare puternică pentru dezvoltarea clinică a ISAC și arată că sinergia dintre Fc R și semnalizarea TLR7/8 contribuie la mecanismul imunității anti-tumorale mediate de ISAC.

Click aici pentru a afla mai multe despre Cistanche

Introducere

Înainte de sfârșitul secolului al XX-lea, pacienții cu cancer aveau, în general, trei modalități de tratament disponibile: rezecție chirurgicală, radiații și chimioterapie. Apariția imunoterapiei pentru cancer a adăugat o a patra modalitate puternică care a extins foarte mult repertoriul oncologic, începând cu aprobarea rituximabului pentru limfomul non-Hodgkin și extinzându-se până la adoptarea pe scară largă a inhibitorilor punctelor de control 1,2. Cu toate acestea, orice terapie, inclusiv imunoterapia, este limitată temporal, cu excepția cazului în care generează răspunsuri biologice și imunologice durabile care depășesc eterogenitatea tumorii și povara mutațională 3-5. Inhibitorii punctelor de control, cum ar fi anticorpii anti-PD-1 și PD-L1, îmbunătățesc dramatic rezultatele în mai multe indicații, inclusiv la pacienții cu sarcină mare de mutații tumorale sau instabilitate a microsateliților, iar un factor determinant al susceptibilității tumorii la imunoterapia punctului de control este gradul -infiltrarea celulelor T existente. Pacienții cu tumori „reci” care au un infiltrat rar de celule T răspund mai puțin la blocarea punctului de control și au prognostice mai proaste în comparație cu pacienții cu tumori „fierbinte” în care celulele T reactive la tumori imunodeprimate sunt prezente în micromediul tumoral (TME) 6,7 . Biopsia tumorală și imunohistochimia indică faptul că celulele profesionale prezentatoare de antigen (APC), cum ar fi celulele dendritice (DC) sunt adesea mai frecvente în TME decât celulele T, deși încă susceptibile la mecanismele imunosupresoare 8,9. Având în vedere prezența celulelor mieloide în TME și rolul lor în promovarea activării celulelor T, a existat un efort din ce în ce mai mare de a dezvolta terapii care activează APC-urile asociate tumorii pentru a declanșa o imunitate pe scară largă a celulelor T și un răspuns imun antitumoral eficient.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 donatori. (d) Rituximab a reacţionat cu SATA prin reziduuri de lizină pentru a converti aminele libere în grupări sulfhidril protejate înainte de deacetilare cu hidroxilamină şi reacţia ulterioară cu T785-MCC pentru a produce rituximab-ISAC. (e) Analiza LC-MS a rituximab-ISAC după tratamentul PNGase F. DAR a fost calculată pe baza adăugării masei linker-agonist de 606 g/mol. (f) Rituximab sau rituximab-ISAC marcat fluorescent a fost incubat cu celule tumorale CD20 plus Toledo la 4 grade timp de 2 ore înainte de analiză prin citometrie în flux. Datele provin dintr-un experiment cu probe triplicate și sunt reprezentative pentru 2 experimente.(gh) APC-urile mieloide umane proaspăt izolate au fost cultivate cu rituximab, T785, rituximab și T785 sau rituximab-ISAC în prezența celulelor tumorale CD20 plus Toledo marcate cu CFSE la un raport efector/țintă de 3:1. Concentrația de rituximab este reprezentată pe axa X, concentrația de T785 în aceste teste fiind în concordanță cu cantitatea de T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 donatori (media și SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Acum este bine documentat faptul că administrarea locală de agenți imunostimulatori în modelele preclinice poate reprograma APC rezidente tumorale suprimate în celule activate capabile să proceseze și să prezinte antigene asociate tumorii, inclusiv neoantigene, celulelor T care mediază ulterior imunitatea antitumorală 10-13. . O astfel de strategie inițiată de Carmi și colab. a demonstrat că livrarea intratumorală de anticorpi alogeni care vizează tumora cu un agonist al receptorului Toll-like (TLR)-3 sau cu TNF și CD40L a salvat funcțional APC-uri asociate tumorii conducând la o absorbție îmbunătățită a antigenului și inducerea ulterioară a imunității celulelor T antitumorale. Această strategie de combinație, care a stimulat funcția efectorului anticorpului cu agonistul TLR, a condus la eradicarea tumorilor primare și a leziunilor metastatice și a protejat gazda de recurența tumorii 11,14. În mod similar, un anticorp agonist anti-OX40 în combinație cu un agonist TLR9, CpG, a activat APC și celulele T în cadrul tumorii, rezultând o eficacitate impresionantă împotriva mai multor tipuri de tumori la șoareci 13. Traducerea eficientă a strategiilor de activare a APC în clinică este în curs de desfășurare. investigat în mai multe indicații cu date clinice la pacienții cu melanom care sugerează că administrarea intratumorală de agonişti TLR9 în combinaţie cu anticorpi anti-PD-1 poate duce la micşorarea tumorii și răspunsuri abscopale în leziunile neinjectate 15. În mod similar, mai multe grupurile urmăresc agoniştii TLR7/8 pentru imunoterapie tumorală, deoarece modelul de expresie al TLR7/8 în APC-urile umane oglindeşte mai îndeaproape modelul de expresie al TLR7 şi TLR9 în APC-urile murine16–18. În cele din urmă, adoptarea strategiilor de livrare intra-tumorală, dacă este eficientă, va fi limitată de accesibilitatea tumorii, deoarece livrarea sistemică a agoniştilor imuni care vizează APC-urile a fost restricționată de toxicitate, timpi de înjumătățire scurt și livrare suboptimă la locurile țintă.Scopul nostru a fost să proiectăm un conjugat de anticorpi de stimulare imunitară (ISAC) care să cuprindă un anticorp monoclonal care vizează tumora, conjugat cu un agonist imun, ca o nouă abordare terapeutică pentru a genera imunitate antitumorală durabilă. Administrarea sistemică a ISAC a provocat activarea APC localizată în TME care a fost dependentă de Fcfuncția efectoră și activarea TLR în timp ce eludează toxicitățile tipice asociate cu eliberarea sistemică a agoniştilor TLR. Mai mult, administrarea sistemică a acestor conjugați la șoarecii purtători de tumori a permis procesarea antigenului și prezentarea la celulele T conducând la imunitate antitumorală susținută în mai multe modele care sunt rezistente la anticorpul neconjugat care vizează tumora.

Rezultate

Proiectarea și caracterizarea ISAC Pentru a permite conjugarea unui agonist TLR la un anticorp, au fost folosite instrumente de andocare moleculară pentru a proiecta un nou agonist TLR7/8 (T785) cu o butilamină care a servit ca punct de atașare accesibil solventului la anticorp ( Figura 1A, Figura suplimentară 1A–C). T785 a angajat TLR7 uman cu un EC50 de 0,643 μM și TLR8 uman cu un EC50 de 1,60 μM în linii celulare HEK293 care coexprimă un reporter de fosfatază alcalină secretată inductibil de NF-κB și fie TLR7, fie TLR8 (Figura 1B) ). Specificitatea lui T785 pentru TLR7/8 a fost confirmată de incapacitatea lui T785 de a induce activitatea NF-κB în celulele reporter HEK293 cărora le lipsește expresia TLR7/8 (Figura suplimentară 2A). Pentru a confirma activitatea agonistă în celulele primare, monocitele și DC proaspăt izolate, denumite APC-uri mieloide (~ 96% monocite, 4% DC; Figura suplimentară 3A), care exprimă atât TLR7, cât și TLR8, au fost stimulate peste noapte cu 1 μM T785 sau R848, a agonist TLR7/8 bine stabilit și caracterizat 19. T785 și R848 au stimulat APC-urile mieloide într-o măsură similară (Figura 1C) 20,21. Activitatea lui T785 a fost confirmată și în DC-uri plasmacitoide umane proaspăt izolate (pDC), care exprimă TLR7, dar nu TLR8 (Figura suplimentară 2B). Pentru a investiga efectele ISAC-urilor în culturile umane in vitro, a fost generat un ISAC cu rituximab (Figura 1D), un anticorp monoclonal anti-CD20 validat clinic, utilizat pentru tratamentul tumorilor maligne ale celulelor B, prin conjugare la T785 într-o reacție în mai multe etape. cu agenți de reticulare heterobifuncționali compatibili 22. Eficiența conjugării T785-ISAC a fost măsurată prin LC-MS după glicozilare cu PNGaza F, rezultând un raport mediu medicament-anticorp (DAR) de 1,71 (Figura 1E). Am confirmat că ISAC a păstrat o legare comparabilă la CD20 în urma experimentelor de citometrie în flux cu linia celulară tumorală Toledo care exprimă CD20-, o linie celulară bine caracterizată derivată de la un pacient cu limfom difuz cu celule mari (Figura 1F) 23. T 785-Legarea ISAC la receptorii umani Fc (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) a fost evaluată de Biacore și a fost comparabilă cu rituximab (Tabelul suplimentar 1).ISAC-urile activează APC-urile mieloide umane Potențialul imunostimulator al rituximab-ului T{777 }}ISAC a fost evaluat după cocultura de APC-uri mieloide umane proaspăt izolate cu celule tumorale CD20 plus Toledo marcate cu CFSE timp de 18 ore. APC mieloide cultivate cu rituximab T785-ISAC au suferit modificări morfologice rapide în concordanță cu morfologia DC, în timp ce morfologia DC nu a fost observat în coculturi incubate cu rituximab, T785 sau un amestec echimolar de rituximab și T785 (Figura 1G). APC-urile stimulate cu rituximab T785-ISAC au rămas viabile și dendritice în morfologie timp de până la opt zile, în timp ce APC-urile stimulate cu amestecul au fost în mare parte neviabile în ziua a opta (Figura 1H). Analiza citometriei de flux multicoloredupă 18 ore au indicat că APC-urile stimulate cu rituximab T785-ISAC au reglat în jos CD14 și CD16 și au reglat concomitent CD123, un marker de suprafață celulară care a demonstrat căsă fie reglate în sus pe DC-urile mieloide activate 24. În schimb, APC-urile stimulate cu rituximab,T785 sau amestecul nu au modulat expresia acestor markeri (Figura 1I, Figura suplimentară 4A, strategia de deschidere descrisă în figurile suplimentare 3BC).

APC-urile umane stimulate cu rituximab T785-ISAC au reglat, de asemenea, molecula costimulatoare CD86 într-o manieră dependentă de doză, cu tendințe similare observate cu suprareglarea CD40 și HLA-DR în concordanță cu fenotipul APC-urilor activate (Figura 1I & Figura suplimentară 4B). Modificările dependente de doză ale expresiei markerului de suprafață au fost consecvente indiferent dacă au fost evaluate ca intensitate mediană a fluorescenței (MFI, Figura 1) sau ca procent din populația totală de celule care este pozitivă pentru markerul respectiv (Figura 5 suplimentară). Analiza ulterioară a supernatanților fără celule au demonstrat că APC-urile stimulate de rituximab T785-ISAC au secretat cantități mai mari de TNF și IL{-1 (Figura 2J și Figura suplimentară 4C). Potențialul imunostimulator al T785-ISAC-urilor nu a fost limitat la rituximab, deoarece un T{785-ISAC generat cu trastuzumab a provocat și o activare mieloidă îmbunătățită (Figura suplimentară 4D). Capacitatea APC-urilor stimulate de ISAC de a determina prezentarea antigenului și amorsarea încrucișată a celulelor CD8 plus T a fost evaluată utilizând sistemul antigen model ovalbumină (OVA) 25,26. CD11c splenic plus DC izolate de la șoareci de tip sălbatic au fost cultivate peste noapte cu complexe imune formate cu OVA și fie anticorpul anti-OVA, fie ISAC. DC-urile încărcate cu OVA au fost cuantificate și incubate cu OT-I CD8 plus celule T purtând specificitate TCR pentru peptida OVA, SIINFEKL, complexată cu MHC-I. Prezentare încrucișată îmbunătățită mediată de ISAC anti-OVA, măsurată prin cantitatea de MHC-I, peptidă SIINFEKL legată și amorsare încrucișată îmbunătățită, măsurată prin proliferarea celulelor T CD8 plus (Figurile suplimentare 6A și 6B).ISAC-urile determină TLR amplificat și semnalizarea intracelulară asociată cu Fc R în APC-urile mieloide umane Activarea Fc Rs și TLR induce o cascadă complexă de fosfo-semnalizare, iar amploarea și caracteristicile acestor răspunsuri diferă între diferitele subseturi de celule imune 27. Am investigat căile de semnalizare intracelulară din aval implicate în diverse tipuri de celule din coculturi de tumori PBMC stimulate cu rituximab T785-ISAC în comparație cu controalele de amestec echimolar folosind citometria de masă (CyTOF) 28. Subgrupurile de leucocite (adică monocite, celule CD4 plus T) au fost identificate prin gruparea SPADE folosind markeri de linie. cu celule țintă care cuprind atât celule tumorale CD20 plus Toledo, cât și celule B sănătoase 29. Evenimente de fosforilare asociate cu semnalizarea TLR (pIRF7) și Fc R (pERK1/2) au fost crescute la 15 minute după stimularea cu T785-ISAC în monocite și CDC, în comparație cu amestecul de componente individuale 30,31. Semnalizarea intracelulară a fost în mare măsură limitată la celulele de origine mieloidă (monocite și cDC), precum și la pDC, caretoate exprimă Fc Rs și TLR7 și/sau TLR8 necesare. În monocite și cDC, stimularea indusă de ISAC a dus, de asemenea, la o fosforilare semnificativ mai mare a MAPKAPK2, p38, CREB și proteinei ribozomale S6 (RPS6), o cerință pentru inițierea sintezei proteinelor în aval (Figura 2A-C și Figura 7A suplimentară). CD141 plus cDC și CD1c plus cDC au prezentat niveluri comparabile de pIRF7 în ambele subseturi de CDC, în timp ce nivelurile de RPS6 și pERK1/2 au avut o tendință mai mare în CD141 plus cDC, care excelează în amorsarea celulelor CD8 plus T și prezentarea încrucișată a antigenului, în comparație cu CD1c plus CDC (Figura suplimentară 7B).

Cinetica stimulării T785-ISAC a fost în concordanță cu dinamica de semnalizare așteptată: fosforilarea ERK1/2 a atins vârful după 5 minute, în timp ce partenerul său din aval RPS6 nu a atins fosforilarea maximă până la punctul de timp de 15-minut (suplimentar Figura 7C). Această cinetică susține dinamica așteptată pe măsură ce semnalizarea se propagă în timp și sugerează că există un răspuns de semnalizare susținut și amplificat la stimularea ISAC a APC-urilor. Având în vedere răspunsul amplificat observat după stimularea ISAC asociată cu căile de semnalizare Fc R și TLR, apoi am utilizat algoritmii de estimare a informațiilor reciproce cu densitate resampled condiționată (DREMI) și de vizualizare rescalată de densitate condiționată (DREVI) pentru a cuantifica puterea relațiilor perechi în cadrul căile de semnalizare Fc R și TLR 32. Acești algoritmi generează diagrame DREVI pentru vizualizare, unde aria de sub curbă (AUC) este un indicator al intensității generale a semnalului, punctul de inflexiune (IP) este o măsură a pragului de activare și Scorul DREMI cuantifică dependența perechi a celor două fosfoproteine ​​în cauză. Această analiză a identificat scoruri DREMI crescute care indică o dependență îmbunătățită în perechi între proteinele asociate cu căile de semnalizare Fc R și TLR în urma stimulării T785-ISAC în comparație cu controalele amestecului echimolar (Figura 2D). O interdependență puternică între pERK1/2 și pIRF7 a fost observată în mod unic după stimularea cu T785-ISAC, dar nu amestec, așa cum este indicat de un scor DREMI crescut, intensitatea semnalului amplificat și pragul de activare redus necesar pentru fosforilarea IRF7 (Figura 2D). ). Această analiză a indicat, de asemenea, un prag de activare redus necesar pentru a iniția translația proteinei (fosforilarea RPS6) după stimularea ISAC, așa cum este cuantificat prin scoruri DREMI crescute și IP-uri reduse pentru combinațiile perechi de pERK1/2-pRPS6 și pIRF7-pRPS6 . În plus, nivelul de fosforilare RPS6 a fost amplificat ca urmare a fosforilării ERK1/2 sau IRF7, determinată de AUC-uri perechi crescute (Figura 2D). Aceste rezultate combinate nu numai că confirmă semnalizarea ISAC prin căile așteptate Fc R și TLR, dar, în plus, susțin sinergia între cele două căi, rezultând praguri de activare reduse și intensități de semnal amplificate.

Figura 3: ISAC necesită funcția efector Fc și agonist TLR pentru a media activarea mieloidă. APC-urile mieloide umane proaspăt izolate au fost cultivate timp de 18 ore în prezența celulelor tumorale CD20 plus Toledo la un raport efector/țintă de 3:1 și (a) 80 nM de rituximab-ISAC cu sau fără 1 μM R406, (b) rituximab-ISAC pe izotipul de anticorpi indicat, (c) rituximab-ISAC sau rituximab-ISAC glicozilat (ISAC-deglicozilat). (ac) Celulele au fost analizate prin citometrie în flux și datele sunt raportate ca intensitate medie a fluorescenței. ( d ) Celulele reporter HEK-Blue-TLR7 sau TLR8 au fost cultivate timp de 18 ore în prezența T785 sau TLRnull înainte de evaluarea activității SEAP indusă de NF-κB. Datele afișate suntdintr-un experiment și reprezentativ pentru cel puțin 3 experimente. (e) APC-urile mieloide umane proaspăt izolate au fost cultivate timp de 18 ore în prezența celulelor tumorale CD20 plus Toledo și a rituximab-ISAC-urilor indicate și au fost analizate prin citometrie în flux (datele prezentate ca medianăintensitatea fluorescenței). (ae) Datele afișate sunt reprezentative pentru 1-4 experimente suplimentare și Mai mare sau egal cu 3 donatori pentru fiecare experiment (medie și SEM). Semnificația statistică este definită ca *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC-urile necesită funcția efector Fc pentru a media activarea APC-urilor mieloide. Contribuția activității Fc la funcția ISAC a fost investigată după ablația semnalizării Fc R în aval cu R406, o moleculă mică inhibitoare a kinazei Syk care previne transducția semnalului în aval de activarea Fc Rs 33,34. . Adăugarea de R406 a abrogat activarea mieloidă mediată de T785-ISAC, așa cum este evidențiată de lipsa de reglare ascendentă a moleculei costimulatoare CD{86, dar nu a modificat răspunsul celular la activarea TLR7/8 de către T785 (Figura 3A). & Suplimentar Figura 8). Inhibarea Syk cu R406 a abrogat, de asemenea, semnalizarea a fost observată în monocite după stimularea T785-ISAC, cuniveluri reduse semnificativ de MAPKAPK-2, ERK1/2 și IRF7 fosforilat (Figura suplimentară 7D).Având în vedere aceste date, rituximab T785-ISAC au fost formulate cu DAR comparabile pentru fiecare dintre cele patru izotipuri naturale pentru a defini măsura în care activitatea T{785-ISAC variază în funcție de afinitățile de legare Fc R cunoscute 35,36. ISAC-urile de rituximab glicozilat și fucozilat au fost, de asemenea, investigate, deoarece glicozilarea abate legarea Fc R, în timp ce fucozilarea crește afinitatea de legare pentru FCGR3A 37. Capacitatea imunostimulatoare a rituximab T785-ISAC a corelat cu afinitatea Fc R a izotipului anticorpului (figura 3B). În schimb, IgG1 (IgG1-AF) fucozilate, IgG1 de tip sălbatic și IgG3 T785-ISAC au provocat activarea mieloidă, cu IgG1-AF T{785-ISAC inducând cea mai mare nivelurile de reglare ascendentă a CD86 (Figura 3B). Glicozilarea rituximabului T785-ISAC de tip sălbatic cu PNGaza F, care reduce afinitatea de legare a Fc-Fc R, a dus la diminuarea activității de stimulare a imunității ISAC in vitro, susținând importanța unei regiuni Fc activă funcțional (Figura 3C).

ISAC-urile necesită agonismul TLR pentru a media activarea mieloidă. Contribuția activității TLR asupra funcției ISAC a fost investigată în urma ablației agonismului TLR prin îndepărtarea 2-aminopiridinei din T785 despre care se crede că formează o punte de sare cu reziduuri critice de aspartat în legare. buzunare de TLR7 și TLR8 38 (TLRnull, Figura 3D). Compusul TLRnull a fost conjugat cu rituximab (TLRnull ISAC) și evaluat pentru potențialul de activare mieloidă în prezența celulelor tumorale CD20 plus in vitro. ISAC TLRnull nu a indus reglarea în sus a moleculei costimulatoare CD86 și nici nu a modulat expresia CD14 sau CD123, indicând faptul că agonismul TLR este necesar pentru fenotipul de activare observat cu T785-ISAC (Figura 3E). În plus, TLRnull ISAC nu a indus fosforilarea IRF-7 în monocite, în concordanță cu incapacitatea sa de a angaja TLR7/8 (Figura suplimentară 7E). Trastuzumab T785-ISAC administrat sistemic elimină tumorile în absența Activitatea celulelor B, T sau NK în modelele de tumori cu xenogrefă umană Capacitatea ISAC de a induce distrugerea mediată de mieloide și neutrofile a tumorilor solide în absența activității celulelor B, T și NK a fost evaluată folosind modele de xenogrefă umană 39,40. Trastuzumab, un anticorp care vizează HER2-validat clinic, a fost selectat pentru investigație pentru a determina dacă trastuzumab T785-ISAC ar putea depăși rezistența tumorii la trastuzumab în modelele HER2 plus tumori solide (Figura 4 și Figura 9 suplimentară) ) 41,42. În primul rând, administrarea sistemică de trastuzumab T785-ISAC a fost comparată cu administrarea intratumorală a unui amestec de trastuzumab și T785. Trastuzumab T785-ISAC a provocat regresia și clearance-ul tumorii, în timp ce livrarea unui amestec echimolar de componente a oferit un beneficiu terapeutic minim în comparație cu trastuzumab în monoterapie (Figura 4A). Studiile ulterioare care au comparat ISAC-uri țintite pe tumori cu controalele lor izotip adecvate au confirmat că activitatea anti-tumorală necesită țintirea tumorii (Figura 4B și Figura 10 suplimentară). Este important că administrarea sistemică a trastuzumab T785- ISAC și controlul izotipului acestuia au fost bine tolerate, cu impact minim asupra greutății corporale (Figura suplimentară 11).Pentru a determina dacă mecanismul de acțiune care contribuie la eficacitatea ISAC in vivo este similar cu cel descris in vitro, Fc-incompetent (trastuzumab N297A-ISAC) și trastuzumab TLRnull-ISAC au fost testate în același model de xenogrefă de tumoare mamară înparalel cu un trastuzumab T785-ISAC de tip sălbatic.În timp ce trastuzumab T785-ISAC a condus la regresia și clearance-ul tumorii, atât ISAC-ul Fc-incompetent, cât și TLRnull nu au reușit să provoace activitate antitumorală (Figura 4C).Împreună, aceste date indică o cerință pentru țintirea tumorii și angajarea Fc R și TLR pentru activitatea antitumorală ISAC.

Contribuția diferențială a neutrofilelor față de alte celule mieloide în mediarea efectelor antitumorale a fost evaluată prin epuizări specifice celulei.Neutrofilele au fost epuizate folosind un anticorp Ly6G, în timp ce epuizarea atât a neutrofilelor, cât și a APC-urilor imature (monocite)a fost realizat cu un anticorp anti-Gr1.Celulele fagocitare au fost epuizate folosind lipozomi încărcați cu clodronat.Am descoperit că celulele fagocitare, probabil macrofagele, au contribuit semnificativ la mediarea activității anti-tumorale după tratamentul ISAC (Figura 4D).Cu toate acestea, epuizarea neutrofilelor cu anti-Ly6G nu a avut niciun impact asupra eficacității ISAC.Depleția Gr1 nu a afectat imediat eficacitatea mediată de ISAC, dar a redus durata controlului tumorii (Figura 4D).Pentru a investiga capacitatea T785-ISAC-urilor de a controla creșterea tumorii în modelele cu mai miciExpresia HER2, am modelat apoi eficacitatea în modelul tumoral rezistent la trastuzumab, HER2-exprimând mediu, JIMT-1.Se estimează că linia de celule canceroase JIMT-1 are aproximativ 6,5 x105 copii ale HER2 de suprafață și exprimă un nivel redus deHER2 în comparație cu linia de celule tumorale HCC1954 prin citometrie în flux 43.In timp cetrastuzumab T785-ISAC a încetinit semnificativ creșterea tumorii în comparație cu izotipul ISAC sau martorii cu trastuzumab, nu s-a observat nicio regresie sau clearance-ul tumorii (Figura 4E).Am emis ipoteza că pertuzumab, care leagă un epitop HER2 distinct de locul de legare al trastuzumab, ar crește gruparea Fc și, ulterior, ar spori ADCP și eficacitatea ISAC în modelul JIMT-1.Combinația dintre trastuzumab T785-ISAC cu pertuzumab a condus la o eficacitate îmbunătățită semnificativ și la o regresie semnificativă a tumorii (Figura 4F).Fără stimularea imună a trastuzumab T785-ISAC, combinația de pertuzumab cu trastuzumab nu a oferit niciun beneficiu.

Apoi am investigat evenimentele moleculare și celulare declanșate de trastuzumab T785-ISAC care au ca rezultat eficacitatea antitumorală.Modificări precoce ale expresiei genelor în tumoriau fost măsurate cu panoul de profilare imună pan-cancer de șoarece NanoString, dezvăluind o reglare semnificativă a 13,7% din gene în 24 de ore de la tratament, inclusiv gene asociate cu semnalizarea și activarea TLR7 (IRF-7, gene asociate NF-kB)comparativ cu 0-0,1% după tratamentul cu trastuzumab sau izotip T785-ISAC (Figura 4G) 44.Analiza căilor de exprimare a genelor evaluate de Scorul de analiză avansată a căii nSolver a evidențiat o reglare semnificativă a semnăturilor cheie ale genelor legate de imun (funcții macrofage, funcții DC, procesare și prezentare antigene) care au fostîn concordanță cu constatările in vitro și in vivo că interacțiunile Fc-Fc R sunt critice pentru activitatea mediată de ISAC (Figura 4H și Figura 12 suplimentară).Scorurile semnăturii genelor asociate cu chemokine și citokine au fost foarte ridicate după tratamentul cu trastuzumab T785-ISAC, în concordanță cu cuantificarea proteinelor efectuată prin măsurarea secreției de citokine și chemokine în tumoră la 24 de ore după administrare (Figura 4H).și Figura suplimentară 13).Aceste constatări, în concordanță cu datele de eficacitate in vitro și in vivo, indică un răspuns robust mediat de TLR și Fc R este indus de ISAC.

Citometria în flux și IHC au fost utilizate pentru a evalua dacă creșterea activării mediate de T785-ISAC și a expresiei chemokinelor au condus în cele din urmă la recrutarea de celule efectoare imune.Infiltratele imune mieloide au fost profilate prin citometrie în flux la 24 de ore și 7 zile după administrarea unei doze unice de trastuzumab T785-ISAC sau trastuzumab și au fost comparate cu martorii netratați.Analiza tumorilor la 24 de ore după tratament a evidențiatinfiltrarea CD11b plus Ly6C plus monocite și CD11b plus Ly6G plus granulocite în tumorile tratate cu trastuzumab sau trastuzumab T785-ISAC în comparație cu controalele netratate (Figura 4I).La șapte zile după tratament, CD11b plus CD11c plus F4/80 plus APC mieloide pozitive au fost semnificativ crescute în grupul tratat cu trastuzumab T785-ISAC în comparație cutrastuzumab sau controale netratate (Figura 4I) 45,46.Această creștere a APC-urilor mieloide poate fiatribuită creșterii semnificative a producției de chemokine legate de mieloide după tratamentul cu trastuzumab T785-ISAC.Deși nu a existat o creștere semnificativă a frecvenței APC-urilor mieloide la 24-ora, celulele acestui fenotip au fost activate după tratamentul cu trastuzumab T785-ISAC, măsurată prin reglarea ascendentă a CD40 pe suprafața celulei. , în comparație cu aceeași populație din trastuzumab sau martori netratați (Figura 4I).Această descoperire, împreună cu datele NanoString, demonstrează și mai mult capacitatea trastuzumab T785-ISAC de a angaja și activa celulele mieloide în micromediul tumoral.Având în vedere pozitivitatea CD11b a APC-urilor mieloide observată la o săptămână după tratament, infiltratul precoce de monocite poate fi precursori ai populației de APC-uri mieloide care se maturizează în tumorile tratate cu ISAC, dar nu și în tumorile tratate cu trastuzumab.Cu toate acestea, rămâne de determinat modul în care evenimentele proximale proinflamatorii măsurate la 24 de ore după stimularea ISAC de către NanoString și MSD au influențat în cele din urmă evenimentele distale, cum ar fi maturarea celulelor mieloide în micromediul tumoral în transformare, la 6-punct de timp mai târziu al zilei. și, în cele din urmă, a influențat regresia și clearance-ul tumorii.
În cele din urmă, IHC a fost efectuat pentru a evalua prezența și localizarea populațiilor cheie de celule imune în tumoră după tratamentul cu trastuzumab T785-ISAC în comparație cu martorii acestuia.În conformitate cu citometria în flux din ziua 7, celulele care exprimă F4/80 întumora și regiunea peritumorală au fost crescute în ziua 9 după un singur tratament cu trastuzumab T785-ISAC (Figura 4J).În plus, tratamentul ISAC țintit a dus la o creștere dramatică a celulelor CD11c plus în regiunea peritumorală care nu a fost observată după tratamentul cu anticorpi rHER2 sau tratamentul cu izotip sau izotip-ISAC (Figura 4J).Creșterea celulelor CD11c plus atât prin citometria în flux, cât și prin IHC a fost, de asemenea, evidențiată în datele NanoString, în care expresia ARNm a ITGAX a fost crescută semnificativ în zilele 6 și 9 după administrarea trastuzumab T785-ISAC (Figura suplimentară 14).

Figura 5: T785-ISAC-urile provoacă efecte anti-tumorale robuste în modelul tumoral singeneic MMC. (ah) Șoarecii FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) au fost implantați cu linia celulară tumorală MMC. (a) Șoarecii femele au fost randomizați atunci când volumul tumorii a atins aproximativ 500 mm3. Soarecii au fost apoi tratați prin injecție intraperitoneală cu 5 mg/kg q5d x 2 de anticorp anti-șobolan HER2 de șoarece, anti-șobolan HER2 T785-ISAC sau izotip T785-ISAC (TA99) (n =4-7 șoareci pe braț). (b, c) Șoarecii masculi au fost randomizați atunci când volumul tumorii a atins aproximativ 500 mm3 și au fost pre-tratați începând cu o zi înainte de data tratamentului inițial cu lipozomi încărcați cu clodronat sau control pentru epuizarea fagocitelor (6 cicluri, până în ziua 15) sau anti -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >La 60 de zile după ultimul lor tratament au fost provocate cu linia de celule tumorale MMC. Șoarecii naivi cu tumoare au servit drept martori de implantare (n=5 șoareci per grup). (ad) Datele sunt reprezentative pentru cel puțin 2 experimente. Șoarecii au fost eutanasiați în mod uman odată cu tumoria ajuns la 2,000 mm3. Sunt prezentate date pentru acele grupuri în care nu a ajuns nicio tumoare2,000 mm3. (ei) Cohortele de șoareci au fost randomizate atunci când volumele tumorale ale tumorilor MMC au atins aproximativ 500 mm3 și au fost tratate cu 5 mg/kg ISAC sau anticorpi de control dozați în ziua 0 și ziua 5. Tumorile au fost procesate pentru măsurarea citokinelor prin MSD , analiza citometriei în flux, cuantificarea ARNm NanoString sau fixată cu formalină și încorporată în parafină pentruimunohistochimie la momentele arătate. (e) Diagramele vulcanilor descriu modificarea log2 a expresiei genei în tumorile tratate față de controlul izotipului măsurate prin NanoString la 24 de ore (n =5 șoareci per grup). Modificările cu o valoare p ajustată de < 0.05="" sunt="" afișate="" cu="" roșu.="" (f)="" scorurile="" semnăturii="" genelor="" cuantificate="" prin="" scorul="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" pentru="" tumorile="" analizate="" la="" 24="" de="" ore="" după="" tratament="" (n="5" șoareci="" per="" grup).="" (g,="" h)="" analiza="" citometriei="" în="" flux="" a="" compoziției="" celulare="" tumorale="" și="" a="" stării="" de="" activare="" la="" 24="" de="" ore="" și="" 6="" zile="" după="" inițierea="" tratamentului="" (n="4" șoareci="" per="" grup).="" datele="" sunt="" reprezentative="" pentru="" cel="" puțin="" 2="" experimente.="">Imagini reprezentative, precum și cuantificarea F4/80, CD11c și CD8 IHC ale tumorilor recoltate la 6 zile după fiecare tratament indicat. Barele de scară sunt de 50 μm. (ai) Datele sunt raportate ca medie și SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

T785-ISAC-urile vizate de tumori provoacă regresia tumorii în modelul tumoral MMC singeneic
Pentru a evalua capacitatea ISAC de a media eficacitatea antitumorală în prezența celulelor B, T și NK, am folosit o linie celulară de carcinom mamar de șoarece care exprimă HER2 (rHER2) de șobolan singeneic (MMC) care a fost derivată dintr-o mamă spontană. carcinom la șoarecii rHER2- care exprimă FVB.Pentru a minimiza imunogenitatea între specii asociată cu expresia rHER2 în MMC, șoarecii transgenici care exprimă în mod endogen Her2 de șobolan sub controldin promotorul MMTV au fost utilizați ca gazdă (Figura suplimentară 15) 47. Utilizând prezența unui sistem imunitar complet intact, ne-am propus să evaluăm capacitatea ISAC de a combate tumorile cu o sarcină tumorală mare de 500 mm3, deoarece tumorile mai mari sunt în general mai dificil de tratat în modelele preclinice 48. Administrarea sistemică a tuturor tratamentelor, inclusiv a rHER2 T785-ISAC, a fost bine tolerată, cu impact minim asupra greutății corporale (Figura suplimentară 16A). Cu toate acestea, numai rHER2 T785-ISAC a fost capabil să vindece șoarecii purtători de tumori mari, stabilite (Figura 5A). După cum s-a văzut în modelul de xenogrefă, studiile de epuizare celulară au arătat că activitatea anti-tumorală semnificativă a fost pierdută atunci când celulele fagocitare au fost epuizate cu lipozomi încărcați cu clodronat (Figura 5B). În timp ce ISAC nu este de așteptat să acționeze direct asupra celulelor T, șoarecii pretratați cu un anticorp care epuizează CD8-și-au pierdut capacitatea de a curăța tumorile după două administrări de rHER2 T785-ISAC (Figura 5C). Acest lucru sugerează că ISAC-urile vizate de tumoră pot acționa indirect prin intermediul celulelor T, în urma prezentării antigenelor asociate tumorii. În concordanță cu prezența memoriei imunologice, șoarecivindecate de tumorile MMC în urma tratamentului cu rHER2 T785-ISAC au fost protejate împotriva reprovocarii tumorii (Figura 5D).

Pentru a investiga în continuare mecanismul care stă la baza eficacității ISAC în modelul singeneic, am investigat apoi modificările celulare, transcripționale și ale citokinelor în micromediul tumoral după dozarea ISAC. Două cohorte de șoareci purtători de tumori MMC mari au fost tratate cu rHER2 T785-ISAC sau martori. Tumorile din prima cohortă au fost recoltate la 24 de ore după dozare (Ziua 1) când toate tumorile au fost de dimensiuni similare (Figura suplimentară 16B). Cealaltă cohortă a primit o a doua doză la 5 zile după prima, apoi a fost recoltată 24 de ore mai târziu (Ziua 6), moment în care tumorile din toate grupurile de tratament au crescut măsurabil, cu excepția celor tratate cu T785-ISAC (Figura suplimentară 16B). ). Tumorile au fost analizate prin IHC, expresia ARNm și secreția de citokine în lizate de proteine. În plus, susținând observațiile noastre în modelele de xenogrefă conform cărora țintirea tumorii este necesară pentru activitatea ISAC, analiza ARNm a tumorilor la 24 de ore după tratamentul cu rHER2 T785-ISAC a arătat o reglare pozitivă dramatică a 34,1% din genele din sistemul imunitar pan-cancer de șoarece NanoString. panou de profilare comparativ cu tumorile tratate cu izotip. Numai anticorpul anti-rHER2 a avut un impact ușor asupra expresiei genelor (3,5% din genele analizate), în timp ce izotipul T785-ISAC nețintit nu a afectat expresia genei (Figura 5E). După cum se vede în modelul de xenogrefă HCC1954, genele asociate cu semnalizarea și activarea mediate de TLR au fost reglate în mod semnificativ de către rHER2 T785-ISAC care vizează tumora, indicând un răspuns robust mediat de TLR (Figura 5E). Analiza căii de expresie a genelor a dezvăluit din nou o reglare semnificativă a semnăturilor genelor cheie legate de imun, inclusiv semnături pentru analiza căii de expresie a genelor, a evidențiat o reglare semnificativă a semnăturilor cheie ale genelor legate de imun după tratamentul rHER2 T785-ISAC, inclusiv cele asociate cu chemokine și citokine (Figura 5F). Cuantificarea proteinelor a fost efectuată pe aceleași tumori ca cele analizate de NanoString și, în concordanță cu constatările semnăturii genei, au fost măsurate niveluri semnificativ crescute de citokine și chemokine proinflamatorii la 24 de ore după tratamentul cu rHER2 T785-ISAC (Figura 17 suplimentară). ). Scorurile semnăturii genelor au fost, de asemenea, semnificativ crescute pentru procesarea și prezentarea antigenului, funcția celulelor dendritice și funcția macrofagului, susținând în continuare răspunsul mediat de anFc-Fc R și cel determinat de fagocitoză la 24 de ore după rHER2 T785-ISACtratament (Figura 5F și Figura suplimentară 18). În plus față de scorurile semnăturii genetice semnificativ crescute afiliate cu un răspuns robust mediat de TLR și Fc R, scorul de semnătură genică pentru funcțiile celulelor T a fost, de asemenea, crescut semnificativ în 24 de ore de la tratamentul cu rHER2 T785-ISAC, susținând în continuare constatând că celulele T sunt necesare pentru eficacitatea mediată de ISAC (Figura 5F și Figura 18 suplimentară).

Pentru a caracteriza celulele imune care pot contribui la creșterea timpurie a producției de citokine și chemokine proinflamatorii, tumorile au fost analizate prin citometrie în flux la 24 de ore după prima doză de rHER2 T785-ISAC sau la martori și la 6 zile după inițierea tratamentului. tratament, la 24 de ore după a doua doză. Analiza tumorilor în ziua 1 a evidențiat infiltrarea CD11b plus Ly6C plus monocite în tumorile tratate cu rHER2 T785-ISAC și CD11b plus Ly6G plus granulocite în tumorile tratate cu rHER2 mAb sau rHER2 T{785-ISAC , dar nu izotipul ISAC sau controalele de anticorpi izotip (Figura 5G). Nivelurile de monocite au crescut și mai mult în tumorile tratate cu rHER2 T785-ISAC după 6 zile. Similar cu ceea ce am observat în modelul de xenogrefă HCC1954, APC-urile mieloide (CD11b plus CD11c plus F4/80 plus) au fost semnificativ crescute în ziua 6 după tratamentul cu rHER2 T785-ISAC în comparație cu martorii (Figura 5G și Figura 19 suplimentară). ). În plus, s-a constatat că APC-urile mieloide sunt activate în mod specific în grupul tratat cu rHER2 T785- ISAC în ambele momente, măsurate prin reglarea în sus a CD40 pe suprafața celulei (Figura 5H). Este important că o creștere a APC-urilor mieloide tumorale nu a fost măsurată după epuizarea fagocitelor folosind lipozomi încărcați cu clodronat (Figura suplimentară 20). În cele din urmă, IHC a fost efectuat pentru a evalua prezența și locația populațiilor cheie de celule imune în modelul MMC după tratamentul cu rHER2 T785-ISAC. După cum sa observat în modelul de xenogrefă HCC1954, tratamentul cu rHER2 T785-ISAC a dus la o creștere dramatică a celulelor CD11c plus și F4/80 plus în regiunea peritumorală care nu a fost observată după tratamentul cu anticorpi rHER2 sau tratamentul cu izotip. sau izotipul T785-ISAC (Figura 5I). În concordanță cu expresia timpurie a chemokinelor celulelor T și scorul crescut de semnătură a genei pentru funcția celulelor T, IHC a observat o infiltrare semnificativă a celulelor CD8 plus în tumorile șoarecilor tratați cu rHER2 T785-ISAC în ziua a 6-a, în timp ce Colorarea CD8 la șoarecii tratați cu anticorpi anti-rHER2 sau controale de izotip a rămas scăzută (Figura 5I). Creșterea colorației CD8 plus IHC, împreună cu expresia genică amplificată a genelor asociate funcției celulelor T și clearance-ul tumorii dependent de CD8-, susțin potențialul T{785-ISAC de a transforma o tumoare rece la cald.CL{ {58}}ISAC-urile provoacă regresia tumorii în modelul de tumoră xenogrefă care exprimă mediul HER2-Pentru a demonstra că ISAC-urile sunt o platformă robustă pentru mai multe sarcini utile de stimulare a imunității, am dezvoltat un ISAC folosind un agonist TLR7 bine-cunoscut, CL264 cu un DAR comparabil cu trastuzumab T785-ISAC (Figura 6A și Figura 21 suplimentară). Capacitatea ISAC-urilor trastuzumab produse cu CL264 sau T785 de a media activarea mieloidă intratumorală a fost evaluată în modelul de xenogrefă HCC1954 la 24 de ore după o singură administrare de trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC sau trastuzumab T{{{73}ISAC} . Activarea mieloidă îmbunătățită a fost observată cu trastuzumab CL264-ISAC, evidențiată prin creșterea expresiei CD40 pe CD11b cu infiltrare tumorală plus CD11c plus F4/80 plus APC-uri mieloide în comparație cu trastuzumab sau trastuzumab T785-ISAC (Figura 6B ).Pentru a determina dacă capacitatea îmbunătățită de activare mieloidă a CL264-ISAC s-a tradus la o activitate antitumorală mai mare in vivo, trastuzumab CL264-ISAC a fost comparat cuT785-ISAC în modelele tumorale HER2High HCC1954 și HER2Med JIMT-1. În timp ce amândoiISAC-urile trastuzumab au mediat regresia completă a tumorii în modelul HCC1954 HER2High, CL264-ISAC a demonstrat o activitate antitumorală crescută în modelul JIMT-1 HER2Med, sugerând că potența ISAC și capacitatea de a viza tumorile cu densitate mai mică de antigen pot să fie legate (Figura 6C–D).

Ambele ISAC au fost bine tolerate, dar am observat o pierdere tranzitorie în greutate corporală de 5-10 procente la animalele tratate fie cu trastuzumab CL264-ISAC, fie cu rituximab CL264-ISAC, greutatea corporală revenind la sau peste valoarea inițială cu a treia doză (Figura suplimentară 16A). Secreția sistemică de citokine a fost măsurată în urma tratamentului cu T785-ISAC sau CL264-ISAC. Nivelurile scăzute de TNF au fost măsurate în serul animalelor la patru ore după administrarea T785-ISAC, în timp ce atât CL264-ISAC țintă, cât și izotipul CL264-ISAC au provocat niveluri mai mari de secreție de TNF la nivel sistemic (Figura 11 suplimentară) . Este puțin probabil ca aceste efecte între ISAC-urile T785 și CL264 să se fi datorat unui impact direct al ISAC asupra creșterii celulelor tumorale, deoarece ISAC nu a inhibat proliferarea celulelor canceroase in vitro (Figura 9 suplimentară).

CL264-ISAC determină clearance-ul tumorii și memorie imunologică în modelele tumorale singenice Având în vedere potența și eficacitatea crescute observate cu CL264-ISAC în modelele de xenogrefă tumorală umană cu densitate variată de antigen HER2, am caracterizat apoi activitatea CL 264-ISAC în modelele de tumori singeneice. Similar cu T785-ISAC din modelul MMC, CL264-ISAC a condus la regresia și eliminarea tumorii într-o manieră dependentă de celulele T, conducând la o memorie imunologică durabilă (Figura suplimentară 22A). Pentru a evalua eficacitatea ISAC într-un model de tumoră singenică cu expresie redusă a antigenului, am dezvoltat o linie celulară CT26 care exprimă stabil HER2 de șobolan (CT26-rHER2). Important este că aproximativ 8,5% dintre celulele CT26 nu exprimă rHER2 după implantarea tumorii (Figura 6E). Șoarecii Wildtype Balb/c tratați cu rHER2 CL264-ISAC au prezentat o imunitate antitumorală substanțială, deoarece 75% (6 din 8) dintre șoareci și-au curățat tumorile și au rămas fără tumori pe toată durata experimentului, în timp ce niciunul dintre șoarecii tratați cu anticorpul anti-rHER2 nu a avut regresie completă (Figura 6F). S-a observat o pierdere tranzitorie în greutate de aproximativ 10 la sută din greutatea corporală după tratamentul cu rHER2 CL264-ISAC, greutatea corporală revenindu-se la opt zile după inițierea studiului (Figura suplimentară 22B). Am evaluat dacă rHER2 CL264-ISAC a mediat memoria imunologică împotriva unei tumori care nu are expresia antigenului vizat, rHER2, provocând șoarecii vindecați anterior de tumori CT26-rHER2 cu linia celulară parentală CT26 care nu avea rHER2 expresie. Șoarecii vindecați anterior de tumori CT26-rHER2 cu rHER2 ISAC au fost complet protejați de provocarea cu linia celulară parentală CT26 (Figura 6I). Depleția celulelor T CD4 și CD8 înainte de reprovocarea tumorii a arătat că celulele T sunt necesare pentru protecție. În cele din urmă, am testat dacă memoria imunologică dezvoltată la șoarecii tratați anterior cu ISAC a fost specifică antigenelor asociate tumorii ai tumorii primare tratate. În timpul reprovocarii tumorii parentale CT26, șoarecii au fost provocați simultan cu o tumoare diferită, 4T1, implantată în flancul contralateral. Datele arată că dezvoltarea memoriei imunologice a fostspecific pentru antigenele asociate tumorii CT26 distincte de rHER2, deoarece creșterea tumorii tumorilor 4T1 nu a fost afectată (Figura 6G).