Combinații de medicamente sinergice pe bază de siliciu din plante medicinale: Un caz de utilizare a Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Modulul de neuroprotecție

Neuroprotecția reprezintă mecanismele și strategiile utilizate pentru a proteja împotriva leziunilor neuronale sau a degenerării sistemului nervos central în urma unor tulburări acute (de exemplu, accident vascular cerebral sau leziuni/traume ale sistemului nervos) sau ca urmare a unor boli neurodegenerative cronice (de exemplu, Parkinson, Alzheimer, scleroză multiplă). Scopul neuroprotecției este de a limita disfuncția neuronală/decesul după leziuni ale SNC și de a încerca să mențină cel mai înalt nivel.

posibila integritate a interacțiunilor celulare din creier, rezultând o funcție neuronală netulburată. După cum se poate observa din Fig. 4, unele ținte de pe calea sinapselor serotoninergice sunt implicate în funcția de neuroprotecție. De exemplu, producția de prostaglandine prin PTGS1 și PTGS2 (cunoscută și ca COX-1 și COX{-2) este un mediator esențial în evocarea mecanismelor antiinflamatorii și noi pro-rezolvare56. Un studiu recent a arătat că expresia genică a ADCY5, o enzimă care catalizează generarea cAMP57, este redusă prin metilarea promotorului în liniile celulare HCC umane induse de COX-2-58. Pe baza analizei de mai sus, speculăm că acumularea de COX-2 poate influența secreția de sAPP, scindarea APP clivată de -secretază care este modulată de cAMP și exercită în continuare efectul neuroprotector59,60. Rezultatele noastre arată că neuroprotecția joacă un rol important în tratamentul neuroinflamației.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU PREVENIREA BOLII PARKINSON FUNȚIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Validare experimentală

Viabilitatea celulelor microglia BV2 tratate cu compuși

Celulele microglia BV2 (8 × 104 celule/ml) sunt alimentate cu concentrații de 37,5 până la 300 μM per mililitru de mediu de cultură fără ser al celor patru compuși timp de 24 de ore. Considerăm viabilitatea celulară a grupului de control cultivat în absența serului cu mai puțin de 0,1% DMSO ca fiind 100% (Fig. 5 (a-d)). Nu se observă citotoxicitate celulară semnificativă la dozele prescrise ale grupurilor.

Validarea sinergiei medicamentelor și a potențialului efect antiinflamator in vitro

Pentru a evalua în continuare rezultatele obținute in silico, sunt selectați patru compuși care acoperă trei perechi sinergice, și anume izoacteozidă, 2′-acetilacteozidă, echinacozidă și verbascozidă, pentru a examina efectele lor sinergice ale medicamentelor și efectul antiinflamator potențial folosind celulele BV2 tratate cu LPS. În special, efectuăm analize Western blot pentru expresia proteinei iNOS și COX-2 pentru a confirma sinergia și efectele antiinflamatorii ale combinațiilor de medicamente prezise.

După cum se arată în Fig. 5 (e–g), nivelurile de proteine ​​iNOS și COX-2 din panoul de linii celulare BV2 testate sunt raportate. Observăm că, fie în tratamentul cu izoacteozidă, fie cu 2′-acetilacteozidă, expresiile proteice ale iNOS și COX-2 în celulele BV2 au scăzut semnificativ la diferite niveluri de doză. Cu toate acestea, tratamentul cu combinația de izoacteozidă și 2′-acetilacteozidă induce o creștere semnificativă a factorilor inflamatori iNOS și COX-2 (Fig. 5(e)). Figura 5(f) ilustrează acest lucrutratament cu echinacozidă sau verbascozidă, ca agent unic, provoacă o scădere a expresiei iNOS și COX-2. Mai mult, așa cum era de așteptat, tratamentul cu echinacozidă în combinație cu verbascozidă la concentrația de 150 μM a dus la o scădere mai pronunțată a

nivelurile de exprimare a proteinelor (iNOS și COX-2), indicând efectele antiinflamatorii sinergice ale acestei combinații de medicamente. În mod similar, așa cum este indicat în Fig. 5(g), combinația de echinacozidă și 2′-acetilacteozidă prezintă un efect sinergic semnificativ asupra inhibării COX-2 la concentrația de 75 μM sau 300 μM. Cu toate acestea, pentru iNOS, la doza de 300 μM, combinația reprezintă o suprimare marcată a proteinei. În schimb, constatăm că nu există efecte evidente de inhibare atât asupra iNOS cât și asupra COX-2 cu privire la combinația de izoacteozidă și 2′-acetilacteozidă sau echinacozidă și verbascozidă la concentrația de 75μM (Figura suplimentară 2), în plus, tratament cu alte perechi arată un efect mult mai slab în comparație cu agenții individuali la doza de 150 sau 300μM care poate fi văzut în Fig. 5 (e–g).

În concluzie, studiul in vitro oferă informații suplimentare pentru screeningul combinațiilor de medicamente cu potențial efecte antiinflamatorii și demonstrează fiabilitatea strategiei de screening in silico.

TUBULOZA NATURALA DE CISTANCHE PENTRU TRATAMENTUL NEUROINFLAMATIEI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Discuţie

Neuroinflamația este implicată în majoritatea bolilor neurologice, psihiatrice și de neurodezvoltare, aceasta nu este doar o consecință, ci ar putea fi un declanșator al patologiei. Cu toate acestea, tratamentele actuale pentru neuroinflamatorii sunt în cea mai mare parte monoterapii, limitate de efectele secundare bine-cunoscute, după cum știm, inhibitorii de COX-2 pot duce la defecte cardiovasculare ca răspuns la tratamentul pe termen lung, iar tratamentul cu TNF-țintit ar putea provoca infecții prin imunosupresie. Abordările terapeutice combinatorii pot fi imperative pentru a îmbunătăți tratamentul bolilor complexe cu următoarele avantaje: robustețea rețelei contracarate și compensarea bypass-ului, eficacitatea clinică crescută, menținând în același timp toxicitatea umană minimă și doza redusă a fiecărui compus63. Cu toate acestea, explorarea combinațiilor sinergice de medicamente dintre compușii derivați din plante medicinale bazate pe farmacologia sistemului este restricționată de posibilul motiv principal pentru cantități mari de compuși.

În lucrare, obținem mai întâi 63 de potențiali compuși bioactivi dinplante medicinale Cistanche tubulosa, îndeplinind criteriile (DL Mai mare sau egal cu 0.18) pentru analize ulterioare cu ajutorul predicției, care este indispensabilă pentru a elimina moleculele mai promițătoare cu proprietăți dezirabile. După maparea celor 133 de ținte ale celor 63 de potențiali compuși bioactivi în baza de date, obținem 43 de ținte legate de neuroinflamație, iar apoi analiza grupării GOBP a țintelor prezise poate contribui probabil la tratamentul neuroinflamației. Rezultatul analitic al rețelei CT a afișat un grad mediu pe compus de 11,209 și, respectiv, 7,651 pe țintă, iar 38 dintre aceștia au ajustat mai mult de 7 ținte (mai mare decât gradul mediu). De exemplu, echinacozidul (mol41) prezis cu 7 ținte, verbascozidul (mol33), cu 9 ținte, sau tableside B (mol57), cu 8 ținte ar putea juca roluri cheie în neuroprotecție, în conformitate cu literatura în creștere.

Atingem ținte terapeutice directe, cum ar fi APP, MAPT (cunoscut și ca Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 și HTR2A (cunoscut și ca 5-HT2A), GRIN2B (subunitatea 2B de tip NMDA al receptorului ionotrop de glutamat) și GRIA1 (subunitatea 1 a receptorului ionotrop de glutamat AMPA) sau ținte potențiale în aval, cum ar fi PTGS274 sau NOS275, care sunt asociate cu neuroinflamație sau diferite boli ale sistemului nervos.

Analiza rețelei Compound-Target-Pathway afișează 12 compuși din primele 10 perechi de medicamente prin algoritmul PEA, conectați cu cele 43 de ținte potențiale și cu căile legate de neuroinflamație, de exemplu, calea de semnalizare a calciului, interacțiunea ligand neuroactiv-receptor sau calea de semnalizare a TNF și așa mai departe. În sistem, acești compuși preziși ar putea acționa nu numai asupra proteinelor din amonte, ci și asupra căilor din aval asociate cu neuroinflamația și biomarkerii inflamatori, în special. Mai mult, sunt furnizate informații suplimentare pentru screening-ul combinațiilor de medicamente cu potențial efecte antiinflamatorii, iar fiabilitatea strategiei de screening in silico este verificată prin validare experimentală. Calea neuroinflamației este compusă din calea bolii Alzheimer, calea de semnalizare a calciului, calea de semnalizare GnRH, calea de semnalizare VEGF și sinapsa serotoninergică. Rezultatele analitice ne-au explicat în mod distinct că moartea celulară, inflamația și modulele de neuroprotecție sunt exemplificate pentru a descifra mecanismulCistanche tubulosa pentru tratamentul neuroinflamației.

Neuroinflamația însoțește diferite boli neurodegenerative care ar putea fi nu doar o consecință, ci și un declanșator al patologiei, astfel că terapiile antiinflamatorii sunt sugerate a fi o abordare promițătoare de tratament. Spre dezamăgirea noastră, deși ne-am dat seama de limitările monoterapiilor, evaluarea și mecanismele de bază ale terapiilor combinate sunt încă provocările majore în dezvoltarea noii strategii alternative. Prin urmare, această muncă ar putea oferi noi oportunități terapeutice pentru neuroinflamație și ar putea deschide o nouă cale pentru descoperirea combinațiilor de medicamente din produse naturale.

Materiale și metode

Colecția de compuși

Un total de 66 de ingrediente chimice ale Cistanche tubulosa sunt colectate manual din TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, inclusiv 26 de glicozide feniletanoide, 22 de iridoide, 4 lignani, 7 glicozide monoterpenice, 2 substanțe azotate, 3 zaharuri benzen acriloil, 1 sterol, 1 ketol. Dat fiindglicozide în Cistanche tubulosasunt de obicei hidrolizate pentru a elibera aglicona care este apoi absorbită în mucoasa intestinală, prin urmare, luăm în considerare moleculele fără glicolic, care sunt etichetate ca _qt. Acest lucru a condus la generarea celor 103 compuși. Aceste molecule sunt furnizate în tabelul suplimentar S1.

Evaluarea asemănării drogurilor

Pentru a obține potențialii compuși bioactivi din Cistanche tubulosa, evaluăm asemănarea cu medicamentele acestor ingrediente prin calcularea similitudinii Tanimoto între compușii din plante și proprietățile moleculare medii ale tuturor substanțelor chimice din baza de date Drugbank. Și, modelul de predicție DL a fost aplicat cu succes în multe studii, pentru a selecta compuși bioactivi. În lucrare, indicele DL Mai mare sau egal cu 0, 18 al candidaților este definit ca valoare de prag pentru a se potrivi mai bine analizei ulterioare.

Predicția țintei medicamentelor

Identificarea țintelor de eficacitate pentru compușii lideri rămâne un pas cheie pentru progresul compușilor în dezvoltarea medicamentelor. Aici, două instrumente interne: SysDT și WES sunt efectuate pentru a obține informațiile țintei moleculare pentru pescuitul drogurilor. SysDT este un model in-solo care este realizat cu o combinație de informații chimice, genomice și farmacologice bazate pe două instrumente matematice puternice: Random Forest (RF) și Support Vector Machine (SVM) pentru a aborda problema identificării țintei în mod eficient. Modelul obținut a servit ca o platformă valoroasă pentru predicția interacțiunilor medicament-țintă cu o acuratețe generală de 97,3%, o precizie de predicție activată de 87,7% și o precizie de predicție inhibată de 99,8%. Pentru a capta componente mai promițătoare, criteriile de filtrare sunt definite ca valoare RF Mai mare sau egală cu 0,7 sau SVM Mai mare sau egală cu 0,8 în acest studiu.

Similitudinea ansamblului ponderat (WES) este un nou model de calcul puternic pentru a identifica țintele directe ale medicamentelor pentru ingredientele bioactive reale. Ca un instrument nou, modelul obținut funcționează bine în prezicerea legării cu o sensibilitate medie de 85% (SEN) și a modelelor de nelegare cu 71% (SPE) cu zonele medii sub curbele de funcționare a receptorului (ROC, AUC) de 85,2% și o concordanță medie de 77,5%. Țintele obținute sunt mapate în continuare la Uniprot pentru a-și normaliza ulterior numele și organismele. Aici, alegem doar țintele Homo sapiens pentru analize ulterioare. Țintele candidate ale compușilor selectați sunt mapate în baza de date CTD pentru a obține bolile lor asociate și în cele din urmă evaluăm potențialele ținte legate de neuroinflamație.

Îmbogățirea și analiza GO pentru ținte

Pentru a sonda procesele biologice implicate ale țintelor obținute, mapăm țintele la DAVID și termenii cu valoarea P mai mică de 0.05 sunt aleși în această secțiune.

Analiza combinațiilor de medicamente

În munca noastră anterioară, a fost exploatat un cadru de farmacologie de sistem pentru a prezice combinațiile de medicamente pe un model nou proiectat, denumit Abordarea ansamblului de probabilități (PEA) pentru a analiza eficacitatea clinică și efectele adverse ale combinațiilor de medicamente. În detaliu, a fost dezvoltată o rețea bayesiană care se integrează cu un algoritm de similaritate pentru a modela combinațiile din efectele moleculare și farmacologice ale compusului. Apoi a fost prezentată evaluarea combinată care a acoperit eficacitatea clinică și efectele adverse pentru perechile prezise. Pe scurt, arată că PEA ar putea prezice eficacitatea perechilor cu specificitate și sensibilitate ridicată (AUC{0}}.90) în munca noastră. În această lucrare, selectăm primele zece combinații de medicamente pe baza probabilităților lor de sinergie, care reprezintă posibilitatea de a induce sinergie între doi compuși.

Construirea și analiza rețelei/căilor

Pentru a investiga relațiile dintre ingredientele active și bolile inflamatorii, rețeaua compus-țintă (CT) și rețeaua compus-țintă-căi (CTP) sunt generate de Cytoscape 2.8.1, un pachet bioinformatic popular pentru vizualizarea rețelelor biologice și integrarea datelor. Proprietățile cantitative ale rețelei sunt analizate de următoarele două pluginuri Network Analyzer și CentiScaPe 1.2. În rețeaua grafică, nodurile indică fie compuși, ținte sau căi, în timp ce marginile codifică interacțiunea medicament-țintă. Pentru a explora în continuare efectele biologice ale modului în care funcționează țintele celulare prin modularea căilor multiple de metabolism, o „cale” încorporată este asamblată de informațiile actualizate despre patologia neuroinflamației. În primul rând, folosind maparea lor în baza de date KEGG, profilurile țintă atinse sunt agregate în mai multe căi. După abandonarea secțiunilor indirecte, apoi, o cale relativ sintetizată este integrată manual pe baza datelor patologice și clinice.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU TRATAREA BOLII PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Validare experimentală

Pregătirea probelor

Echinacozidă, verbascozidă, izoacteozidă și 2′-acetillacteozidăsunt achiziționate de la Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, China). Probele de testat sunt dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO) (Sigma, SUA) pentru a obține 100 mM, ca soluție stoc, și apoi depozitate la 4 grade . Diluțiile finale de DMSO adăugate la mediul de cultură nu au depășit niciodată 0,1%, ceea ce a asigurat că nu există niciun efect asupra viabilității celulare.

Cultură de celule

Celulele microglia de șoarece BV2 sunt dezvoltate inițial de banca de celule din Shanghai Academia Chineză de Științe și cultivate în sarcini de 25 sau 75 cm2 cu mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) (Gibco BRL, SUA), penicilină G (100 unități/mL) și streptomicina (100 mg/mL) într-un incubator umidificat cu 5% CO2/95% O2 la 37 de grade.

Test de viabilitate celulară

Celulele microglia BV2 sunt însămânțate într-o placă de 96-godeuri la o densitate de 1×105 celule/ml, după incubare timp de 18 ore, celulele sunt tratate cu 100 ul de mediu proaspăt cu sau fără diferite concentrații indicate de probe de testare pentru încă 24 de ore. Testul CCK-8 (BestBio, Shanghai, China) este o metodă convenabilă și fiabilă pentru a determina viabilitatea celulelor. Pentru a elimina fundalul probelor de testat, aruncăm întregul mediu de cultură, după care se adaugă apoi 100 ul/godeu mediu proaspăt care conține 10% soluție CCK-8. Valorile DO la 450 nm sunt citite pe un cititor de microplăci (Molecular Devices, California, SUA) după o incubare de 3 ore la 37 de grade și 5% CO2.

Analiza Western Blot

Proteina celulară este extrasă din liniile celulare folosind un kit de pregătire pentru proteine ​​de mamifere Qproteome™ (Qiagen, Germania) după procedurile indicate de protocolul producătorului. Kitul Quick Stari Bradford Protein Assay (Bio-Rad, SUA) este aplicat la cuantificarea proteinelor. Cantități echivalente de proteine ​​(50ug) sunt denaturate prin fierbere la 100 de grade timp de 10 minute cu 2*laemmli tampon de încărcare a probei (Bio-Rad, SUA) plus 5% -mercaptoetanol într-un raport de 1:1 și încărcat pe bandă pe 12% SDS-PAGE (minigeluri de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu), electrotransferat pe membrane de poliviniliden fuoride de 0,45 μm (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, SUA) timp de 150 min la 200 mA. Ulterior, membranele sunt blocate în 3% albumină serică bovină (BSA) la temperatura camerei și incubate cu anticorpii primari iNOS și COX-2 (Abcam) la 4 grade peste noapte. După trei spălări amănunțite în Saline-Tween tamponat cu Tris (TBST) fiecare timp de 5 minute, membranele sunt testate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (HRP) (diluții 1:10000; Abcam) timp de 1,5 ore la temperatura camerei. Benzile imunoreactive sunt apoi vizualizate folosind un kit de detectare a chimioluminiscenței ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, SUA) după spălare de două ori în TBST și o dată în TBS, de fiecare dată timp de 5 minute. Valorile densitometrice sunt normalizate folosind -actina ca control intern al încărcării.

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard, iar analiza Western blot se repetă în trei experimente independente cu același rezultat. Analiza unidirecțională a varianței este utilizată pentru a compara diferențele de medii pentru trei sau mai multe grupuri, semnificația statistică este analizată cu testul t Student între două grupuri.

TUBULOSĂ NATURALĂ DE CISTANCHE PENTRU TRATAMENTUL BOLII PARKINSON ȘI AL BOLII ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%