Evaluarea in vitro a fotoreactivității și fototoxicității antioxidanților naturali polifenoli

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru a afla mai multe.

Abstract:Polifenolii sunt o familie mare de compuși naturali utilizați pe scară largă în produsele cosmetice datorită proprietăților lor benefice antioxidante și antiinflamatorii și capacității lor de a preveni stresul oxidativ indus de radiațiile UV. Deoarece acești compuși prezintă cromofori și sunt aplicați direct pe piele, ei pot reacționa cu lumina soarelui și pot exercita efecte fototoxice. Informațiile științifice disponibile cu privire la potențialul fototoxic al acestor compuși naturali sunt limitate și, prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a evalua fotoreactivitatea și fototoxicitatea a cinci substanțe fenolice.antioxidanticu utilizare documentată în produsele cosmetice. Un test ROS standard a fost validat și aplicat pentru a verifica fotoreactivitatea antioxidanților fenolici naturali acid cafeic, acid ferulic, acid p-cumaric, 3,4-acid dihidroxifenilacetic (DOPAC) și rutina. Potențialul de fototoxicitate a fost determinat prin utilizarea unei linii celulare de keratinocite umane (HaCaT), pe baza testului de fototoxicitate 3T3 Neutral Red Uptake. Deși toatea studiat antioxidanții fenolicia absorbit radiația UV/Vis în intervalul de la 290 la 700 nm, doar DOPAC a fost capabil să genereze oxigen singlet. Generarea de specii reactive de oxigen este o reacție chimică în stadiu incipient ca parte a mecanismului de fototoxicitate. Cu toate acestea, niciunul dintre compușii studiați nu a scăzut viabilitatea keratinocitelor după iradiere, conducând la concluzia că nu au potențial fototoxic. Datele obținute cu această lucrare sugerează că acești compuși sunt siguri atunci când sunt încorporați în produsele cosmetice.

Cuvinte cheie:siguranța foto; fotoreactivitate; fototoxicitate; polifenoli;antioxidanti fenolici naturali; specii reactive de oxigen; keratinocite; îngrijire a pielii; produse cosmetice

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Introducere 

Polifenolii (PP) constituie una dintre cele mai numeroase și larg răspândite grupuri de produse naturale din regnul vegetal. Structura chimică a PP-urilor este caracterizată prin prezența uneia sau mai multor grupări hidroxil fenolice, legate la unul sau mai multe sisteme inelare benzenice [1]. Polifenolii prezintă o varietate de activități biologice benefice la om, inclusiv acțiune antivirală, antibacteriană, anticancerigenă, hepatoprotectoare, antiinflamatoare și antioxidantă [2-5].Ca antioxidanti, polifenolii pot proteja constituenții celulari împotriva efectelor dăunătoare oxidative ale speciilor reactive de oxigen (ROS), cum ar fi oxigenul singlet, superoxidul și radicalii hidroxil, limitând riscul mai multor boli asociate cu stresul oxidativ [6,7]. Datorită proprietăților lor chimice, PP-urile sunt capabile să capteze ROS și să chelate ionii metalelor tranziționale, cum ar fi fierul și cuprul, ceea ce a atras interesul industriei cosmetice pentru utilizarea lor în formulările de îngrijire a pielii [8-10]. Expunerea la ultraviolete (UV) este unul dintre principalii factori care induc cancerul de piele, iar celulele cutanate pot fi deteriorate direct de radiațiile UV sau indirect de supraproducția de ROS mediată de UV [11]. Studiile experimentale și epidemiologice au sugerat că polifenolii protejează pielea de efectele adverse ale radiațiilor UV prin mai multe căi [12]. Prin urmare, mai mulți compuși aparținând acestei familii sunt deja utilizați ca ingrediente într-o serie de produse cosmetice comerciale disponibile pe piață [13]. Cererile crescute ale consumatorilor pentru cosmetice naturale au îndemnat industria să dezvolte formulări folosind extracte naturale cu ingrediente active, cum ar fi polifenolii, ca soluție promițătoare și eficientă pentru îngrijirea pielii [13]. Cu toate acestea, cromoforii prezenți în structura polifenolilor au capacitatea de a absorbi radiația UV/Vis și de a suferi reacții chimice care duc la o cascadă de evenimente care pot duce la reacții fototoxice [14]. Fototoxicitatea este definită ca un răspuns toxic provocat de substanțele chimice fotoreactive administrate local sau sistemic după expunerea organismului la lumina mediului [15]. Ingredientele farmaceutice active și excipienții pentru administrare sistemică, formulările clinice pentru aplicare topică, plasturii dermici și altele, au potențial fototoxic și pot provoca reacții fototoxice notabile. În consecință, agențiile de reglementare, US FDA, UE EMA și ICH, oferă ghiduri de siguranță foto, introducând metode de testare și strategii de evaluare [15–17]. Evaluarea siguranței produselor cosmetice este obligatorie conform legislației Uniunii Europene [18]. Evaluarea de siguranță necesară include studii toxicologice relevante asupra ingredientelor cosmetice, inclusiv o evaluare a toxicității foto-induse [18]. Deoarece testarea pe animale a fost interzisă pentru produsele cosmetice, în ultimii ani au fost propuse o serie de teste foto de siguranță in vitro, inclusiv analiza spectrului UV, un test de fototoxicitate 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU PT) și o specie reactivă de oxigen ( ROS) [18–20]. Testul ROS a fost conceput pentru evaluarea fotoreactivității medicamentelor, al cărui principiu este monitorizarea reacțiilor fotochimice în substanțele chimice de testat expuse la lumina solară simulată [19,20]. Prin aceste reacții fotochimice pot fi generate ROS, cum ar fi anionul superoxid și oxigenul singlet, iar aceste procese fotochimice pot fi un declanșator pentru fototoxicitatea indusă de medicamente [19,20]. Nivelurile ridicate de ROS pot provoca citotoxicitate prin deteriorarea ADN-ului, lipidelor și proteinelor prin stresul oxidativ.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlMetodologia in vitro 3T3 NRU-PT utilizează linia celulară de fibroblaste de șoarece Balb/c 3T3 și captarea roșu neutru ca punct final al citotoxicității. Fototoxicitatea este apoi determinată de reducerea relativă a viabilității celulelor expuse la substanța chimică testată în prezența și absența luminii care simulează lumina soarelui. Studiile raportate în literatură au concluzionat că acest test este suprasensibil, prezicând în mod eronat riscurile pentru siguranța foto animalelor și umane, conducând la un număr mare de fals pozitive în comparație cu rezultatele in vivo [21-23]. Având în vedere această limitare, grupul nostru a propus o modificare a metodologiei 3T3 NRU-PT pe baza utilizării unei linii celulare de keratinocite umane (HaCaT) [24]. Întrucât această metodologie utilizează celule de keratinocite umane, reprezintă un model mai realist, având în vedere că acestea sunt cel mai abundent tip de celule prezente în stratul extern al pielii, unde compușii topici sunt aplicați și expuși la radiațiile solare [24]. Scopul acestui studiu a fost de a estima potențialul de toxicitate foto-indusă al polifenolilor naturali acid p-cumaric, acid cafeic, acid 3,4-dihidroxifenilacetic (DOPAC), acid ferulic și rutina (Figura 1), care sunt deja folosite ca ingrediente cosmetice sau sunt luate în considerare datorită proprietăților lor chimice și antioxidante interesante [25–27]. Un test ROS a fost validat și implementat pentru evaluarea exploratorie a siguranței foto a compușilor, iar citotoxicitatea și fototoxicitatea acestora au fost evaluate în continuare folosind o linie celulară de keratinocite umane (HaCaT).

2. Rezultate și discuții 

Considerentul inițial pentru evaluarea potențialului fotoreactiv este dacă un compus absoarbe fotoni la orice lungime de undă între 290 și 700 nm. Un compus care are un coeficient de extincție molar (MEC) mai mare de 1000 L mol-1 cm-1 la orice lungime de undă între 290 și 700 nm este considerat a fi suficient de fotoreactiv pentru a duce la fototoxicitate directă [15]. Spectrele de absorbție ale acizilor cafeic, p-cumaric și ferulic, DOPAC și rutina în DMSO la lumină UV vizibilă sunt prezentate în Figura 2. Toți compușii absorb în intervalul spectral de la 200 la 700 nm, cu lungimea de undă maximă la sau peste 290 nm și cu MEC de obicei mai mare de 4000 L mol−1 cm−1 (Tabelul 1). Polifenolii sunt compuși biologici care conțin sisteme π conjugate cu grupări hidroxil fenolice. Tranzițiile electronice ale orbitalilor moleculari de tip π sunt responsabile pentru spectrul UV-vizibil al acestui grup de compuși [28]

Toți compușii testați au prezentat MEC mai mare de 1000 L mol−1 cm−1, ceea ce înseamnă că toți sunt posibili compuși fototoxici care merită studiați [15]. Înainte de efectuarea testului ROS, simulatorul solar a fost evaluat, iar condițiile experimentale au fost optimizate pentru a se asigura că valorile măsurate ale oxigenului singlet (SO) și anionului superoxid (SA) sunt apropiate de cele menționate în literatură [29]. Optimizarea testului de generare a ROS a fost efectuată utilizând controale pozitive și negative și a fost realizat un studiu de fezabilitate folosind substanțe chimice de referință. În condițiile experimentale utilizate, toate substanțele testate în studiul de fezabilitate au îndeplinit criteriile de acceptare dând valori pentru SO și SA în intervalele de valori admisibile [29].

Testul ROS a fost efectuat pentru compușii polifenolici, iar capacitatea substanțelor testate de a genera ROS, la concentrația de 200 uM, este prezentată în Tabelul 2. Tabelul 2. Rezultatele au fost obținute pentru compușii testați folosind testul ROS.

Rezultatele obținute arată că, cu excepția DOPAC, toți compușii, pot fi clasificați ca non-fotoreactivi. Deși aceste substanțe au prezentat o absorbție a luminii UV-vizibile și MEC mai mare de 1000 L mol−1 cm−1, ele nu au generat ROS în condițiile testate, fie specii SO sau SA. În mod surprinzător, DOPAC a fost capabil să inducă generarea de specii SO și, prin urmare, a fost clasificat ca fotoreactiv, în ciuda faptului că acest compus are cea mai scăzută valoare MEC în intervalul UV-vizibil dintre toți compușii studiați. Sunt necesare mai multe studii pentru a înțelege rezultatele obținute pentru DOPAC, care ar putea fi, de asemenea, important, în viitorul apropiat, pentru a stabili o corelație între structura chimică a unui compus și capacitatea acestuia de a fi fotoreactiv. A fost evaluată citotoxicitatea DMSO utilizat pentru evaluarea efectelor fototoxice, în prezența și absența iradierii, după 1 oră de expunere. Pentru placa neiradiată, DMSO nu a arătat o diferență semnificativă statistic în raport cu martorii negativi. Cu toate acestea, pentru placa iradiată, a existat o diferență semnificativă între 1% DMSO și controlul cu solvent față de controalele negative (p < 0,0001),="" ceea="" ce="" a="" justificat="" utilizarea="" controlului="" cu="" solvent="" în="" toate="" experimentele="" pentru="" a="" garanta="" că="" diferențele="" de="" viabilitate="" celulară.="" au="" fost="" atribuite="" doar="" compușilor="" aflați="" în="" studiu.="" pentru="" a="" asigura="" fezabilitatea="" testului="" de="" fototoxicitate="" folosind="" o="" linie="" celulară="" de="" keratinocite="" umane="" (hacat),="" 5-metoxi="" psoralen,="" clorpromazină="" clorhidrat="" și="" chinină="" au="" fost="" testate="" ca="" martori="" pozitivi="" și="" acid="" acetilsalicilic,="" hexaclorofen="" și="" laurii="" sulfat="" de="" sodiu="" ca="" martori="" negativi="" [24].="" rezultatele="" obținute="" în="" urma="" testului="" de="" fototoxicitate="" care="" compară="" viabilitatea="" celulară="" a="" celulelor="" hacat,="" iradiate="" și="" neiradiate,="" în="" prezența="" compușilor="" (poli)fenolici="" testați="" sunt="" prezentate="" în="" figura="" 3.="" intervalele="" de="" concentrații="" ale="" substanțelor="" chimice="" testate="" în="" prezență="" (irr="" plus="" )="" și="" absența="" (irr-)="" luminii="" au="" fost="" determinate="" în="" experimente="" de="" determinare="" a="" intervalului="" de="" doză,="" luând="" în="" considerare="" concentrația="" maximă="" de="" 1000="" µm.="" a="" fost="" utilizată="" o="" serie="" de="" diluții="" geometrice="" și="" ajustată,="" atunci="" când="" a="" fost="" necesar,="" în="" funcție="" de="" concentrație-răspuns="" în="" prezența="" și="" absența="" iradierii.="" în="" intervalul="" de="" concentrație="" testat="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" și="" 1000="" µm)="" niciuna="" dintre="" substanțele="" de="" testat="" nu="" a="" indus="" o="" scădere="" cu="" 50%="" a="" viabilității="" celulare,="" prin="" urmare,="" nu="" a="" fost="" posibil="" să="" se="" calculeze="" valorile="" ic50="" și="" pif="" corespunzătoare.="" .="" dimpotrivă,="" s-a="" putut="" percepe="" o="" creștere="" dependentă="" de="" doză="" a="" viabilității="" celulelor="" iradiate="" în="" prezența="" substanțelor="" testate,="" posibil="" datorită="" efectelor="" fotoprotectoare="" ale="" acestor="" antioxidanți="" față="" de="" daunele="" oxidative="" induse="" de="" radiații="" conducând="" la="" un="" procent="" mai="" mare.="" de="" celule="" viabile="" în="" comparație="" cu="" martor="" (celule="" iradiate="" netratate).="" este="" descris="" în="" literatură="" că="" radiațiile="" uv="" conduc="" la="" generarea="" de="" ros,="" o="" supraproducție="" de="" oxid="" nitric="" și="" epuizarea="" apărării="" antioxidante="" în="" keratinocite="" [30].="" din="" aceste="" motive,="" polifenolii="" cu="" capacitate="" antioxidantă="" au="" fost="" studiați="" ca="" agenți="" fotoprotectori.="" deși="" majoritatea="" studiilor="" s-au="" concentrat="" asupra="" capacității="" fotoprotectoare="" a="" polifenolilor,="" aceștia="" nu="" au="" studiat="" potențialul="" fototoxic="" al="" acestora.="" studiile="" anterioare="" au="" confirmat="" capacitatea="" acizilor="" cafeic,="" ferulic="" și="" p-cumaric="" de="" a="" elimina="" ros="" și="" speciile="" reactive="" de="" azot="" (rns).="" mai="" mult,="" protecția="" împotriva="" efectelor="" dăunătoare="" ale="" radiațiilor="" uv="" a="" fost="" stabilită="" și="" in="" vivo="" sau="" celulele="" pielii="" pentru="" acești="" trei="" compuși="" fenolici="" [31–34].="" aceste="" date="" pot="" explica="" creșterea="" procentului="" de="" celule="" viabile="" atunci="" când="" sunt="" expuse="" la="" iradiere="" în="" prezența="" compușilor="" aflați="" în="" studiu.="" rutina,="" precum="" acizii="" cafeic,="" ferulic="" și="" p-cumaric="" au="" fost="" testate="" negative="" în="" testul="" de="" generare="" a="" ros="" și="" nu="" au="" indus="" fototoxicitate="" în="" linia="" celulară="" hacat.="" există="" unele="" informații="" contradictorii="" în="" literatura="" de="" specialitate="" cu="" privire="" la="" potențialul="" fototoxic="" al="" rutinei,="" de="" unde="" și="" interesul="" rezultatelor="" obținute.="" evaluarea="" potențialului="" fototoxic="" folosind="" un="" sistem="" celular="" de="" keratinocite="" (hacat),="" a="" arătat="" că="" rutina="" a="" demonstrat="" fototoxicitate="" [35].="" dimpotrivă,="" utilizând="" o="" configurație="" experimentală="" care="" utilizează="" electroforeza="" capilară="" cu="" detecție="" electrochimică="" și="" uv="" pentru="" a="" testa="" fototoxicitatea="" extractelor="" și="" componentelor="" plantelor="" în="" ceea="" ce="" privește="" consumul="" de="" oxigen="" și="" generarea="" de="" specii="" reactive="" de="" oxigen="" la="" iradierea="" cu="" lumină="" vizibilă,="" a="" fost="" posibil="" să="" se="" concluzioneze="" că="" rutina="" a="" fost="" nu="" fototoxic="" [36],="" ceea="" ce="" a="" fost="" în="" acord="" cu="" rezultatele="" obținute="" în="" această="" lucrare="" în="" care="" rutina="" nu="" a="" prezentat="" fotoreactivitate="" deoarece="" nu="" a="" generat="" nici="" so="" sau="" sa="" în="" testul="" de="" generare="" a="" ros.="" pe="" de="" altă="" parte,="" în="" această="" lucrare,="" sa="" arătat,="" de="" asemenea,="" că="" rutina="" în="" sine="" nu="" prezintă="" niciun="" potențial="" fototoxic="" în="" linia="" celulară="" hacat.="" aceste="" constatări="" contradictorii="" evidențiază="" importanța="" utilizării="" condițiilor="" de="" testare="" standardizate="" și,="" de="" asemenea,="" utilizarea="" unei="" surse="" de="" lumină="" adecvate="" pentru="" a="" evita="" rezultatele="" înșelătoare.="" interesant,="" și="" în="" ciuda="" similitudinii="" structurale="" dintre="" dopac="" și="" celelalte="" pp="" studiate,="" dopac="" a="" generat="" so="" în="" testul="" de="" generare="" a="" ros="" și="" a="" fost="" clasificat="" ca="" fotoreactiv.="" cu="" toate="" acestea,="" atunci="" când="" a="" fost="" testat="" în="" linia="" celulară="" hacat,="" dopac="" s-a="" dovedit="" a="" fi="" non-fototoxic.="" din="" rezultatele="" obținute,="" dopac="" pare="" a="" fi="" fotoreactiv,="" dar="" nu="" fototoxic,="" deci="" nu="" este="" de="" așteptat="" ca="" după="" aplicarea="" topică="" a="" acestui="" compus="" să="" apară="" reacții="">

3. Materiale și Metode

3.1. Reactivi

3,4-Acid dihidroxifenilacetic (DOPAC), acid cafeic, acid trans-ferulic, acid p-cumaric, rutina, clorhidrat de clorpromazină, fosfat acid disodic dodecahidrat, fosfat de sodiu monobazic monohidrat, roșu neutru (NR) și dimetil sulfoxid (DMSO) au fost achiziționate de la Sigma–Aldrich (Madrid, Spania). Clorhidrat de chinină, benzocaină, diclofenac și eritromicină au fost achiziționate de la Acofarma (Madrid, Spania). Linia celulară de keratinocite umane imortalizate (HaCaT) a fost obținută de la Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Germania). Mediu Eagle modificat Dulbecco (DMEM) cu 4,5 g/L D-glucoză, L-glutamină, 25 mM HEPES și DMEM cu 4,5 g/L D-glucoză, L glutamină, 25 mM HEPES fără roșu fenol, soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco (DPBS), ser fetal bovin (FBS) și tripsină EDTA au fost achiziționate de la Gibco Life Technologies (Waltham, MA, SUA). Etanolul a fost furnizat de Aga (Lisabona, Portugalia). N, N-Dimetil-4-nitroguanidină (RNO), imidazol și Nitro Blue Tetrazolium (NBT) au fost achiziționate de la Alfa Aesar (Kandel, Germania).

3.2. Absorbție spectrală 

Spectrul de absorbție al fiecărui compus studiat a fost determinat în intervalul de la 290 la 700 nm, conform Ghidului de testare 101 al OECD, utilizând un spectrofotometru UV/VIS Jasco V650 [37]. Substanțele au fost dizolvate în DMSO pentru a obține o concentrație finală de 10 µg/mL și spectrele de absorbție au fost măsurate folosind cuve de cuarț transparent UV (lungimea traseului=10 mm). Fiecare spectru a fost corectat pentru absorbția de bază specifică solventului. Coeficienții molar de extincție (MEC) au fost calculați folosind cele mai mari vârfuri de absorbție de la 290 la 700 nm [15].

3.3. Testul speciilor reactive de oxigen (ROS). 

Sa stabilit protocolul de testare ROS, iar studiile de validare au fost efectuate conform procedurii descrise în literatură [19,29]. Soluțiile stoc din toate substanțele testate au fost preparate la o concentrație de 10 mM în DMSO și utilizate în aceeași zi, ferite de lumină. Pe scurt, generarea de oxigen singlet (SO) a fost detectată prin măsurarea spectrofotometrică a albirii p-nitrosodimetilanilinei (RNO) la 440 nm folosind imidazolul ca acceptor selectiv al oxigenului singlet. Probele, care conțin substanța chimică testată (200 uM), RNO (50 uM) și imidazol (50 uM) în tampon de fosfat de sodiu 20 mM (PB, pH 7,4), au fost plasate într-un tub și amestecate cu un mixer vortex și sonicate, ferit de lumină, timp de 10 min. Amestecul a fost transferat într-o celulă de înaltă performanță din sticlă de cuarț Hellma și verificat pentru precipitare la microscop înainte de expunerea la lumină. Apoi, probele au fost iradiate folosind un simulator solar termostatic Fitoclima S600PL (Aralab, Portugalia), echipat cu opt lămpi UV-Vis Repti Glo (20 W), timp de 90 min la 25 ◦C. După iradiere, absorbanța a fost citită din nou la 440 nm. Generarea de anioni superoxid (SA) a fost detectată prin observarea reducerii tetrazoliului nitroblue (NBT) la monoformazan (NBT plus), a cărui formare poate fi monitorizată spectrofotometric la 560 nm. Au fost iradiate probe care conţin compuşii testaţi (200 pM) şi NBT (50 pM) în NaPB 20 mM, iar reducerea NBT a fost măsurată prin creşterea absorbanţei la 560 nm în acelaşi mod ca pentru determinarea SO. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare. Deoarece simulatorul solar utilizat a fost diferit de modelele recomandate, a fost necesară validarea condițiilor de iradiere. A fost efectuat un test ROS pentru a se asigura că condițiile de iradiere au îndeplinit criteriile recomandate folosind martori pozitivi (chinină) și negativi (sulisobenzonă) și compuși chimici de referință [29]. Conform rezultatului (media determinărilor triplicate) din testul ROS, compușii polifenolici testați au fost clasificați ca substanțe fotoreactive atunci când s-a măsurat o valoare SO de 25 sau mai mult și/sau o valoare SA de 20 sau mai mult; la rândul său, a fost determinată ca substanță nefotoreactivă atunci când s-au înregistrat valori mai mici de 25 pentru SO și mai mici de 20 pentru SA [29].

3.4. Cultură de celule 

Celulele HaCaT au fost menținute la 37 ◦C într-o atmosferă umidificată de 95% aer și 5% CO2 în incubatorul în DMEM cu 10% FBS și 1% antibiotice. Folosind un microscop inversat, s-a observat confluența celulelor și, dacă celulele au ajuns la 70-80% confluență, s-a făcut subcultura pentru a preveni moartea celulelor. În acest scop, mediul de cultură a fost aspirat, iar celulele au fost spălate cu DPBS, s-au adăugat 2 mL de tripsină 0,25% și s-au incubat timp de 7 până la 8 minute la 37 °C într-o atmosferă de 5% CO2. După detașarea celulelor, a fost adăugat un mediu proaspăt pentru a bloca acțiunea tripsinei. Pentru numărarea celulelor, o suspensie celulară de 10 ui a fost plasată într-o cameră Neubauer unde au fost numărate celulele. Suspensia celulară obţinută a fost apoi subdivizată în baloane noi cu un mediu de cultură celulară proaspăt. Pentru congelarea celulelor, DMSO (5 procente v/v) a fost utilizat ca crio-conservant pentru a preveni formarea de cristale în timpul fazei de depozitare. Pentru a determina timpul necesar pentru duplicarea celulelor, 1 × 106 celule au fost însămânțate în cinci baloane de 75 cm2 și incubate timp de 24 de ore la 37 ◦ C într-o atmosferă de 5% CO2 pentru a ajunge la aderența completă. Apoi, celulele fiecărui balon au fost numărate la momente diferite. Rezultatele au fost reprezentate într-un grafic reprezentând numărul de celule în funcție de timp, din care timpul de dublare a fost calculat utilizând analiza de regresie liniară. Timpul de dublare calculat obținut a fost de 20,43 h, ceea ce este în concordanță cu valorile raportate în literatură, confirmând astfel că celulele utilizate au fost în condiții normale de creștere [38]. 3.5. Test de fototoxicitate Pentru studiul fototoxicității a fost urmat un protocol anterior implementat în laboratorul nostru [24]. Înălțimea lămpii Osram UVA/UVB (240V E27) a fost ajustată pentru a iradia celulele cu o doză de iradiere UVA de 1,7 mW/cm2 (radiometru Cosmedico, UVM-7), conform ghidului OECD [23] . În timpul iradierii (10 min), plăcile au fost păstrate într-un recipient de polistiren care conține un sistem de răcire cu apă, iar temperatura a fost monitorizată pe tot parcursul procedurii. Pe scurt, pentru a efectua testul de absorbție NR, celulele HaCaT au fost însămânțate (2 × 104 celule/godeu) și incubate la 37 ◦ C într-o atmosferă de 5% CO2 timp de 24 de ore. După aceea, mediul a fost îndepărtat, au fost adăugate concentrații diferite ale substanțelor de testat și celulele au fost incubate în aceleași condiții timp de 1 oră. O placă a fost ținută la întuneric, în timp ce cealaltă placă a fost iradiată timp de 10 minute, cu temperatura menținută la 29-32 ◦C. Ulterior, mediul celular a fost înlocuit cu DMEM proaspăt fără roșu de fenol și incubat timp de 18-22 ore. După această perioadă de incubare, celulele din ambele plăci au fost spălate cu DPBS și s-a adăugat DMEM complet care conține 50 ug/mL NR în fiecare godeu și s-a incubat timp de 3 ore. După incubare cu NR, soluția NR a fost îndepărtată și s-a adăugat o soluție de desorbție NR (50% etanol:1% acid acetic:49% apă distilată) pentru a extrage colorantul NR din celule. Pentru procedura de citire, absorbanța a fost măsurată la 540 nm. În cadrul fiecărei plăci, au fost testate controale DMSO. Datele de viabilitate celulară obținute de pe fiecare placă au fost exprimate ca raport de absorbție a celulelor tratate față de celulele de control al solventului și au fost utilizate în continuare pentru a estima valorile IC50 utilizând analiza de regresie liniară. Valoarea factorului de foto-iritare (PIF) pentru fiecare substanță de testat a fost calculată ca raport între valoarea IC50 a iradiatelor (Irr plus) față de valoarea IC50 a celulelor neiradiate (Irr-). Conform ghidului OCDE, un indice PIF mai mic de 2 prezice absența unui efect fototoxic, un indice PIF între 2 și 5 prezice un efect fototoxic probabil, iar un PIF mai mare de 5 prezice un efect fototoxic [23]. Compușii testați au fost evaluați într-un interval de concentrații: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 și 1000 pM. 3.6. Analiză statistică Toate datele sunt prezentate ca medie ± abatere standard (SD) de la cel puțin trei experimente independente efectuate în trei exemplare. Pentru a confirma normalitatea și omogenitatea varianței, a fost utilizat testul de normalitate omnibus D'Agostino-Pearson și, ulterior, analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul post-hoc al lui Dunnett (comparație cu celulele martor negative cu solvent), a fost efectuat. Graficele au fost generate cu software-ul GraphPadPrism pentru Windows (versiunea 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, SUA).

4. Concluzii

În acest studiu, un test de specii reactive de oxigen (ROS) și un test de fototoxicitate 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU-PT) au fost utilizate pentru a examina comportamentul antioxidanților fenolici naturali atunci când sunt expuși la radiații care imită lumina soarelui, pentru a examina fotoreactivitatea și fototoxicitatea acestora. potenţial. Rezultatele obținute au permis concluzia că, deși rutina și acizii cafeic, p cumaric și ferulic absorb radiațiile UV-vizibile și prezintă MEC mai mare de 1000 L mol−1cm−1, ei sunt clasificați ca non-fotoreactivi. Mai mult, acești compuși nu au indus fototoxicitate atunci când au fost testați folosind linia celulară HaCaT. Datele găsite sugerează căaceşti antioxidanţiîn sine nu se așteaptă să provoace fototoxicitate și, prin urmare, pot fi considerate sigure pentru utilizare în formulările cosmetice. Pe de altă parte, s-a putut observa o creștere a viabilității celulei expuse la radiații atunci când în prezența acestor antioxidanți relevând un posibil efect fotoprotector care ar putea fi interesant de studiat pentru a susține utilizarea lor ca posibili agenți fotoprotectori în formulările cosmetice. În cazul DOPAC, acest compus s-a dovedit a fi fotoreactiv, deși nu a fost observată nicio fototoxicitate în testul de absorbție a roșului neutru 3T3. Cu toate acestea, ar trebui efectuate mai multe studii pentru a înțelege mecanismele din spatele fotoreactivității DOPAC, pentru a asigura siguranța foto a acesteia și, de asemenea, pentru a înțelege rolul și relația dintre structura chimică și potențialul unui compus de a fi fotoreactiv. Contribuții autor: Analiză formală, BA; Scriere—Pregătirea proiectului original, BA; Conceptualizare IFA, HC și JG: Resurse, IFA, HC, JMSL și JG; Scriere—Revizuire și editare, IFA, HC, JMSL și JG; Supraveghere, IFA, HC și JG; Achiziție de finanțare, IFA, HC, JMSL și JG Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului. Finanțare: Această cercetare nu a primit finanțare externă. Declarația Comitetului de evaluare instituțională: Nu este cazul. Declarație de disponibilitate: Toate datele prezentate în acest studiu sunt conținute în articol. Mulțumiri: Această lucrare este finanțată din fonduri naționale de la FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, în domeniul de aplicare al proiectului UIDP/04378/2020, UIDB /04378/2020 al Unității de Cercetare pentru Bioștiințe Moleculare Aplicate-UCIBIO și proiectul LA/P/0140/2020 al Institutului Asociat de Sănătate și Bioeconomie-i4HB și UIDB/00081/2020, finanțat de FCT/MCTES (PIDDAC). Conflicte de interese: Autorii nu declară niciun conflict de interese. Disponibilitatea eșantionului: Nu se aplică.

Referințe

1. Zillich, OV; Schweigert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polifenoli ca ingrediente active pentru produsele cosmetice. Int. J. Cosmet. Sci. 2015, 37, 455–464. [CrossRef]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Natasa, S.; Artur, B.; Giuseppe, G. Efectele benefice ale polifenolilor asupra bolilor cronice și îmbătrânirii. În polifenoli: proprietăți, recuperare și aplicații; Galanakis, CM, Ed.; Editura Woodhead: Kidlington, Marea Britanie, 2018; pp. 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. Rolul polifenolilor în sănătatea umană și sistemele alimentare: O mini-review. Față. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA Efectele polifenolilor și altor bioactivi asupra sănătății umane. Funcție alimentară. 2019, 10, 514–528. [CrossRef]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polifenoli: De la teorie la practică. Alimente 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MEA; Nikolenko, VN; Bulygin, KV; Mihaileva, LM; et al. Mutații mitocondriale și mitoepogenetică: Concentrați-vă pe reglarea răspunsurilor induse de stresul oxidativ în cancerele de sân. Semin. Cancer Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Dirijarea stresului oxidativ în boală: Promisiune și limitări ale terapiei antioxidante. Nat. Rev. Drug Discov. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Pot compușii fenolici vegetali să protejeze pielea de particulele din aer? Antioxidanți 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Studiu comparativ asupra activității de protecție a pielii a extractului bogat în polifenoli și a extractului bogat în polizaharide din Sargassum vachellianum. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Fitoconstituenți ca noi formulări cosmetice fotoprotectoare. Pharmacogn. Rev. 2010, 4, 1–11. [CrossRef]