Nanozimele care imită catalaza sensibilă la infamare atenuează leziunea renală acută prin inversarea stresului oxidativ local Ⅳ
Jun 19, 2024
Concluzie
Ierburi organice pentru boli de rinichi
Materiale și metode
Materiale
Sinteza și caracterizarea nanoparticulelor dMn3O4
Sinteza linkerului TK, polietilenglicolului conjugat cu linker TK (PEG-TK) și conjugatului (PEG)-stearina (C18) (PTC) a fost realizată conform publicației noastre anterioare [15]. Ca control, am preparat, de asemenea, polimer nesensibil la ROS (PC) prin conjugarea acidului stearic la PEG-AM. Pe scurt, 200 mg de m-PEG amină au reacţionat cu 160 mg de acid stearic cu 160 ui de TEA, 480 mg de EDC şi 290 mg de NHS în 20 ml de DMF la 37 de grade peste noapte cu agitare sub purjare cu N2. Proba a fost apoi purificată prin dializă (MWCO=12-14 KDa) împotriva DW timp de o zi, urmată de uscare prin congelare. Structurile chimice ale PTC și PC sintetizate au fost confirmate utilizând spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară de protoni (1H RMN) (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, SUA) în cloroform (CHCl3). Miceliile goale PTC sensibile la ROS și PC nesensibile la ROS au fost preparate prin auto-asamblarea PTC și PC sub sonicare și dializă.
Prepararea și caracterizarea enzimei sensibile la ROS (PTC-M)
PTC-M a fost preparat prin metoda de dializă. Pe scurt, 2 mg de dMn3O4 și 10 mg de PTC au fost dizolvate în 1 ml de dimetil sulfoxid anhidru (DMSO). Amestecul a fost apoi adăugat prin picurare la 20 ml de DW sub sonicare cu sondă (30% amplitudine, 5 s ON/OFF, 5 min). Soluția a fost apoi dializată (MWCO=12–14 KDa) împotriva DW timp de o zi, urmată de liofilizare. În mod similar, nanomicele nesensibile cu ROS încărcate cu dMn3O4 (PC-M) au fost, de asemenea, preparate ca grup de control. Diametrele hidrodinamice și potențialul zeta al nanomicelelor goale pregătite (PTC și PC) și nanomicelei încărcate cu dMn3O4 NP (PTC-M și PC-M) au fost evaluate prin împrăștierea dinamică a luminii (instrument Zetasizer Nano Z, Malvern, Marea Britanie). Morfologia PTC și PTC-M preparate au fost vizualizate folosind FE-TEM. Destabilizarea sensibilă la ROS prin degradarea linkerului TK al PTC-M a fost observată prin analiza DLS și FE-TEM după tratarea probelor cu 1 mM H2O2. Conținutul de încărcare de dMn3O4 în PTC-M final a fost analizat utilizând un analizor termogravimetric (TGA N-1000, Scinco, Seoul, Coreea) și o analiză ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, SUA) .
Descompunerea H2O2 în apă și oxigen a fost de asemenea confirmată folosind Ru(DDP) ca sondă pentru generarea de oxigen. Pe scurt, 1 mM H2O2 a fost adăugat la probe, urmatprin adăugarea a 1 pM Ru(dDDP(DMF). Mostreleau fost amestecate bine și intensitatea fluorescențeila excitație 440 nm și emisie 530 – 730 nm a fostînregistrate. Ulterior, a fost confirmată și producția de oxigenprin determinarea concentraţiei de oxigen dizolvat folosindun senzor de oxigen dizolvat (RDO Optical Dissolved Sensor, Thermo Scientific).
Cultură celulară și reactivi
Studiile in vitro au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [37]. Pe scurt, celulele epiteliale tubulare proximale renale umane (celule HK-2, American Type Culture Collection, Manassas, VA, SUA) au fost utilizate pentru studiile i vitro. Celulele HK-2 au fost cultivate și trecute la fiecare 3 – 4 zile în vase de 100-mm care conțineau o combinație de mediu Dulbecco modificat Eagle's (DMEM) și Hams F-12 (Welgene, Daegu, Coreea) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; Welgene), 100 U/ml penicilinăși 100 mg/ml streptomicină (Sigma-Aldrich). TeCelulele HK-2 au fost apoi incubate într-o atmosferă umidificatăsferă de 5% CO2și 95% aer la 37 de grade timp de 24 de ore și subcultivat până la 70 – 80% confluent. Celulele HK-2 au fostplacat pe vase de 60-mm într-un mediu care conține 10%FBS și incubat timp de 24 de ore. Celulele au fost apoi implicate
Viabilitatea celulară
Absorbția celulară
Citometrie în flux
Analiza citometriei în flux a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [38]. Un kit de colorare a anexinei V FLUOS (SigmaAldrich) a fost utilizat pentru a măsura nivelul de legare a anexinei V conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, după tratamentul cu 0 sau 1 mM H2O2 timp de 24 de ore cu sau fără 2 ug de pretratare PTC-M, celulele HK-2 au fost recoltate și spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat prerăcită și resuspendate. într-un tampon de legare care conține anexină V. După incubare în întuneric timp de 15 minute, celulele au fost analizate prin citometrie în flux (Becton–Dickinson, San Jose, CA, SUA). Au fost folosite mai multe controale pentru a optimiza setările instrumentului și pentru a determina porțile pentru platforma bazată pe Windows. Celulele apoptotice au fost definite ca fiind PI-negative și anexine V-FITC pozitive.
Determinarea generării intracelulare de ROS
Pentru a determina generarea de ROS, am folosit fluoroforul DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, SUA) așa cum a fost descris anterior [38]. Celulele HK-2 au fost incubate cu 0 sau 1 mM H2O2 timp de 24 de ore cu sau fără 2 ug de pretratare PTC-M și spălate de două ori cu soluția de sare echilibrată a lui Hank, apoi incubate cu sarea echilibrată a lui Hank soluție (fără roșu de fenol) care conține DCF-DA timp de 30 min la 37 de grade în întuneric. Imaginile au fost obținute cu un microscop cu fluorescență (Nikon, Tokyo, Japonia).
Animale experimentale și protocoale
Biodistribuția in vivo
Pentru a verifica efectul terapeutic al PTC-M in vivo, grupului de tratament i s-a administrat o doză unică de 0,5 mg/kg PTC-M prin injectare în vena cozii după intervenție chirurgicală. Șoareciiau fost eutanasiați după 48 de ore de reperfuzie. Probe de sângeau fost adunate din inimă, iar celerinichiul stânga fostîndepărtat rapid și prelucrat pentru Western blot saufixat într-o soluție de paraformaldehidă 4% pentru imunohistochimie (IHC). Therinichiul drepta fost înghețat la−80 de gradepentru analiza în timp real a reacției în lanț a polimerazei (PCR).
Măsurarea NGAL în plasmă
Imunoblot semicantitativ
Analiza Western blot a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [37]. Țesuturile renale au fost omogenizate într-o soluție de izolare rece ca gheața care conține 0.3 M zaharoză, 25 mM imidazol, 1 mM acid etilendiaminotetraacetic (EDTA), 8,5 mM leupeptină și 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil (pH 7,2). Omogenatele au fost centrifugate la 4000×g timp de 15 minute la 4 grade pentru a îndepărta celulele întregi, nucleele și mitocondriile. Concentrația totală de proteine a fost măsurată printr-un kit de analiză a acidului bicinchoninic (BCA) (Pierce; Rockford, IL, SUA). Toate probele au fost ajustate pentru a atinge aceleași concentrații finale de proteine. Au fost apoi dizolvate la 65 de grade timp de 15 minute în tampon de probă care conține dodecil sulfat de sodiu (SDS) și depozitate la -20 grade. Pentru a confirma încărcarea egală a proteinelor, un gel inițial a fost colorat cu albastru Coomassie. Electroforeza pe gel SDS-poliacrilamidă (PAGE) a fost efectuată pe geluri de poliacrilamidă 9 sau 12%. Proteinele au fost transferate electroforetic pe membrane de nitroceluloză (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, Marea Britanie) folosind un aparat Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad; Hercules, CA, SUA). Petele au fost blocate cu lapte 5% în PBS-T (80 mM Na2HPO4, 20 mM NaH2PO4, 100 mM NaCI și 0,1% Tween-20 la pH 7,5) timp de 1 oră; incubat peste noapte la 4 grade cu anticorpi primari; şi apoi incubate cu anticorpi secundari anti-iepure, anti-şoarece sau anti-capră conjugaţi cu peroxidază de hrean. Imunobloturile au fost apoi vizualizate folosind un sistem de chemiluminiscență îmbunătățit. Nivelurile de proteine au fost cuantificate folosind densitometrie. Intensitățile relative ale semnalelor imunoblot au fost măsurate prin densitometrie utilizând software-ul Scion Image pentru Windows (Scion Corporation, 2000–2001. versiunea Alpha 4.0.3.2. MD, SUA) și exprimate ca modificări de pliere în raport cu controalele. Anticorpii primari și secundari utilizați în imunoblot sunt enumerați în Tabelul S1.
Reacția în lanț a polimerazei în timp real (PCR în timp real)
Analiza reacției în lanț a polimerazei a fost efectuată așa cum a fost descris anterior [37]. Cortexele renale au fost omogenizate în reactiv Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). ARN-ul a fost extras cu cloroform, precipitat cu izopropanol, spălat cu etanol 75% și apoi dizolvat în DW. Concentrația de ARN a fost determinată de absorbanța la 260 nm (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Cambridge, Marea Britanie). Expresia ARNm a citokinelor inflamatorii și a moleculelor de adeziune a fost determinată prin PCR în timp real. ADNc a fost obținut prin transcrierea inversă a 5 ug de ARN total utilizând amorsarea oligo (dT) și transcriptaza inversă superscripta II (InvitRogen, Carlsbad, CA, SUA). ADNc a fost cuantificat utilizând un sistem Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA, SUA), iar SYBR Green a fost utilizat pentru detectare. Fiecare reacție PCR a fost efectuată în primer 10 pM, primer 10 pM invers, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japonia), 0,5 ul ADNc și H2O pentru a aduce volumul final la 20 ul. Nivelurile relative de ARNm au fost determinate prin PCR în timp real, folosind un sistem detector Rotor-GeneTM 3000 (cercetare Corbette, Mortlake, NSW, Australia). Secvențele primerilor sunt enumerate în fișierul suplimentar 1: Tabelul S2. PCR a fost efectuată în conformitate cu următoarele etape: 1) 95 de grade timp de 5 min; 2) 95 de grade timp de 20 s; 3) 58 până la 60 grade timp de 20 s (optimizat pentru fiecare pereche de primeri) și 4) 72 grade timp de 30 s pentru a detecta SYBR Green. Pașii 2 – 4 au fost repeți pentru încă 40 de cicluri, în timp ce la sfârșitul ultimului ciclu, temperatura a fost crescută de la 60 la 95 de grade pentru a produce o curbă de topire. Datele din reacție au fost colectate și analizate cu Corbett Research Software. Valorile de prag critice comparative din măsurători în patru exemplare au fost utilizate pentru a calcula expresia genei, cu normalizarea la GAPDH ca control intern. Analiza curbei de topire a fost efectuată pentru a spori specificitatea reacției de amplificare.
Histologie
Pregătirea țesutului renal a decurs așa cum a fost descris anterior [37]. Țesuturile renale au fost fixate cu paraformaldehidă 4%, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 3- μm grosime. Colorația periodică acid-Schif a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului (Abcam, Cambridge, MA, SUA). Pentru imunohistochimie, secțiunile de țesut deparafinate au fost recuperate de antigen prin încălzire la 1{{10}}0 grad timp de 15 minute în tampon citrat, pH 6.0 (Sigma- Aldrich). Secțiunile au fost incubate peste noapte la 4 grade cu anticorpi primari diluați în tampon de blocare (albumină serică bovină 1% [g/v] dizolvată în 0,3% [v/v] Triton X-100 preparat în PBS [0,3% PBS- T]). După ce secțiunile au fost spălate scurt de trei ori cu 0,3% PBS-T, acestea au fost incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorpi secundari diluați în tampon de blocare. Scorurile leziunilor tubulare au fost calculate prin metoda descrisă anterior [39, 40]. Scorul de leziune tubulară a fost măsurat prin examinarea joncțiunii corticomedulare mai mari sau egale cu 10 HPF (x200 de mărire) în secțiuni colorate cu PAS (n=5-7). Anticorpii primari și secundari utilizați în analizele imunohistochimice sunt enumerați în Tabelul S3. Apoptoza celulelor epiteliale tubulare a fost detectată cu colorarea TUNEL cu ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich), conform instrucțiunilor producătorului. Secțiunile de țesut ale tuturor organelor majore au fost colectate încorporate în parafină și colorate cu hematoxilină/eozină (H&E) pentru a compara modificările histologice.
Analiza statistica
Rezultatele sunt exprimate ca eroare standard medie a mediei (SEM). Comparații multiple între cele trei grupuri au fost efectuate utilizând analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) și testul post-hoc al diferențelor semnificative semnificative de la Tukey. Diferențele cu valori p mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative.
