Influența simulării digestiei umane in vitro asupra conținutului de substanțe fenolice și a activităților biologice ale extractelor apoase din speciile de cistus turcesc Partea 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

În concluzie

Extractul apos de C. salvifolius a prezentat o activitate inhibitoare a enzimelor digestive mai bună decât extractele altor specii. În plus, probele IN din toate extractele apoase au evidențiat activități de inhibiție a enzimelor mai scăzute în comparație cu probele ND.

Activitatea inhibitorie a vârstelor

Așa cum este prezentat în Tabelul 4, activitatea inhibitoare a AGE dependentă de concentrație a fost observată în toate extractele apoase. Probele ND de CCA, CPA și CSA au prezentat o activitate inhibitorie mai bună decât compusul de referință quercetină în ambele concentrații de 0,5 și 1 mg/mL. Cu toate acestea, numai extractul de C.saluifolius a prezentat o activitate inhibitoare mai bună decât quercetina printre probele IN ale extractelor. Probele biodisponibile de extracte apoase au prezentat activități inhibitoare AGE mai scăzute în comparație cu probele nedigerate. Conform rezultatelor, proba ND de extract apos de C. salvifolius a avut cea mai mare activitate inhibitoare a AGE. Cu toate acestea, proba IN de extract apos de C.monspeliensis a prezentat cel mai slab potențial de inhibare a AGE în concentrațiile testate.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

3. Discuție

Radicalii liberi pot ataca proteinele, lipidele sau ADN-ul pentru a procura un electron, ceea ce duce la diverse probleme de sănătate. Din acest motiv, este esențială echilibrarea sistemului antioxidant al organismului și a radicalilor liberi formați prin oxidare. În cazul deteriorării acestui echilibru, apare stresul oxidativ [29]. Stresul oxidativ este unul dintre principalii factori care au ca rezultat diverse tulburări cronice, cum ar fi cancerul, diabetul, bolile cardiovasculare, boala Alzheimer etc. Deși există sisteme auto-antioxidante în corpul uman pentru a combateoxidativdeteriorarea țesuturilor și organelor, aceste sisteme de apărare își pot pierde eficiența din cauza diferitelor condiții, cum ar fi consumul excesiv de alcool, fumatul, stresul, consumul cronic de droguri și radiații etc. [30]. Diverse rapoarte științifice au indicat că metaboliții secundari de plante joacă un rol semnificativ în prevenirea stresului oxidativ și a efectelor nocive ale acestuia [13,14,31]Chiar dacă biodisponibilitatea este un parametru important care afectează bioactivitatea acestor compuși, nu a fost luată în considerare în majoritatea studiilor. Cu toate acestea, este bine cunoscut faptul că metaboliții secundari sunt supuși transformărilor structurale din cauza diferitelor condiții de pH, activități enzimatice și temperatură corporală în sistemul gastrointestinal. În plus, caracteristicile chimice ale metaboliților secundari, cum ar fimoleculargreutatea, polaritatea și gradul de legare la macromolecule din matricea plantei sunt, de asemenea, factori semnificativi care afectează biodisponibilitatea acestora [13]. În consecință, absorbția compușilor sau a metaboliților acestora în fluxul sanguin odată ingerați este esențială pentru a-și exercita efectele fiziologice sistemice. Modelele de simulare a digestiei in vitro pot furniza dovezi pentru evaluarea posibilelor caracteristici de biodisponibilitate ale substanțelor. În timp ce confirmarea în studiile pe oameni este necesară pentru a revendica orice proprietate funcțională, modelele de simulare in vitro sunt utilizate pe scară largă ca alternative la studiile in vivo sau la studiile pe oameni, care sunt adesea discutabile din punct de vedere etic, consumatoare de resurse, costisitoare și consumatoare de timp [32].

Cistanche poate îmbunătăți imunitatea

Mai mulți cercetători au investigat și potențialul antioxidant al extractelor preparate din diferite organe ale speciilor Cistus. Potrivit studiului de literatură, acesta este primul studiu asupra speciilor de Cistus privind biodisponibilitatea substanțelor fenolice și impactul acestora asupra activității antioxidante prin utilizarea unui model de simulare a digestiei in vitro. Karas și colab. [33] au sugerat că 10% dintre componentele polifenolice rămân nedigerate în matricea plantei și 90% dintre ele sunt supuse digestiei în faza gastrică sau intestinală (aproximativ 48% și, respectiv, 52%). După cum sa menționat mai devreme, toate cantitățile fenolice din extractele apoase au fost afectate negativ de procedura de simulare a digestiei umane in vitro. Astfel, au fost detectate pierderi semnificative în conținutul fenolic al probelor biodisponibile din toate extractele. Mai mult, concentrațiile totale de proantocianidină ale probelor de IN au fost sub limita de detectare în toate extractele apoase. Diverse studii au determinat, de asemenea, influența negativă a procedurii de digestie asupra compușilor fenolici din extractele de plante și, prin urmare, asupra bioactivităților asociate. De exemplu, am raportat conținutul total de fenolici al Salvia virgata Jacq. a fost, de asemenea, afectată negativ de procedura de digestie în studiul nostru anterior. În plus, cantitățile de metaboliți majori ai extractului, adică rutina și acidul rosmarinic, au avut tendința de a scădea [13]. În schimb, mai multe studii au raportat rezultate contradictorii. În studiul lui Celeb și colab. [34], ei au observat creșterea cantităților totale de acid fenolic, flavonoid și fenolic în probele biodisponibile de extract metanolic din Hypericum perfoliatum L. De fapt, principalii metaboliți, quercitrina, acidul clorogenic și acidul galic, aveau rate de bioaccesibilitate de peste 100. la sută. Aceste studii au arătat că efectele procedurii de digestie pot varia în funcție de materialele vegetale. Pentru a clarifica aceste diferențe, este esențial să se ia în considerare mecanismul de acțiune al sistemului de digestie asupra substanțelor fenolice. Serra şi colab. [35] au sugerat că compușii fenolici se găsesc în principal în glicozide, polimeri și forme esterice din matricea plantei și sunt hidrolizați în sistemul digestiv înainte de absorbție. Diferiți factori pot influența transformările structurale ale compușilor fenolici din tractul gastrointestinal. De exemplu, compușii cu greutăți moleculare mai mari, cum ar fi proantocianidinele sau procianidinele, trebuie să fie hidrolizați înainte de absorbția în intestin. Structura matricei plantei este, de asemenea, un factor proeminent în biodisponibilitatea substanțelor fenolice; compușii fenolici se pot lega de macromoleculele din matricea plantelor, cum ar fi fibrele, proteinele și moleculele de lipide. Astfel, numai componentele fenolice eliberate din matrice pot deveni absorbabile din tractul gastrointestinal. Mai mult, diferitele valori ale pH-ului și acțiunile enzimatice ale microbiotei intestinale sunt printre alți factori cruciali care afectează transformarea în structura chimică a compușilor fenolici [36]. În lumina acestor date, putem formula ipoteza că rezultatele diferite obținute din tipuri similare de studii experimentale se pot datora complexității sistemului de digestie și compoziției matricei plantei. Așa cum este prezentat în Tabelul 3, probele biodisponibile de extracte de Cistus au prezentat o activitate antioxidantă mai slabă decât omologii nedigerați și post-gastric datorită conținutului lor fenolic mai scăzut.

În plus, ambele extracte de C. saluifolius au prezentat o activitate antioxidantă mai bună în testele DPPH, CUPRAC, FRAP și TOAC în comparație cu alte specii. În plus, ambele extracte de C.paroiflorus au prezentat o activitate mai mare de captare a radicalilor DMPD decât extractele altor specii. După cum este indicat în Tabelul 1, conținutul total de fenolici, flavonoide și acid fenolic din C. salviifolius a fost mai mare decât în ​​celelalte probe. Astfel, potențialul antioxidant mai mare al extractelor de C. saloiifolius poate fi legat de conținutul său fenolic.

Mai mult, reducerea potențialelor antioxidante, activitățile inhibitorii asupra enzimelor legate de carbohidrați și AGE-urile probelor biodisponibile pot fi legate de scăderea glicozidelor flavonoide marker. Cu toate acestea, extractele de Cistus conțineau și alte substanțe fenolice, așa cum este indicat în Figura 1. Prin urmare, este necesară o analiză cromatografică detaliată a extractelor pentru a monitoriza influența digestiei asupra activității biologice.

Potențialul inhibitor al extractelor de plante asupra enzimelor digestive a atras recent mai multă atenție din cauza preocupării de siguranță a inhibitorilor sintetici. Prin urmare, efectul inhibitor al extractelor de plante a fost determinat în mai multe studii, iar acest efect a fost asociat în general cu substanțe fenolice precum flavonoide, acizi fenolici, proantocianidine etc. Sun et al. [37] au sugerat că compușii polifenolici își manifestă efectele inhibitoare prin legarea cu enzimele menționate mai sus cu ajutorul forțelor hidrofobe și a legăturilor necovalente. Prin urmare, inhibarea activității enzimelor -amilazei și -glucozidazei de către polifenoli este legată de structurile moleculare ale acestora. În timp ce acest mecanism de interacțiune a fost studiat folosind diferite tehnici, cum ar fi cinetica de inhibiție, stingerea fluorescenței de andocare moleculară etc., nu a fost încă obținută o concluzie sigură [38]. Cu toate acestea, numeroase studii au raportat că inhibițiile enzimelor digestive ale extractelor de plante sunt direct legate de conținutul lor fenolic. Studii similare privind activitățile de inhibiție a enzimelor ale speciilor Cistus au fost, de asemenea, raportate anterior. Sayah și colab. [39] a investigat activitățile inhibitoare ale -amilazei și a-glucozidazei ale extractelor metanolice și apoase de 80 procente din C. monspeliensis și C. saluifolius. Rezultatele lor au fost în conformitate cu studiul de față, dezvăluind că extractul apos de C. salvijfolius a demonstrat glucozidază mai mare (IC50 ug/mL∶0.95±0.14) și o -amilază (IC50 ug/mL∶217,1±0,15) activitate inhibitoare decât extractul apos de C.monspeliensis (IC50 ug/mL∶14,58±1,26) și respectiv (ICsn ug/mL): 0,80,10,1:±80,10,1, Ratele de inhibiție ale ambelor extracte apoase asupra acestor enzime au fost mai mari decât acarboza compusului de referință (ICso ug/mL:18,01±2.00) Similar studiului nostru, ei au găsit o corelație cu ratele de inhibiție a enzimei și totalul cantități fenolice și flavonoide. Atât conținutul total de fenolici, cât și conținutul total de flavonoide ale extractului apos de C. salvijfolius (408,43±1,09 mg GAE și, respectiv, 140,00±1,15 RE) au fost mai mari decât extractul apos de C.monspeliensis (261,76 ±1,9mg GAE și 1,9mg GAE). 78.00±1,15 RE respectiv). Orhan şi colab. [40] a investigat, de asemenea, potențialele inhibitoare ale enzimelor digestive ale extractelor apoase și etanolice de 80% din frunzele de C.laurifolius. Conform rezultatelor lor, extractul etanolic de 80 la sută (71,7 la sută ± 0,6) a prezentat o activitate puternică de inhibiție a amilazei în comparație cu extractul apos (39,3 la sută ± 2,2) la o concentrație de 1 mg/mL. Ei au sugerat că compușii fenolici, în special flavonoidele, afectează direct secreția de insulină, prevenind apoptoza celulelor beta și susținând activitatea anti-diabetică. Această ipoteză, corelată cu rezultatele noastre, marchează că proba ND de extracte apoase de C. salviifolius a exercitat cel mai mare conținut total de flavonoide și fenolice și cea mai mare activitate inhibitoare a o-amilazei și o-glucozidazei. După cum este prezentat în Tabelul 4, extractul apos de C. salviifolius a prezentat activități inhibitorii mai bune asupra enzimelor digestive decât celelalte extracte.

În plus, probele IN ale extractelor apoase au conținut cantități mai mici de fenolici și flavonoizi decât probele ND și, astfel, au evidențiat activități de inhibiție a enzimelor mai scăzute în lucrarea de față. În timp ce conținutul fenolic al extractelor a fost afectat negativ de procedura de digestie, ele au încă prezentat o activitate inhibitorie semnificativă a enzimelor digestive. În mai multe studii, glicozidele flavonoide au fost raportate ca metaboliți majori ai extractelor de plante cua-amilazași potențialele inhibitoare ale -glucozidazei [41-43]Deși mecanismul inhibitor al compușilor fenolici asupra enzimelor digestive nu a fost încă dezvăluit, au fost efectuate studii privind relația structură-activitate pe unele componente fenolice precum flavonoidele, acizii fenolici, proantocianidinele și taninuri Studiile privind relația structură-activitate despre flavonoide au arătat că legătura dublă C2=C3 a inelului C îmbunătățește potențialul de inhibare a enzimelor digestive al unor astfel de compuși. Deoarece această legătură crește densitatea electronilor, puterea interacțiunii dintre flavonoid și enzimă este crescută [44]. În plus, grupările hidroxil de pe C-5 și C{-7 facilitează potențialul inhibitor de o-amilază al flavonoidelor. S-a sugerat, de asemenea, că hidroxilarea scheletului flavonoidelor le afectează pozitiv a-amilaza și-enzima glucozidazapotențiale inhibitorii[45]. După cum s-a indicat mai devreme, toate flavonoidele marker din studiul de față au fost glicozide flavonolice care poartă aceste cerințe structurale descrise mai sus. Cu toate acestea, după procedura de digestie in vitro, activitățile lor asociate au scăzut semnificativ în probele biodisponibile ale extractelor apoase.

În general, potențialul inhibitor al extractelor de plante asupra AGE este legat de mai mulți factori, adică conținutul fenolic al acestora, potențialele antioxidante, capacitățile de chelare a metalelor, interacțiunile proteice și activitățile de blocare a receptorilor AGE[13]. Așa cum este prezentat în Tabelul 4, probele biodisponibile ale extractelor apoase au prezentat activități inhibitoare AGE mai scăzute în comparație cu probele ND, deoarece procedura de digestie in vitro a afectat negativ conținutul de fenolici al extractelor. Conform rezultatelor studiului actual, proba ND de extract apos de C. salvifolius a avut cea mai mare activitate inhibitoare a AGE, precum și conținutul total de fenolici și flavonoizi. În comparație, eșantionul IN de extract apos de C.monspeliensis a arătat cel mai slab potențial de inhibare a AGE, care poate fi atribuit celui mai scăzut conținut total de flavonoizi și fenolici. Deoarece flavonoidele au o distribuție pe scară largă în extracte de plante, fructe, legume și băuturi, mai multe studii s-au intensificat asupra potențialului de inhibiție al flavonoidelor asupra formațiunilor AGE. Aceleași flavonoide atribuite ca marker fenolici în acest studiu au fost, de asemenea, raportate drept compuși marker în alte studii[46-48].

Similar cu inhibarea enzimelor digestive, activitățile de inhibiție a AGE ale flavonoidelor au fost stimulate de legătura dublă C2=C3 și hidroxilarea inelelor A și C. Cu toate acestea, atașarea zahărului de scheletul flavonoid duce la scăderea activității inhibitorii [49]. Pe de altă parte, Cervantes-Lauren și colab. [50] au sugerat că flavonul-3-de glicozide poseda un potențial de inhibare a AGE mai mare decât celelalte glicozide flavonoide. Această ipoteză poate fi o explicație pentru scăderea inhibării AGE în probele biodisponibile. De exemplu, quercitrină și hiperozidă nu au fost detectate în probele biodisponibile din extractul apos de C.monspeliensis, ceea ce este motivul pentru activitatea mai scăzută a probelor IN de C.monspeliensis în comparație cu extractele de la alte specii. Chiar dacă quercitrina nu a fost detectată în extractul apos de C. saloifolius, cantități semnificativ mai mari de hiperozidă și salidrozidă pot fi cauza activității sale mari de inhibare a AGE. În general, s-a observat o corelație pozitivă între conținutul de flavonoizi marker al probelor și potențialul inhibitor al acestora asupra AGE.

4. Material și Metode

4.1.Produse chimice

Toate referințele, enzimele și substanțele chimice folosite în experimente au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SUA). În experimente au fost utilizate materiale de calitate analitică.

4.2.Probe de plante

Părți aeriene de C.creticus și C.saloifolius au fost adunate din campusul Universității Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) în ultima săptămână din aprilie 2018. Părți aeriene de C.mon-speliensis și C.paroiflorus au fost adunate din apropierea AlacatI Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir în a doua săptămână a lunii mai 2018. Părți aeriene de C. laurifolius au fost colectate de pe drumul Kemer-Doganhisar, Konya, în prima săptămână a lunii iunie 2018. Prof. dr. Erdem Yesilada a autentificat materiale vegetale. Specimenele voucher pentru C.creticus (YEF18013), C.lauri-folios (YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroifforus(YEF18016) și C.salvifolus (YEF18014) au fost depozitate la Herbarul Departamentului de Farmacognoză Facultatea de Farmacie, Universitatea Yeditepe, Istanbul, Turcia.

4.3.Procedura de extragere

Extracția apoasă a fost aleasă deoarece este folosită în mod obișnuit ca tehnică de preparare în medicina tradițională. Părțile aeriene grosier uscate la aer și pulverizate aleCistanchespeciile (100 g) au fost extrase cu apă distilată fierbinte (80 grade, 1,5 L) utilizând un dispozitiv de agitare timp de 15 min. Apoi, extractele apoase au fost filtrate printr-o hârtie de filtru și evaporate la sec sub presiune redusă. După finalizarea procedurii de liofilizare, extractele au fost dizolvate în apă distilată pentru prelucrare ulterioară (probă nedigerată: ND) (randamentul de extracte: 13,04% pentru C.creticus, 15,7% pentru C.laurifolius, 12,8% pentru C.monspeliensis). ,14,94 la sută pentru C.parviflorus, 14,74 la sută pentru C. salvifolius).

4.4.Metoda de simulare a digestiei umane in vitro

Modelul de simulare a digestiei umane a fost aplicat probelor de Cistus in vitro, urmând metoda detaliată mai devreme de Celeb et all.[34]. În primul rând, 1 g NaCl și 1,6 g pepsină au fost dizolvate în 500 mL de apă distilată pentru a obține o soluție simulată de fluid gastric. (SGF). Ulterior, pH-ul soluției de SGF a fost aranjat la 2 cu HCI (5 M); 17,5 mL din această soluție au fost amestecați cu 2,5 mL de probe de plantă, iar acest amestec a fost situat în baia de apă agitată la 37 de grade timp de 2 ore până la imita miscarile peristaltice ale sistemului digestiv. După 2 ore, probele au fost puse într-o baie de gheață pentru a inactiva reacțiile enzimatice; 2 mL din probe au fost puse deoparte ca probă „post-gastrică” (P) pentru experimente ulterioare. O membrană de dializă celulozică încărcată cu o cantitate adecvată de NaHCO3(1 M, pH7) a fost localizată în soluțiile de probă rece; astfel, absorbția gastrointestinală a fost imitată. Apoi, 4,5 ml de soluție de acizi biliari/pancreatină au fost combinați cu soluțiile și amestecul a fost incubat încă 2 ore la 37 de grade. În cele din urmă, fluidul din interiorul membranei de dializă a fost achiziționat ca probă „biodisponibilă” (IN). După terminarea procedurii, toate probele au fost păstrate la grade -20 pentru experimente ulterioare. 4.5. Estimarea in vitro a profilului fenolic

4.5.1. Testul conținutului total de fenolici

Determinarea spectrofotometrică a conținutului fenolic total al probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri conform metodei detaliate mai devreme de Barak și colab.【32】; s-au adăugat 75 uL de NagCO3 (20% în H2O). 20 μL de probă proaspăt preparată și soluții de referință. Apoi, 100 μL de reactiv Folin-Ciocalteu au fost combinați cu amestecul. După o perioadă de incubare de 30 de minute la temperatura camerei în întuneric, absorbanța a fost măsurată la 690 nm. Acidul galic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a stabili o curbă de calibrare și conținutul total de fenolici a fost exprimat ca echivalenți de acid galic (GAE).

4.5.2. Testul conținutului total de flavonoide

Determinarea spectrofotometrică a conținutului total de flavonoizi a probelor a fost gestionată într-un șablon de placă de 96-godeuri în conformitate cu metoda explicată anterior de Bardakci și colab.[51]; 150 uL de etanol 75%, 10 uL de clorură de aluminiu , și 10 uL de acetat de sodiu 1M trihidrat au fost combinați cu 50 uL de soluție de probă și de referință, separat. Apoi, aceste amestecuri au fost incubate la temperatura camerei întunecate timp de 30 de minute. După perioada de incubare, absorbanța a fost calculată la 405 nm.Quercetinăa fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a stabili o curbă de calibrare și conținutul total de flavonoide a fost reprezentat ca echivalenți de quercetină (QE). 4.5.3. Testul conținutului total de acid fenolic

Conținutul total de acid fenolic al probelor a fost măsurat spectrofotometric urmând procedura raportată anterior de Barak și colab. [52]. În primul rând, s-au dizolvat cantități adecvate de nitrit de sodiu și molibdat de sodiu în apă distilată pentru a obține reactivul Arnow. Apoi, 1 ml de probe a fost combinat cu 1 ml de reactiv Arnow, 1 ml de 0.1 M HCI și 1 ml de NaOH 1M, separat. După aceea, volumul amestecului a fost ajustat la 10 mL cu apă distilată, iar absorbanța a fost citită imediat la 490 nm. Acidul cafeic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare, iar conținutul total de acid fenolic a fost dat ca echivalenți de acid cafeic (CAE).

4.5.4. Testul conținutului total de proantocianidină

Determinarea spectrofotometrică a conținutului total de proantocianidină al probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând metoda lui Barak și colab. [1] Pe scurt, 25 uL de soluții de probă au fost amestecate cu 150 µL de 4% vanilină și, respectiv, 75 µL de soluții de HCI (32%). După 15 minute timp de incubare la temperatura camerei întunecate, absorbanța a fost ajustată la 492 nm. Catechină hidrat a fost utilizat ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Metanolul a fost folosit ca soluție de control. Conținutul total de proantocianidină al probelor a fost declarat ca echivalenți de catechine (CE).

4.6. Teste de activitate de eliminare a radicalilor liberi 4.6.1. Testul de activitate de eliminare a radicalilor DPPH

Activitatea de captare a radicalilor DPPH a probelor a fost determinată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând metoda modificată de Celeb și colab.[53]. La început, 150 uM de soluție de DPPH a fost proaspăt preparată. Apoi, 200 μL de soluție DPPH au fost amestecate cu 25 μL de soluții de probă. Apoi, acest amestec a fost incubat la temperatura camerei întunecate timp de 50 de minute. Absorbanța a fost calculată la 540 nm. Hidroxitoluenul butilat (BHT) a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații. Metanolul a fost folosit ca soluție de control. Activitatea probelor a fost prezentată ca EC50, corespunzătoare concentrației care prezintă activitate de 50 la sută.

4.6.2.DMPD Testul activității de eliminare a radicalilor

Activitatea de captare a radicalilor DMPD plus (N,N-dimetil-p-fenilendiamină) a probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri conform metodei descrise mai devreme de Inan și colab. [13]. În primul rând, 10{{10}} mM DMPD plus soluție, 0,05 M FeCl; Soluție 6H2O și tampon acetat 0,01 M au fost proaspăt preparate. Apoi, 1 mL de soluție de DMPD, 100 mL de tampon acetat și 0,2 mL de FeCl; Soluția de 6H2O a fost amestecată, iar mai târziu 15 μL de soluții de probă au fost combinate cu 210 μL din acest amestec. După perioada de incubare la temperatura camerei întunecate timp de 50 de minute, absorbanța a fost măsurată la 492 nm. Trolox a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Concentrațiile soluțiilor de probă au fost de 1 mg/mL. Activitățile de captare a radicalilor DMPD ale probelor au fost declarate ca echivalenți Trolox (TE). 4.7.Teste de activitate de reducere a metalelor

4.7.1. Testul de reducere a puterii antioxidante ferice (FRAP)

Determinarea activității FRAP a probelor a fost realizată într-un șablon de placă cu 96 de godeuri urmând procedura raportată mai devreme de Bardakci și colab.[54]. La începutul experimentului, reactivul FRAP a fost format prin amestecarea tamponului acetat, feric-tripiridiltriazină și FeCI; soluții 6H2O. După aceea, reactivul FRAP a fost introdus în cuptorul la 37 de grade timp de 30min. Apoi, 10 uL de soluții de probă au fost combinate cu 30 uL de apă distilată și, respectiv, 260 uL de reactiv FRAP. După timpul de incubare la 37 de grade timp de 30 de minute, absorbanța a fost ajustată la 593 nm. O curbă standard a fost construită prin utilizarea diferitelor molarități de soluție de sulfat feros (0,25-2 mM) pentru a evalua rezultatele. BHT a fost utilizat ca soluție de referință la diferite concentrații. Activitățile FRAP ale probelor au fost prezentate ca mM FeSO4 în 1 g extract uscat.

4.7.2. Testul capacității de reducere a cupridei (CUPRAC)

Activitatea CUPRAC a probelor a fost determinată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând metoda modificată de Celeb și colab. 【31】; 85 μL de CuSO4 （10 mM）, neocupraină și soluții de acetat de amoniu și 51 uL de apă distilată au fost adăugate la 43 uL de soluții de probă, separat. După o perioadă de incubare (20 min) la 50 de grade într-o baie de apă, absorbanța a fost măsurată la 450 nm. Acidul ascorbic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Activitățile CUPRAC ale probelor au fost prezentate ca echivalenți de acid ascorbic (AAE). 4.8. Testul activității antioxidante totale (TOAC) Determinarea activității antioxidante totale a probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând procedura de Celeb și colab. [55]. La început, o anumită cantitate de fosfat de sodiu monobazic, molibdat de amoniu tetrahidrat și acid sulfuric a fost amestecată pentru a obține soluția TOAC. Apoi, s-au adăugat 300 μL de soluție TOAC la 30 μL de soluții de probă. După perioada de incubare la 95 de grade într-o baie de apă timp de 90 min, absorbanța a fost determinată la 690 nm. Acidul ascorbic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Activitățile TOAC ale probelor au fost reprezentate ca echivalenți de acid ascorbic (AAE). 4.9.Estimarea indicelui de biodisponibilitate

Indicele de biodisponibilitate (BAvI) a fost calculat conform ecuației teoretice descrise de Inan și colab.[13]: BAVI=CIN/CND „Indexul de biodisponibilitate” (BAvI) a fost descris ca raportul dintre numărul de substanțe fenolice din proba biodisponibilă (IN) la cea din proba nedigerată (ND). 4.10. Cuantificarea markerului de flavonoide prin HPTLC

Determinarea cantitativă a concentrațiilor de salidrozidă, hiperozidă și quercitrină în toate probele de simulare (ND, PG, IN) ale extractelor apoase din speciile Cistus a fost efectuată prin cromatografie în strat subțire de înaltă performanță (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Elveția) urmând metoda validată de Guzelmeric et al.[16]. Hiperozidă, salidrozidă și quercitrină au fost preparate în concentrații de 25, 50 și 100 ug/mL, iar concentrațiile soluțiilor de probă proaspăt preparate au fost ajustate la 10 mg/mL. Aceste soluții au fost aplicate pe plăci de silicagel cu suport de sticlă în fază normală (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Germania) cu anumite volume (1-5 μL soluții standard și 5 uL soluții de probă) folosind seringi de 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, Elveția）. Procedura de aplicare a fost efectuată cu aplicatorul de probă Linomat 5. Procesul de dezvoltare a fost efectuat în Camera de Dezvoltare Automatizată (ADC 2) și acetat de etil: diclormetan. acid acetic. acid formic: apă (10:25:10) :10:10:10me) a fost selectat ca fază mobilă. Apoi, plăcile au fost derivatizate cu reactiv produs natural (NPR) (1 g difenilboricacid 2-aminoetilesterin 200 ml de acetat de etil) în dispozitivul de imersie (CAMAG).hiperozidăși quercitrina au fost analizate spectrofotometric la 260 nm, cantitatea de salidrozidă a fost măsurată la 330 nm cu un scanner UV. Valorile Rf ale standardelor au fost determinate ca hiperozidă （≈0.35）, quercitrină （≈0.45）, tilirozidă （≈0.65）. Coeficienții de corelație (r2) s-au dovedit a fi ×098. pentru cuantificarea flavonoidelor marker.

4.11.Activitatea inhibitorie asupra enzimelor asociate diabetului

4.11.1. -Activitate inhibitoare a glucozidazei

-Activitățile inhibitoare de glucozidază ale probelor nedigerate și biodisponibile obținute din extractele apoase din speciile Cistus au fost examinate urmând metoda explicată mai devreme de Balan și colab. [56]. În primul rând, cantitățile adecvate de fosfat monosodic și fosfat disodic au fost amestecate cu obținerea de tampon fosfat de 10{0mM (pH7). O--enzima glucozidază a fost dizolvată în tampon fosfat pentru a obține soluția de a-glucozidază （0.2U/mL）. Apoi 170 uL de tampon fosfat, 2{0 μL de soluție de -glucozidază și 2{0 uL de soluții de probă au fost combinate și incubate într-un cuptor de 37 de grade timp de 15 minute. După aceea, la amestec s-au adăugat 20 μL de soluție de p-nitrofenil- -D-glucopiranozidă 2,5 mM în tampon fosfat de potasiu 100 mM (pH7,0) și a fost executată o altă perioadă de incubare la 37°C. grad timp de 15 min. Apoi, 80 μL de soluție de carbonat de sodiu 0,2 M au fost atașați la amestec pentru a termina reacția. Absorbanța a fost măsurată la 405 nm. Soluția de quercetină la diferite concentrații a fost folosită ca referință. Rezultatele au fost estimate ca procent de activitate inhibitorie în concentrații de 1 mg/mL și 0,5 mg/mL de probe ND și IN din extractele apoase din speciile Cistus. 4.11.2. -Activitatea inhibitoare a amilazei Activitatea inhibitoare a o-amilazei a probelor nedigerate și biodisponibile obținute din extractele apoase din speciile Cistus a fost determinată urmând procedura detaliată anterior de Balan și colab.[56]. Determinarea spectrofotometrică a activităților de inhibiție a a-amilazei a probelor a fost efectuată prin utilizarea reactivului DNS (acid 3,5-dinitrosalicilic). După cum se precizează în metodă, maltoza se formează din conversia amidonului, iar culoarea galbenă a DNS alcalin este transformată în culoarea portocalie-roșu datorită maltozei produse din amidon. Astfel, s-a preparat soluție de DNS 96 mM din amestecul de soluție de tartrat de sodiu și potasiu (dizolvat în NaOH 2 M) și o anumită cantitate de DNS (dizolvat în apă distilată). Apoi, tampon de fosfat de sodiu 20 mM cu NaCI 6,7 mM (cofactor al enzimei u-amilaze) a fost preparat la 20 de grade (pH: 6,9). enzima a-amilază (1U/mL) și amidonul (10 mg/mL) au fost dizolvate în acest tampon. După aceea, 50 μL de tampon fosfat de sodiu și 10 μL de soluție de enzimă a-amilază au fost amestecate cu 20 μL de soluții de probă. Acest amestec a fost incubat la 37 de grade timp de 45 de minute. După perioada de incubare, la amestec s-au adăugat 20 μL de soluție de amidon. O altă perioadă de incubație a fost începută la 37 de grade timp de 45 de minute. Aceeași procedură a fost aplicată probelor fără adăugarea de soluție de enzimă w-amilază numită „fondul probei”. Grupul de control a fost studiat cu aceeași procedură în absența soluțiilor de probă. Absorbanța a fost măsurată la 540 nm. Acarboza a fost utilizată ca soluție de referință la diferite concentrații. Rezultatele au fost prezentate ca procent al activității inhibitorii în concentrații de 1 mg/mL și 0,5 mg/mL de probe ND și IN din extracte apoase din speciile Cistus. 4.11.3.Activitatea inhibitoare a AGE Activitatea inhibitoare a AGE a probelor nedigerate și biodisponibile din extracte apoase din speciile Cistus a fost determinată urmând metoda descrisă de Starow-icz și colab. [57]. Înainte de orice proces, concentrațiile de 1 mg/mL și 0,5 mg/mL de probe ND și IN au fost proaspăt preparate. Apoi, 1 mL de concentrație de 10 mg/mL de soluție de albumină serică bovină (BSA) a fost adăugat la 1 mL de soluții de probă ND și IN. Probele de control au fost preparate fără adăugarea de soluții de probă ND și IN, iar probele martor au fost preparate fără adăugarea de glucoză 0,5 M. Apoi, toate probele preparate au fost incubate timp de 40 de ore într-o baie de apă agitată la 55 de grade. După încheierea perioadei de incubare, a fost utilizat cititorul de microplăci multimod Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX în domeniul de excitație de 370 nm/emisie de 440 nm pentru a calcula intensitatea fluorescenței. Quercetina a fost folosită ca soluție de referință la diferite concentrații.

4.12.Analiza statistică

Toate experimentele au fost efectuate independent de trei ori diferite. Programul software GraphPad Prism (versiunea 6.1) a fost utilizat pentru a determina distribuția parametrică sau neparametrică a datelor. Secțiunea de analiză a comparațiilor multiple a lui ANOVA unidirecțională Tukey a fost utilizată pentru a evalua testele TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH și DMPD. Pe de altă parte, rezultatele experimentelor de inhibare a o-amilazei, -glucozidazei și AGE au fost examinate prin analiza de comparații multiple ANOVA bidirecțională Sidak. Rezultate semnificative au fost arătate cu p<0.05. 5.="">

În studiul de față, extractele apoase din toate speciile de Cistus înregistrate în flora turcească au fost investigate pentru profilurile fenolice și potențialul antioxidant și antidiabetic in vitro. Deoarece decoctul sau infuzia este forma comună în medicamentele tradiționale, utilizarea extractelor apoase pentru evaluarea activității în studiile experimentale este deosebit de importantă. Pe de altă parte, constituenții hidrofili din extractul apos sunt supuși unei serii de transformări metabolice în sistemul gastrointestinal odată ingerați. Prin urmare, pentru evaluarea corectă a activității formulărilor tradiționale, trebuie investigate și activitățile metaboliților biodisponibili.

Acesta este primul studiu care examinează consecințele metodei de simulare a digestiei umane in vitro asupra speciilor turcești de Cistus. În plus, potențialul de inhibiție al speciilor de Cistus turcesc asupra AGE a fost studiat în acest studiu pentru prima dată. În plus, salidrozidă, hiperozidă și quercitrină au fost atribuite markerflavonoide, iar modificările concentrațiilor lor au fost monitorizate în procedura de digestie in vitro. În timp ce conținutul fenolic și activitățile antidiabetice și antioxidante ale extractelor au fost afectate negativ de procedurile de digestie gastrointestinală, ele au încă prezentat o bioactivitate semnificativă. Conform rezultatelor, extractul de C.saloifolius a fost detectat ca fiind cea mai puternică plantă din punct de vedere al conținutului de fenolici și activități antioxidante și antidiabetice. În concluzie, părțile aeriene din speciile de Cistus turcesc au conținuturi fenolice bogate și activități potențiale antioxidante și antidiabetice. În timp ce metoda de simulare a digestiei in vitro a fost folosită pentru a evalua biodisponibilitatea, este posibil să nu imite pe deplin căile metabolice care apar în organism. Prin urmare, sunt necesare studii in vivo și clinice suplimentare pentru a evalua biodisponibilitatea compușilor fenolici și contribuția acestora la efectele farmacologice raportate în detaliu.

Acest articol este extras din Molecules 2021, 26, 5322