Influența simulării digestiei umane in vitro asupra conținutului de substanțe fenolice și a activităților biologice ale extractelor apoase din speciile de cistus turcesc Partea 2

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

3. Discuție

Radicalii liberi pot ataca proteinele, lipidele sau ADN-ul pentru a procura un electron, ceea ce duce la diverse probleme de sănătate. Din acest motiv, este esențială echilibrarea sistemului antioxidant al organismului și a radicalilor liberi formați prin oxidare. În cazul deteriorării acestui echilibru, apare stresul oxidativ [29]. Stresul oxidativ este unul dintre principalii factori care au ca rezultat diverse tulburări cronice precum cancerul, diabetul, bolile cardiovasculare, boala Alzheimer etc. Deși există sisteme auto-antioxidante în corpul uman pentru a combate daunele oxidative ale țesuturilor și organelor, aceste apărare. sistemele își pot pierde eficiența din cauza diferitelor condiții, cum ar fi consumul excesiv de alcool, fumatul, stresul, consumul cronic de droguri și radiații etc. [30]. Diverse rapoarte științifice au indicat că metaboliții secundari de plante joacă un rol semnificativ în prevenirea stresului oxidativ și a efectelor nocive ale acestuia [13,14,31]Chiar dacă biodisponibilitatea este un parametru important care afectează bioactivitatea acestor compuși, nu a fost luată în considerare în majoritatea studiilor. Cu toate acestea, este bine cunoscut faptul că metaboliții secundari sunt supuși transformărilor structurale din cauza diferitelor condiții de pH, activități enzimatice și temperatură corporală în sistemul gastrointestinal. În plus, caracteristicile chimice ale metaboliților secundari, cum ar fi greutatea moleculară, polaritatea și gradul de legare la macromolecule din matricea plantei sunt, de asemenea, factori semnificativi care afectează biodisponibilitatea acestora [13]. În consecință, absorbția compușilor sau a metaboliților acestora în fluxul sanguin odată ingerați este esențială pentru a-și exercita efectele fiziologice sistemice. Modelele de simulare a digestiei in vitro pot furniza dovezi pentru evaluarea posibilelor caracteristici de biodisponibilitate ale substanțelor. În timp ce confirmarea în studiile pe oameni este necesară pentru a revendica orice proprietate funcțională, modelele de simulare in vitro sunt utilizate pe scară largă ca alternative la studiile in vivo sau la studiile pe oameni, care sunt adesea discutabile din punct de vedere etic, consumatoare de resurse, costisitoare și consumatoare de timp [32].

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Mai mulți cercetători au investigat și potențialul antioxidant al extractelor preparate din diferite organe ale speciilor Cistus. Potrivit studiului de literatură, acesta este primul studiu asupra speciilor de Cistus privind biodisponibilitatea substanțelor fenolice și impactul acestora asupra activității antioxidante prin utilizarea unui model de simulare a digestiei in vitro. Karas și colab. [33] au sugerat că 10% dintre componentele polifenolice rămân nedigerate în matricea plantei și 90% dintre ele sunt supuse digestiei în faza gastrică sau intestinală (aproximativ 48% și, respectiv, 52%). După cum sa menționat mai devreme, toate cantitățile fenolice din extractele apoase au fost afectate negativ de procedura de simulare a digestiei umane in vitro. Astfel, au fost detectate pierderi semnificative în conținutul fenolic al probelor biodisponibile din toate extractele. Mai mult, concentrațiile totale de proantocianidină ale probelor de IN au fost sub limita de detectare în toate extractele apoase. Diverse studii au determinat, de asemenea, influența negativă a procedurii de digestie asupra compușilor fenolici din extractele de plante și, prin urmare, asupra bioactivităților asociate. De exemplu, am raportat conținutul total de fenolici al Salvia virgata Jacq. a fost, de asemenea, afectată negativ de procedura de digestie în studiul nostru anterior. În plus, cantitățile de metaboliți majori ai extractului, adică rutina și acidul rosmarinic, au avut tendința de a scădea [13]. În schimb, mai multe studii au raportat rezultate contradictorii. În studiul lui Celeb și colab. [34], ei au observat creșterea cantităților totale de acid fenolic, flavonoid și fenolic în probele biodisponibile de extract metanolic din Hypericum perfoliatum L. De fapt, principalii metaboliți, quercitrina, acidul clorogenic și acidul galic, aveau rate de bioaccesibilitate de peste 100. la sută. Aceste studii au arătat că efectele procedurii de digestie pot varia în funcție de materialele vegetale. Pentru a clarifica aceste diferențe, este esențial să se ia în considerare mecanismul de acțiune al sistemului de digestie asupra substanțelor fenolice. (beneficiile bioflavonoidelor) Serra și colab.[35] a sugerat că compușii fenolici se găsesc în principal în glicozide, polimeri și forme esterice din matricea plantei și sunt hidrolizați în sistemul digestiv înainte de absorbție. Diferiți factori pot influența transformările structurale ale compușilor fenolici din tractul gastrointestinal. De exemplu, compușii cu greutăți moleculare mai mari, cum ar fi proantocianidinele sau procianidinele, trebuie să fie hidrolizați înainte de absorbția în intestin. Structura matricei plantei este, de asemenea, un factor proeminent în biodisponibilitatea substanțelor fenolice; (cumpara cistancheCompușii fenolici se pot lega de macromoleculele din matricea plantelor, cum ar fi fibrele, proteinele și moleculele de lipide. Astfel, numai componentele fenolice eliberate din matrice pot deveni absorbabile din tractul gastrointestinal. Mai mult, diferitele valori ale pH-ului și acțiunile enzimatice ale microbiotei intestinale sunt printre alți factori cruciali care afectează transformarea în structura chimică a compușilor fenolici [36]. În lumina acestor date, putem formula ipoteza că rezultatele diferite obținute din tipuri similare de studii experimentale se pot datora complexității sistemului de digestie și compoziției matricei plantei. Așa cum este prezentat în Tabelul 3, probele biodisponibile de extracte de Cistus au prezentat o activitate antioxidantă mai slabă decât omologii nedigerați și post-gastric datorită conținutului lor fenolic mai scăzut.

Cistanchepoate saîmbunătățește imunitatea

În plus, ambele extracte de C.saluifolius au prezentat o activitate antioxidantă mai bună în testele DPPH, CUPRAC, FRAP și TOAC în comparație cu alte specii. În plus, ambele extracte de C.paroifforus au prezentat o activitate mai mare de captare a radicalilor DMPD decât extractele altor specii. După cum este indicat în Tabelul 1, conținutul total de fenolici, flavonoide și acid fenolic din C. salviifolius a fost mai mare decât în ​​celelalte probe. Astfel, potențialul antioxidant mai mare al extractelor de C. salviifolius poate fi legat de conținutul său fenolic.

Mai mult, reducerea potențialelor antioxidante, activitățile inhibitorii asupra enzimelor legate de carbohidrați și AGE-urile probelor biodisponibile pot fi legate de scăderea glicozidelor flavonoide marker. Cu toate acestea, extractele de Cistus conțineau și alte substanțe fenolice, așa cum este indicat în Figura 1. Prin urmare, este necesară o analiză cromatografică detaliată a extractelor pentru a monitoriza influența digestiei asupra activității biologice.

Potențialul inhibitor al extractelor de plante asupra enzimelor digestive a atras recent mai multă atenție din cauza preocupării de siguranță a inhibitorilor sintetici. Prin urmare, efectul inhibitor al extractelor de plante a fost determinat în mai multe studii, iar acest efect a fost asociat în general cu substanțe fenolice precum flavonoide, acizi fenolici, proantocianidine etc. Sun et al. [37] au sugerat că compușii polifenolici își manifestă efectele inhibitoare prin legarea cu enzimele menționate mai sus cu ajutorul forțelor hidrofobe și a legăturilor necovalente. Prin urmare, inhibarea activității enzimelor o-amilazei și a-glucozidazei de către polifenoli este legată de structurile lor moleculare. În timp ce acest mecanism de interacțiune a fost studiat folosind diferite tehnici, cum ar fi cinetica de inhibiție, andocare moleculară, stingerea fluorescenței etc., nu a fost încă obținută o concluzie sigură [38]. Cu toate acestea, numeroase studii au raportat că inhibițiile enzimelor digestive ale extractelor de plante sunt direct legate de conținutul lor fenolic. Studii similare privind activitățile de inhibiție a enzimelor ale speciilor Cistus au fost, de asemenea, raportate anterior. Sayah și colab. [39] a investigat activitățile inhibitoare ale -amilazei și -glucozidazei ale extractelor metanolice și apoase de 8{{10}} procente din C. monspeliensis și C. saluifolius. Rezultatele lor au fost în conformitate cu studiul de față, dezvăluind că extractul apos de C. salvifolius a demonstrat o-glucozidază (ICso ug/mL:0.95±{0.14) și -amilază (IC5{) {55}} ug/mL:217,1±0,15)activitate inhibitorie decât extractul apos de C. monspeliensis (IC50 ug/mL∶ 14,58±1,26) și respectiv （IC50 4g/mL:886,10±0,10), respectiv Ratele de inhibiție ale ambelor extracte apoase asupra acestor enzime au fost mai mari decât acarboza compusului de referință (ICso ug/mL:18,01±2.00) Similar studiului nostru, ei au găsit o corelație cu ratele de inhibiție a enzimei și totalul cantități fenolice și flavonoide. Atât conținutul total de fenolici, cât și conținutul total de flavonoide ale extractului apos de C. saloijfolius (408,43±1,09 mg GAE și, respectiv, 140,00±1,15 RE) au fost mai mari decât extractul apos de C.monspeliensis (261,76±1,9 mg GAE și 78.00±1,15 RE respectiv). Orhan şi colab. [40] a investigat, de asemenea, potențialele inhibitoare ale enzimelor digestive ale extractelor apoase și etanolice de 80% din frunzele de C.laurifolius. Conform rezultatelor lor, extractul etanolic de 80% (71,7% ± 0,6) a prezentat o activitate puternică inhibitoare a amilazei în comparație cu extractul apos (39,3% ± 2,2) la o concentrație de 1 mg/mL. Ei au sugerat că compușii fenolici, în special flavonoidele, afectează direct secreția de insulină, prevenind apoptoza celulelor beta și susținând activitatea anti-diabetică. Această ipoteză, corelată cu rezultatele noastre, evidențiază că eșantionul ND de extracte apoase de C. salviifolius a exercitat cel mai mare conținut total de flavonoide și fenolice și cea mai mare activitate inhibitoare a amilazei și o-glucozidazei. După cum este prezentat în Tabelul 4, extractul apos de C. salviifolius a prezentat activități inhibitorii mai bune asupra enzimelor digestive decât celelalte extracte. În plus, probele IN ale extractelor apoase au conținut cantități mai mici de fenolici și flavonoizi decât probele ND și, astfel, au evidențiat activități de inhibiție a enzimelor mai scăzute în lucrarea de față. În timp ce conținutul fenolic al extractelor a fost afectat negativ de procedura de digestie, ele au încă prezentat o activitate inhibitorie semnificativă a enzimelor digestive. În mai multe studii, glicozidele flavonoide au fost raportate ca metaboliți majori ai extractelor de plante cu potențial puternic inhibitor al -amilazei și -glucozidazei[41-43]Deși mecanismul inhibitor al compușilor fenolici asupra enzimelor digestive nu a fost încă dezvăluit, structura- au fost efectuate studii privind relațiile de activitate asupra unor componente fenolice, cum ar fi flavonoidele, acizii fenolici, proantocianidinele și taninurile. Studiile privind relația structură-activitate despre flavonoide au arătat că legătura dublă C2=C3 a inelului C îmbunătățește potențialul de inhibare a enzimelor digestive al unor astfel de compuși. Deoarece această legătură crește densitatea electronilor, puterea interacțiunii dintre flavonoid și enzimă este crescută [44]. În plus, grupările hidroxil de pe C-5 și C{-7 facilitează potențialul de inhibiție a amilazei al flavonoidelor. S-a sugerat, de asemenea, că hidroxilarea scheletului flavonoidelor afectează pozitiv potențialul lor inhibitor al enzimelor a-amilazei și -glucozidazei[45]. După cum s-a indicat mai devreme, toate flavonoidele marker din studiul de față au fost glicozide flavonolice care poartă aceste cerințe structurale descrise mai sus. Cu toate acestea, după procedura de digestie in vitro, activitățile lor asociate au scăzut semnificativ în probele biodisponibile ale extractelor apoase.

În general, potențialul inhibitor al extractelor de plante asupra AGE este legat de mai mulți factori, adică conținutul fenolic al acestora, potențialul antioxidant, capacitățile de chelare a metalelor, interacțiunile proteice și activitățile de blocare a receptorilor AGE [13]. Așa cum este prezentat în Tabelul 4, probele biodisponibile ale extractelor apoase au prezentat activități inhibitoare AGE mai scăzute în comparație cu probele ND, deoarece procedura de digestie in vitro a afectat negativ conținutul de fenolici al extractelor. Conform rezultatelor studiului actual, proba ND de extract apos de C. (cistanche și tongkat ali reddit) saluifolius a avut cea mai mare activitate inhibitoare a AGE, precum și conținutul total de fenolici și flavonoizi. În comparație, eșantionul IN de extract apos de C. monspeliensis a arătat cel mai slab potențial de inhibare a AGE, care poate fi atribuit conținutului total de flavonoide și fenolice cel mai scăzut. Deoarece flavonoidele au o distribuție pe scară largă în extracte de plante, fructe, legume și băuturi, mai multe studii s-au intensificat asupra potențialului de inhibiție al flavonoidelor asupra formațiunilor AGE. Aceleași flavonoide atribuite ca marker fenolici în acest studiu au fost, de asemenea, raportate drept compuși marker în alte studii[46-48].

Similar cu inhibarea enzimelor digestive, activitățile de inhibiție a AGE ale flavonoidelor au fost stimulate de legătura dublă C2=C3 și hidroxilarea inelelor A și C. Cu toate acestea, atașarea zahărului de scheletul flavonoid duce la scăderea activității inhibitorii [49]. Pe de altă parte, Cervantes-Lauren et al.[50] a sugerat că flavon-3-glicozidelor posedă un potențial de inhibare a AGE mai mare decât celelalte glicozide flavonoide. Această ipoteză poate fi o explicație pentru scăderea inhibării AGE în probele biodisponibile. De exemplu, quercitrina și hiperozida nu au fost detectate în probele biodisponibile ale extractului apos de C. monspeliensis, ceea ce este motivul activității mai scăzute a probelor de IN de C. monspeliensis în comparație cu extractele de la alte specii. Chiar dacă quercitrina nu a fost detectată în extractul apos de C. saloifolius, cantități semnificativ mai mari de hiperozidă și salidrozidă pot fi cauza activității sale mari de inhibare a AGE. În general, s-a observat o corelație pozitivă între conținutul de flavonoizi marker al probelor și potențialul inhibitor al acestora asupra AGE.

4. Material și Metode

4.1.Produse chimice

Toate referințele, enzimele și substanțele chimice folosite în experimente au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SUA). În experimente au fost utilizate materiale de calitate analitică.

4.2.Probe de plante

Părți aeriene de C.creticus și C.saloifolius au fost adunate din campusul Universității Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) în ultima săptămână din aprilie 2018. Părți aeriene de C.mon-speliensis și C. paroiflorus au fost adunate din apropierea Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir în a doua săptămână a lunii mai 2018. Părți aeriene de C. laurifolius au fost colectate de pe drumul Kemer-Doganhisar, Konya, în prima săptămână a lunii iunie 2018. Prof. dr. Erdem Yesilada a autentificat materiale vegetale. Exemplarele voucher pentru C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium(YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroiflorus(YEF18016) și C.salvifolius (YEF18014) au fost depozitate la Herbarul Departamentului de Farmacognozie, Facultatea de Farmacie de Farmacie, Universitatea Yeditepe, Istanbul, Turcia. 4.3.Procedura de extragere

Extracția apoasă a fost aleasă deoarece este folosită în mod obișnuit ca tehnică de preparare în medicina tradițională. Părțile aeriene grosier uscate la aer și pulbere ale speciei Cistus (100 g) au fost extrase cu apă distilată fierbinte (80 grade, 1,5 L) folosind un dispozitiv de agitare timp de 15 min. Apoi, extractele apoase au fost filtrate printr-o hârtie de filtru și evaporate la sec sub presiune redusă. După finalizarea procedurii de liofilizare, extractele au fost dizolvate în apă distilată pentru prelucrare ulterioară (probă nedigerată: ND) (randamentul de extracte: 13,04% pentru C.creticus, 15,7% pentru C.laurifolus, 12,8% pentru C.monspeliensis). ,14,94 la sută pentru C.parviflorus, 14,74 la sută pentru C. salvifolius). 4.4.Metoda de simulare a digestiei umane in vitro

Modelul de simulare a digestiei umane a fost aplicat probelor de Cistus in vitro, urmând metoda detaliată mai devreme de Celeb și colab.[34]. În primul rând, 1 g NaCl și 1,6 g pepsină au fost dizolvate în 500 mL de apă distilată pentru a obține o soluție de fluid gastric simulat (SGF). Ulterior, pH-ul soluției de SGF a fost aranjat la 2 cu HCI (5 M); 17,5 mL din această soluție a fost amestecat cu 2,5 ml de probe de plante, iar acest amestec a fost situat în baia de apă agitată la 37 de grade timp de 2 ore pentru a imita mișcările peristaltice ale sistemului de digestie. După 2 ore, probele au fost puse într-o baie de gheață pentru a inactiva reacțiile enzimatice; 2 ml din probe au fost puse deoparte ca probă „post-gastrică” (PG) pentru experimente ulterioare. O membrană de dializă celulozică încărcată cu o cantitate adecvată de NaHC03 (1 M, pH7) a fost localizată în soluțiile de probă rece; astfel, absorbția gastrointestinală a fost imitată. Apoi, 4,5 ml de soluție de acizi biliari/pancreatină au fost combinați cu soluțiile și amestecul a fost incubat încă 2 ore la 37 de grade. În cele din urmă, fluidul din interiorul membranei de dializă a fost achiziționat ca probă „biodisponibilă” (IN). După terminarea procedurii, toate probele au fost păstrate la grade -20 pentru experimente ulterioare. 4.5. Estimarea in vitro a profilului fenolic 4.5.1. Analiza conținutului fenolic total Determinarea spectrofotometrică a conținutului fenolic total al probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri conform metodei detaliate mai devreme de Barak și colab.【32】;75 uL de NagCO3（20% în H2O ） a fost adăugat la 20 μL de probă proaspăt preparată și soluții de referință. Apoi, 100 μL de reactiv Folin-Ciocalteu au fost combinați cu amestecul. După o perioadă de incubare de 30 de minute la temperatura camerei în întuneric, absorbanța a fost măsurată la 690 nm. Acidul galic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a stabili o curbă de calibrare și conținutul total de fenolici a fost exprimat ca echivalenți de acid galic (GAE). 4.5.2. Analiza conținutului total de flavonoide Determinarea spectrofotometrică a conținutului total de flavonoide al probelor a fost gestionată într-un șablon de placă de 96-godeuri în conformitate cu metoda explicată anterior de Bardakci și colab. 【51】; 150 μL de etanol 75 la sută, 10 μL de clorură de aluminiu și 10 uL de acetat de sodiu 1M trihidrat au fost combinate cu 50 uL de probă și soluții de referință, separat. Apoi, aceste amestecuri au fost incubate la temperatura camerei întunecate timp de 30 de minute. După perioada de incubare, absorbanța a fost calculată la 405 nm. Quercetina a fost folosită ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a stabili o curbă de calibrare și conținutul total de flavonoide a fost reprezentat ca echivalenți de quercetină (QE).

4.5.3. Testul conținutului total de acid fenolic

Conținutul total de acid fenolic al probelor a fost măsurat spectrofotometric urmând procedura raportată anterior de Barak și colab. [52]. În primul rând, s-au dizolvat cantități adecvate de nitrit de sodiu și molibdat de sodiu în apă distilată pentru a obține reactivul Arnow. Apoi, 1 ml de probe a fost combinat cu 1 ml de reactiv Arnow, 1 ml de 0.1 M HCI și 1 ml de 1 M NaOH, separat. După aceea, volumul amestecului a fost ajustat la 10 ml cu apă distilată, iar absorbanța a fost citită imediat la 490 nm. Acidul cafeic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare, iar conținutul total de acid fenolic a fost dat ca echivalenți de acid cafeic (CAE).

4.5.4. Testul conținutului total de proantocianidină

Determinarea spectrofotometrică a conținutului total de proantocianidină al probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând metoda lui Barak și colab. [11]. Pe scurt, 25 uL de soluții de probă au fost amestecate cu 150 uL de 4% vanilină și, respectiv, 75 uL de soluții de HCI (32%). După 15 minute timp de incubare la temperatura camerei întunecate, absorbanța a fost ajustată la 492 nm. Catechină hidrat a fost utilizat ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Metanolul a fost folosit ca soluție de control. Conținutul total de proantocianidină al probelor a fost declarat ca echivalenți de catechine (CE).

4.6. Teste de activitate de eliminare a radicalilor liberi 4.6.1. Testul de activitate de eliminare a radicalilor DPPH

Activitatea de captare a radicalilor DPPH a probelor a fost determinată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând metoda modificată de Celeb și colab.[53]. La început, 150 uM de soluție de DPPH a fost proaspăt preparată. Apoi, 200 μL de soluție de DPPH au fost amestecați cu 25 uL de soluții de probă. Apoi, acest amestec a fost incubat la temperatura camerei întunecate timp de 50 de minute. Absorbanța a fost calculată la 540 nm. Hidroxitoluenul butilat (BHT) a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații. Metanolul a fost folosit ca soluție de control. Activitatea probelor a fost prezentată ca EC50, corespunzătoare concentrației care prezintă activitate de 50 la sută.

4.6.2.DMPD Testul activității de eliminare a radicalilor

Activitatea de captare a radicalilor DMPD* (N,N-dimetil-p-fenilendiamină) a probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri conform metodei descrise mai devreme de Inan și colab. [13]. În primul rând, 10{{10}} mM DMPD plus soluție, 0,05 M FeCl; Soluție 6H2O și tampon acetat 0,01 M au fost proaspăt preparate. Apoi, s-au amestecat 1 ml de soluție de DMPD, 100 ml de tampon acetat și 0,2 ml de soluție de FeCl3-6H2O, iar mai târziu 15 uLof soluții de probă au fost combinate cu 210 μL din acest amestec. După perioada de incubare la temperatura camerei întunecate timp de 50 de minute, absorbanța a fost măsurată la 492 nm. Trolox a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Concentrațiile soluțiilor de probă au fost de 1 mg/mL. Activitățile de captare a radicalilor DMPD ale probelor au fost declarate ca echivalenți Trolox (TE). 4.7.Teste de activitate de reducere a metalelor

4.7.1. Testul de reducere a puterii antioxidante ferice (FRAP)

Determinarea activității FRAP a probelor a fost realizată într-un șablon de placă cu 96 de godeuri urmând procedura raportată mai devreme de Bardakci și colab.[54]. La începutul experimentului, reactivul FRAP a fost format prin amestecarea soluțiilor tampon de acetat, feric-tripiridiltriazină și FeCl;6H2O. După aceea, reactivul FRAP a fost introdus în cuptorul de 37 de grade timp de 30 min. Apoi, 10 uL de soluții de probă au fost combinate cu 30 uL de apă distilată și, respectiv, 260 uL de reactiv FRAP. După timpul de incubare la 37 de grade timp de 30 min, absorbanța a fost ajustată la 593 nm. O curbă standard a fost construită prin utilizarea diferitelor molarități de soluție de sulfat feros (0,25-2 mM) pentru a evalua rezultatele. BHT a fost utilizat ca soluție de referință la diferite concentrații. Activitățile FRAP ale probelor au fost prezentate ca mM FeSO4 în 1 g extract uscat.

4.7.2. Testul capacității de reducere a cupridei (CUPRAC)

Activitatea CUPRAC a probelor a fost determinată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând metoda modificată de Celeb și colab. 【31】; 85 μL de CuSO4 （10 mM）, neocupraină și soluții de acetat de amoniu și 51 uL de apă distilată au fost adăugate la 43 uL de soluții de probă, separat. După o perioadă de incubare (20 min) la 50 de grade într-o baie de apă, absorbanța a fost măsurată la 450 nm. Acidul ascorbic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Activitățile CUPRAC ale probelor au fost prezentate ca echivalenți de acid ascorbic (AAE). 4.8. Testul activității antioxidante totale (TOAC)

Determinarea activității antioxidante totale a probelor a fost efectuată într-un șablon de placă de 96-godeuri urmând procedura de Celeb și colab. [55]. La început, o anumită cantitate de fosfat de sodiu monobazic, molibdat de amoniu tetrahidrat și acid sulfuric a fost amestecată pentru a obține soluția TOAC. Apoi, s-au adăugat 300 μL de soluție TOAC la 30 uL de soluții de probă. După perioada de incubare la 95 de grade într-o baie de apă timp de 90 min, absorbanța a fost determinată la 690 nm. Acidul ascorbic a fost folosit ca soluție de referință la diferite concentrații pentru a obține o curbă de calibrare. Activitățile TOAC ale probelor au fost reprezentate ca echivalenți de acid ascorbic (AAE). 4.9.Estimarea indicelui de biodisponibilitate

Indicele de biodisponibilitate (BAvI) a fost calculat conform ecuației teoretice descrise de Inan și colab.[13]:

BAVI=CIN/CND „Indicele de biodisponibilitate” (BAvI) a fost descris ca raportul dintre numărul de substanțe fenolice din proba biodisponibilă (IN) și cel din proba nedigerată (ND). 4.10. Cuantificarea markerului de flavonoide prin HPTLC

Determinarea cantitativă a concentrațiilor de salidrozidă, hiperozidă și quercitrină în toate probele de simulare (ND, PG, IN) ale extractelor apoase din speciile Cistus a fost efectuată prin cromatografie în strat subțire de înaltă performanță (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Elveția) urmând metoda validată de Guzelmeric et al. [16]. Hiperozidă, salidrozidă și quercitrină au fost preparate în concentrații de 25,50 și 10{{{3{0}} ug/mL, iar concentrațiile soluțiilor de probă proaspăt preparate au fost ajustate la 10 mg/ml. Aceste soluții au fost aplicate pe plăci de silicagel cu suport de sticlă în fază normală (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Germania) cu anumite volume (1-5 μL soluții standard și 5 μL soluții de probă) folosind seringi de 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, Elveția）. Procedura de aplicare a fost efectuată cu aplicatorul de probă Linomat 5. Procesul de dezvoltare a fost efectuat în Camera de Dezvoltare Automatizată (ADC 2) și acetat de etil: diclormetan. acid acetic. acid formic: apă (10:25:10) :10:10:10me) a fost selectat ca fază mobilă. Apoi, plăcile au fost derivatizate cu reactiv produs natural (NPR) (1 g ester aminoetil al acidului difenilboric 2-în 200 ml de acetat de etil) în dispozitivul de imersie (CAMAG) În timp ce hiperozidă și quercitrină au fost analizate spectrofotometric la 260 nm, cantitatea de salidrozidă a fost măsurată la 330 nm cu un scaner UV. Valorile Rf ale standardelor au fost determinate ca hiperozidă (≈0,35), quercitrină ⼈c0,45) 0,65）.Coeficienții de corelație (r²) au fost găsiți ca fie ×0,98 pentru cuantificarea flavonoidelor marker.

4.11.Activitatea inhibitorie asupra enzimelor asociate diabetului 4.11.1. -Activitate inhibitoare a glucozidazei

-Activitățile inhibitoare de glucozidază ale probelor nedigerate și biodisponibile obținute din extractele apoase din speciile Cistus au fost examinate urmând metoda explicată mai devreme de Balan și colab. [56]. În primul rând, cantitățile adecvate de fosfat monosodic și fosfat disodic au fost amestecate cu obținerea de tampon fosfat de 10{0 mM (pH7). enzima ac glucozidază a fost dizolvată în tampon fosfat pentru a obține soluția de -glucozidază （0.2U/mL）. Apoi 170 uL de tampon fosfat, 20 μL de soluție de -glucozidază și 20 μL de soluții de probă au fost combinate și incubate într-un cuptor de 37 de grade timp de 15 minute. După aceea, la amestec s-au adăugat 20 uL de soluție de p-nitrofenil- -D-glucopiranozidă 2,5 mM în tampon fosfat de potasiu 100 mM (pH7,0) și a fost executată o altă perioadă de incubare la 37 de grade timp de 15 minute. Apoi, 80 μL de soluție de carbonat de sodiu 0,2 M au fost atașați la amestec pentru a termina reacția. Absorbanța a fost măsurată la 405 nm. Soluția de quercetină la diferite concentrații a fost folosită ca referință. Rezultatele au fost estimate ca procent de activitate inhibitorie în concentrații de 1 mg/mL și 0,5 mg/mL de probe ND și IN din extractele apoase din speciile Cistus.

4.11.2. -Activitate inhibitoare a amilazei

-activitatea inhibitoare a amilazei a probelor nedigerate și biodisponibile obținute din extractele apoase din speciile Cistus a fost determinată urmând procedura detaliată anterior de Balan și colab.[56]. Determinarea spectrofotometrică a activităților inhibitoare de a-amilază a probelor a fost efectuată prin utilizarea reactivului DNS (acid 3,5-dinitrosalicilic). După cum se precizează în metodă, maltoza se formează din conversia amidonului, iar culoarea galbenă a DNS alcalin este transformată în culoarea portocalie-roșu datorită maltozei produse din amidon. Astfel, s-a preparat soluție de DNS 96 mM din amestecul de soluție de tartrat de sodiu și potasiu (dizolvat în NaOH 2 M) și o anumită cantitate de DNS (dizolvat în apă distilată). Apoi, 20mM tampon fosfat de sodiu cu 6,7 mM NaCI (cofactor al enzimei a-amilazei) a fost preparat la 20 de grade (pH: 6,9). enzima a-amilaza (1U/mL) și amidonul (10 mg/mL) au fost dizolvate în acest tampon. După aceea, 50 μL de tampon fosfat de sodiu și 10 μL de soluție de enzimă a-amilază au fost amestecate cu 20 μL de soluții de probă. Acest amestec a fost incubat la 37 de grade timp de 45 min. După perioada de incubare, la amestec s-au adăugat 20 μL de soluție de amidon. O altă perioadă de incubație a fost începută la 37 de grade timp de 45 de minute. Aceeași procedură a fost aplicată probelor fără adăugarea unei soluții de enzimă o-amilază numită „sample background”. Grupul de control a fost studiat cu aceeași procedură în absența soluțiilor de probă. Absorbanța a fost măsurată la 540 nm. Acarboza a fost utilizată ca soluție de referință la diferite concentrații. Rezultatele au fost prezentate ca procent al activității inhibitorii în concentrații de 1 mg/mL și 0,5 mg/mL de probe ND și IN din extracte apoase din speciile Cistus. 4.11.3.Activitatea inhibitorie a vârstei

Activitatea inhibitoare a AGE a probelor nedigerate și biodisponibile din extracte apoase din speciile Cistus a fost determinată urmând metoda descrisă de Starow-icz și colab. [57]. Înainte de orice proces, concentrațiile de 1 mg/mL și 0,5 mg/mL ale probelor ND și IN au fost proaspăt preparate. Apoi, 1 mL de concentrație de 10 mg/mL de soluție de albumină serică bovină (BSA) a fost adăugat la 1 mL de soluții de probă ND și IN. Probele de control au fost preparate fără adăugarea de soluții de probă ND și IN, iar probele martor au fost preparate fără adăugarea de glucoză 0,5 M. Apoi, toate probele preparate au fost incubate timp de 40 de ore într-o baie de apă agitată la 55 de grade. După ce perioada de incubare s-a încheiat, cititorul de microplăci multimod Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX a fost utilizat în intervalul de excitație de 370 nm/emisie de 440 nm pentru a calcula intensitatea fluorescenței. Quercetina a fost folosită ca soluție de referință la diferite concentrații.

5. Concluzii

În studiul de față, extractele apoase din toate speciile de Cistus înregistrate în flora turcească au fost investigate pentru profilurile fenolice și potențialul antioxidant și antidiabetic in vitro. Deoarece decoctul sau infuzia este forma comună în medicamentele tradiționale, utilizarea extractelor apoase pentru evaluarea activității în studiile experimentale este deosebit de importantă. Pe de altă parte, constituenții hidrofili din extractul apos sunt supuși unei serii de transformări metabolice în sistemul gastrointestinal odată ingerați. Prin urmare, pentru evaluarea corectă a activității formulărilor tradiționale, trebuie investigate și activitățile metaboliților biodisponibili.

This is the first study to examine the consequences of the in vitro human digestion simulation method on Turkish Cistus species. In addition, the inhibition potential of Turkish Cistus species on AGEs was studied in this study for the first time. Furthermore, salidroside, hyperoside, and quercitrin were assigned marker flavonoids, and alterations in their concentrations were monitored in the in vitro digestion procedure. While phenolic contents and antidiabetic and antioxidant activities of the extracts were negatively affected by gastrointestinal digestion procedures, they still exhibited significant bioactivity. According to the results, C. salviifolius extract was detected as the most potent plant in terms of phenolic content and antioxidant and anti-diabetic activities. In conclusion, aerial parts from Turkish Cistus species have rich phenolic contents and potential antioxidant and anti-diabetic activities. While the in vitro digestion simulation method was employed to evaluate bioavailability, it might not fully mimic the metabolic pathways occurring in the organism. Therefore, further in vivo and clinical studies are required to assess the bioavailability of the phenolic compounds and their contribution to the reported pharmacological effects in detail.

Contribuții ale autorului:Conceptualizare, YI, EC, EY; metodologie, YI, SA, IK, analiza formală CE, YI, IK.-C., SA; ancheta, YI, IK.-C, SA; resurse, YI, IK.SA, EC și EY; curatarea datelor, YI, IK-C., SA; scriere-—YI, scriere—revizuire și editare, YI, EC, EY; vizualizare, YI; supraveghere, EC și EY Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:Această cercetare nu a primit finanțare externă. Declarația Comitetului de revizuire instituțională: Nu se aplică. Declarație de consimțământ informat: Nu se aplică.

Declarație de disponibilitate a datelor:Datele prezentate în acest studiu sunt disponibile la cererea autorului corespunzător.

Conflicte de interes:Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Disponibilitatea eșantionului:Probele de compuși nu sunt disponibile de la autori.

Acest articol este extras din Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules