Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao , Hsin-Wen Huang , Hui-Chi Huang , Hsin-Fan Chao , Shuen-Wen Yu , Muh-Hwan Su , Chao-Jih Wang și Hang-Ching Lin

Abstract

Cistanche tubulosa extract apos(CTE) este deja folosit ca medicament botanic pe bază de rețetă pentru tratarea demenței în China. Studiile noastre anterioare au raportat că glicozidele feniletanoide ale CTE(Cistanche tubulosa extract apos) au activitate anti-boala Alzheimer (AD) prin inhibarea agregării și depunerii peptidei amiloid (A). Cu toate acestea, studii recente au considerat că glicozidele feniletanoide pot fi metabolizate de bacteriile intestinale deoarece toate rezultatele analizelor au arătat că biodisponibilitatea glicozidelor feniletanoide este extrem de scăzută. În acest studiu, demonstrăm modul în care chelarea fierului joacă un rol crucial în mecanismul de inhibare a agregării și depunerii A aglicozide feniletanoidede CTE(Cistanche tubulosa extract apos). În plus, am demonstrat în continuare că glicozidele feniletanoide (1-3) pot ajunge la creier. CTE activ(Cistanche tubulosa extract apos)confirmarea componentelor și a mecanismului de acțiune va fi de mare ajutor pentru controlul calității produselor și studiile de biodisponibilitate în viitor. În același timp, oferim o nouă metodă de analiză utilă în determinarea glicozidelor feniletanoide (1–3) în plante, alimente, sânge și țesuturi pentru amprenta chimică și cercetarea farmacocinetică.

Cuvinte cheie: Cistanche tubulosa; glicozide feniletanoide; Boala Alzheimer; chelarea fierului

Cistanche tubulosa

1. Introducere

Demența este una dintre cele mai frecvente boli cronice de îmbătrânire. În 2015, Raportul Mondial Alzheimer a estimat că aproximativ 46,8 milioane de oameni sufereau de demență, iar numărul este de așteptat să fie de 74,7 milioane în 2030 și de 131,5 milioane în 2050 [1]. Populația globală cu demență va crește an de an și va deveni scăpată de sub control în viitor. Cheltuielile globale de asistență medicală pentru tratarea demenței au fost de aproape 604 miliarde de dolari SUA în 2010, iar suma este de așteptat să fie de 1000 de miliarde în 2030 [2]. Pacienții cu demență au un risc mai mare de deces accidental [3] și, prin urmare, necesită mai multă îngrijire medicală. Aceasta este o povară grea pentru îngrijitorii familiali ai pacienților cu demență. Impactul demenței asupra îngrijitorilor, familiei și societății poate produce un mare stres fizic, psihologic, de viață și economic. Există două forme majore de demență, boala Alzheimer (AD) și demența vasculară [4,5]. AD este cea mai frecventă demență și este o tulburare neurodegenerativă ireversibilă și progresivă [4-6]. AD a fost a șasea cauză de deces în Statele Unite în 2015 [6].

Studii recente susțin că toxicitatea neuronului indusă de agregarea peptidei amiloid (A) (plăci) și a proteinei tau (încurcături) este strâns legată de patogeneza AD. Acumularea de A și proteine ​​​​tau în creier poate duce la deteriorarea neuronilor și pierderea memoriei [7]. Oligomerii A insolubili se agregează în plăcile extracelulare și s-a raportat că duc la disfuncție sinaptică, toxicitate neuronală și moarte celulară [8]. Din păcate, până acum nu există un tratament eficient disponibil pentru a curăța A și proteina tau, sau pentru a inhiba formarea sau oligomerizarea lui A și pentru a suspenda sau vindeca leziunile ireversibile ale neuronilor. Agenții terapeutici actuali, cum ar fi galantamina și donepezilul, care sunt inhibitori de acetilcolinesterază, pot ameliora doar temporar pierderea memoriei prin creșterea nivelului de neurotransmițători. În 2012, niciun medicament candidat nu a reușit să reducă efectul A în studiile clinice mari ale pacienților cu AD [9]. Prin urmare, este nevoie urgentă de cercetare pentru un tratament nou pentru a suprima prevalența bolii Alzheimer. Ionii metalici au fost considerați recent un factor cheie strâns legat de agregarea A [10]. Chelatorii metalici considerați potențiali compuși de plumb oferă o strategie complet nouă pentru abordarea anti-AD [9,11-15].

Tulpina uscată de Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, este recoltată pe scară largă în deșertul Xinjiang, China. Este o medicină tradițională chineză importantă care aparține medicinei tonice chineze indexate în Farmacopeea Chinei și folosită de mii de ani pentru tratamentul slăbiciunii fizice, deficienței rinichilor, infertilității, uitarii, impotenței și constipației senile [16,17].Extract apos de Cistanche tubulosaCapsulele (CTE) au fost aprobate ca medicament botanic pentru demența vasculară în China. Conform unui studiu clinic pe 18 pacienți diagnosticați cu AD ușoară până la moderată, CTE(Cistanche tubulosa extract apos)capsulele au oferit pacienților o stare de memorie mai stabilă în comparație cu inhibitorii de acetilcolinesterază [18]. În studiul nostru anterior, CTE(Cistanche tubulosa extract apos)a scăzut depunerea de peptidă amiloid (A) și a îmbunătățit pierderea memoriei la șobolanii asemănători bolii Alzheimer [19]. Glicozidele feniletanoide, echinacozida (1), actozida (2) și izo-acteozida (3) sunt considerate componentele majore ale CTE(Cistanche tubulosa extract apos)[20]. Compusul 1 are activitate neuroprotectoare împotriva toxicității 1-metil-4-fenil{-1,2,3,6-tetrahidropiridinei (MPTP) [21], 1-metil -4-ionul de fenil piridinium (MPP plus ) [22] și 6-hidroxidopamină ({6-OHDA) [23]. Raportul nostru anterior a arătat că 1 a suprimat oligomerizarea și toxicitatea A într-un studiu in vitro și a inhibat depunerea A, îmbunătățind memoria afectată și disfuncția cognitivă la șobolanii induși de A [24]. Compușii 2 și 3 au crescut degradarea A și au scăzut oligomerizarea A in vitro [25]. Compusul 3 a scăzut depunerea A la șobolanii indus de A [25]. Pe baza acestor studii, C. tubulosa a demonstrat deja că are potențialul de a trata AD. CTE(Cistanche tubulosa extract apos)este strâns legată de agregarea și depunerea anti-A [24,25]. Pentru a înțelege mai bine CTE(Cistanche tubulosa extract apos)mecanism, trebuie să avem o metodă convenabilă și eficientă pentru a identifica componenta activă, precum și conținutul din probele de țesut cerebral. Majoritatea studiilor au fost concepute pentru determinarea cantitativă a echinacozidei, actozidei și izo-acteozidei din plante sau alimente prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) [26-28], dar numai două studii au fost pentru determinarea în ser sau țesuturi [29, 30]. Cu toate acestea, nu există niciun raport privind analiza simultană a 1-3 în țesuturile creierului după CTE(Cistanche tubulosa extract apos)administrare orală. În plus, nu este încă clar din studiile recente dacă CTE(Cistanche tubulosa extract apos)componentele active sau metaboliții acestora au trecut cu succes prin bariera hemato-encefalică și au acționat asupra neuronilor creierului. Prin urmare, această cercetare oferă o metodă avansată și sensibilă, cu dovezi convingătoare care ilustrează în mod clar mecanismul de bază al CTE.(Cistanche tubulosa extract apos)împotriva A agregarii şi depunerii.

Cistanche tubulosa extract apos

2. Rezultate

2.1. Izolarea și identificarea a trei compuși majori (1–3)

Tulpinile uscate de C. tubulosa au fost extrase cu 75% EtOH la temperatura camerei. Extractul condensat de 75% EtOH a fost supus cromatografiei pe rășină și pe coloană C18 pentru a furniza trei compuși majori, echinacozidă (1), actozidă (2) și izo-acteozidă (3). Structurile lor au fost elucidate prin analiza spectroscopiei RMN (Rezonanță Magnetică Nucleară) și ESI-MS (Masa de ionizare electrospray) și prin comparație cu datele din literatură [31-33] (Figura 1, Materiale suplimentare Figurile S3-S11).

2.2. Analiza conținutului de glicozide feniletanoide (1-3) de la CTE(Cistanche tubulosa extract apos)

Metoda de testare a fost validată pentru analiza glicozidelor feniletanoide. Compușii 1–3 (5,0 mg) au fost cântăriți cu precizie și amestecați cu 50 procente de metanol (40 ml). Amestecuri s-au sonicat timp de 5 min. Trei soluții standard de glicozide feniletanoide (1–3) au fost amestecate ca soluție stoc standard (100 µg/mL). Soluția stoc standard a fost utilizată pentru a prepara cinci concentrații diferite (5,10, 25, 50 și, respectiv, 100 pg/mL) ale soluțiilor indicate, prin diluarea cu volume în serie de 50% metanol. Curbele glicozidelor feniletanoide (1–3) au fost stabilite folosind cromatografie lichidă ultra-performanță (UPLC) de la 5–100 µg/mL și, respectiv, au fost liniare (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Precizia intra-zi și inter-zi [procent RSD (deviație standard relativă) a fost de la 0,1 la 1,8 la sută] și acuratețea (95,6–104,2 la sută) a fost acceptabilă de UPLC pentru 1–3. UPLC a cuantificat valorile 1, 2 și 3 ale CTE(Cistanche tubulosa extract apos)conținutul trebuie să fie de 254, 38 și, respectiv, 41 mg/g (Figura S2)

2.3. Validare UPLC/MS/MS

Glicozidele feniletanoide (1-3) au fost amestecate și adăugate cu omogenat de țesut cerebral de șobolan și analizate utilizând cromatografie lichidă ultra performantă-spectrometru de masă în tandem (UPLC/MS/MS) cu extracție în fază solidă. Limita inferioară de detecție (LLOQ) de 1–3 a fost de 0,2 ng/mL. Recuperarea glicozidelor feniletanoide a crescut cu omogenat de țesut cerebral (10 ng/mL) la 91,39% pentru 1, 89,54% pentru 2 și, respectiv, 96,81% pentru 3 (Figura 2).

2.4. Analiza țesuturilor creierului de șobolan asemănător AD

După 14 zile de CTE(Cistanche tubulosa extract apos)administrare orală (200 mg/kg/zi), țesuturile creierului de șobolan asemănător AD au fost colectate și împărțite în două părți, hipocamp și striat, și au fost ambele omogenizate [19]. Deoarece omogenate de hipocamp și striat de la fiecare șobolan au fost prea puține pentru a fi încărcate în extracția în fază solidă și pentru a evita erorile experimentale excesive, omogenatele de hipocamp și striat de la patru șobolani individuali au fost amestecate într-o probă analizată pentru UPLC/MS/MS folosind metoda de extracție în fază solidă (Figura 3A, B). Glicozidele feniletanoide (1-3) au fost observate în hipocamp (Figura 3A) și striat (Figura 3B). Nu a existat un vârf semnificativ în țesuturile cerebrale goale (Figura 3C). În hipocamp, conținutul de echinacozidă a fost de 11,97 ± {{20}}, 34 ng/mL, conținutul de aceozidă a fost de 1,25 ± 0,16 ng/mL și conținutul de izoacteozidă a fost de 1,38 ± 0,08 ng/ mL. În striat, conținutul de echinacozidă a fost de 22,60 ± 1,69 ng/mL, conținutul de aceozidă a fost de 2,03 ± 0,61 ng/mL și conținutul de izoacteozidă a fost de 4,90 ± 0,64 ng/mL. După cum se arată în Figura 4, CTE(Cistanche tubulosa extract apos)ar trece prin bariera hemato-encefalică în funcție de cantitățile semnificative detectabile de 1–3 în hipocamp și striat. Conținutul lui 1 este mult mai mare decât 2 și 3 în CTE(Cistanche tubulosa extract apos)prin analiza UPLC (Figura S2). Prin urmare, este rezonabil să observăm că 1 este cel mai mare din țesutul cerebral după CTE oral(Cistanche tubulosa extract apos)administrare. Molecule 2019, 24, x PENTRU EXAMINARE INTEGRALĂ 4 din 12 2.4. Analiza țesuturilor cerebrale de șobolan asemănătoare AD După 14 zile de CTE(Cistanche tubulosa extract apos)administrare orală (200 mg/kg/zi), țesuturile creierului de șobolan asemănător AD au fost colectate și împărțite în două părți, hipocamp și striat, și au fost ambele omogenizate [19]. Deoarece omogenate de hipocamp și striat de la fiecare șobolan au fost prea puține pentru a fi încărcate în extracția în fază solidă și pentru a evita erorile experimentale excesive, omogenatele de hipocamp și striat de la patru șobolani individuali au fost amestecate într-o probă analizată pentru UPLC/MS/MS folosind metoda de extracție în fază solidă (Figura 3A, B). Glicozidele feniletanoide (1-3) au fost observate în hipocamp (Figura 3A) și striat (Figura 3B). Nu a existat un vârf semnificativ în țesuturile cerebrale goale (Figura 3C). În hipocamp, conținutul de echinacozidă a fost de 11,97 ± {{20}}, 34 ng/mL, conținutul de aceozidă a fost de 1,25 ± 0,16 ng/mL și conținutul de izoacteozidă a fost de 1,38 ± 0,08 ng/ mL. În striat, conținutul de echinacozidă a fost de 22,60 ± 1,69 ng/mL, conținutul de aceozidă a fost de 2,03 ± 0,61 ng/mL și conținutul de izoacteozidă a fost de 4,90 ± 0,64 ng/mL. După cum se arată în Figura 4, CTE(Cistanche tubulosa extract apos)ar trece prin bariera hemato-encefalică în funcție de cantitățile semnificative detectabile de 1–3 în hipocamp și striat. Conținutul lui 1 este mult mai mare decât 2 și 3 în CTE(Cistanche tubulosa extract apos)prin analiza UPLC. Prin urmare, este rezonabil să observăm că 1 este cel mai mare din țesutul cerebral după CTE oral(Cistanche tubulosa extract apos)administrator.

2.5. Activitatea de chelare a metalelor glicozide feniletanoide (1-3).

În literatura de specialitate, determinarea compușilor liberi și a complexului lor metalic a fost efectuată folosind HPLC [34,35]. Măsura activității de chelare a fost analizată de UPLC în acest studiu. Soluțiile de 50 µg/mL din fiecare glicozidă feniletanoid (1–3) au fost adăugate într-o soluție de 10 µg/mL de cupru (Cu), calciu (Ca), magneziu (Mg), zinc (Zn), fier (Fe) sau ser de șobolan respectiv. Fiecare compus cu fiecare soluție de metal sau ser a fost analizat prin UPLC. Glicozidele feniletanoide (1-3) au prezentat activitate de chelare a metalelor cu fier și ser (Figura 5, Materiale suplimentare Figura S1). Molecule 2019, 24, x PENTRU REVIZIA PARTICIPĂRII 5 din 12 eșantion de la șobolani asemănător AD după CTE(Cistanche tubulosa extract apos)administrare orală (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4,19 min), 2 (tR{= 5,13 min) și 3 (tR{{= 5,68 min)] . (c) Țesut cerebral necompletat. Figura 4. Glicozidele feniletanoide (1–3) au fost detectabile în țesuturile creierului de șobolan [19] folosind UPLC/MS/MS. Datele reprezentate înseamnă ± SD, n=3 pentru fiecare grup. 2.5. Activitatea de chelare a metalelor glicozide feniletanoide (1-3). În literatura de specialitate, determinarea compușilor liberi și a complexului lor metalic a fost efectuată folosind HPLC [34,35]. Măsura activității de chelare a fost analizată de UPLC în acest studiu. Soluțiile de 50 ug/mL din fiecare glicozidă feniletanoid (1–3) au fost adăugate într-o soluție de 10 ug/ml de cupru (Cu), calciu (Ca), magneziu (Mg), zinc (Zn), fier (Fe) sau ser de șobolan respectiv. Fiecare compus cu fiecare soluție de metal sau ser a fost analizat prin UPLC. Glicozidele feniletanoide (1–3)

2.6. Analiza echinacozidei (1) în serul de șobolan in vivo

Pentru a înțelege distribuția echinacozidei în serul de șobolan, serul a fost colectat de la momentul inițial până la 720 min după administrarea orală a echinacozidei (1) (100 mg/kg) și serul a fost colectat de la momentul inițial până la 720 min după echinacozidă. (1) administrare orală (100 mg/kg) și analizată prin UPLC. Figura 6 a arătat profilurile concentrației în funcție de timp ale echinacozidei în serul de șobolan.

3. Discuție

Demența, în special AD, este o îmbătrânire ireversibilă și o boală cronică care duce la un nod gordian de întrebări. Această boală insurmontabilă duce la probleme economice grave, cu o povară financiară uriașă și în creștere. La nivel mondial, cercetătorii AD depun mult efort pentru a investiga noi medicamente anti-AD, dar au eșuat în mai multe studii clinice mari care vizează A în 2012 [9]. Cu excepția țintirii directe a A, homeostazia ionilor metalici din creier este considerată motivul cheie legat de agregarea și depunerea A care duce la formarea AD [9,10]. Prin urmare, ionii metalici joacă un rol esențial în patogeneza AD, iar ipoteza de chelare a metalelor a devenit o direcție importantă de cercetare [9,13–15].

Conform studiilor noastre anterioare [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa extract apos)a prezentat activitate anti-demență potențială. Chiar și în studiile clinice la om, după 1 an de tratament cu CTE(Cistanche tubulosa extract apos)capsule pentru pacienții cu AD moderată, scorul Alzheimer’s Disease Assessment Scale-subscale cognitive (ADAS-cog) nu ar prezenta o deteriorare semnificativă în comparație cu înainte de tratament [18]. CTE(Cistanche tubulosa extract apos)a menținut stabil scorul ADAS-cog al pacienților cu AD, dar alte medicamente eliberate pe bază de rețetă nu au făcut-o. Singura opțiune de medicamente eliberate pe bază de prescripție medicală autorizate pentru tratamentul AD sunt inhibitorii de acetilcolinesterază (AChEI), cum ar fi donepezilul și galantamina, care îmbunătățesc simptomele AD pe termen scurt, dar deteriorarea apare după 1 an de tratament [36]. Pe baza studiilor clinice, CTE(Cistanche tubulosa extract apos)are oportunitatea de a fi un potențial tratament pentru dezvoltarea agenților anti-AD. Pe baza rapoartelor noastre anterioare [24,25], echinacozida (1), acteozida (2) și izo-acteozida (3) ar proteja neuronii de deteriorarea cauzată de A, ar scădea oligomerizarea A in vitro și ar ameliora semnificativ disfuncția cognitivă indusă de A. in vivo. Studiul in vitro a indicat că dozele active de 1–3 au fost de până la 50 ug/mL [24,25]. Dar studiile anterioare au considerat că biodisponibilitatea orală a 1 și 2 a fost foarte scăzută (0,83% pentru 1 și 0,12% pentru 2) la șobolani [29,30]. Compusul 1 nici măcar nu a putut fi identificat în serul uman după administrarea orală de tablete de echinaceea [37]. Studiile actuale arată că 1-3 au avut permeabilitate și absorbție slabă a membranei în celulele intestinale [38] și majoritatea 1 ar fi metabolizați în canalele gastrointestinale [39]. Conținutul de compus 2 în serul de șobolan a fost de numai aproximativ 4,5 ug/mL după 15 minute de injectare intravenoasă cu o doză de 10 mg/kg de aceozidă [30]. Cu toate acestea, acest studiu arată că 1-3 ar fi detectate în hipocamp și striatul țesuturilor creierului de șobolan după CTE.(Cistanche tubulosa extract apos)administrare orală (Figurile 3 și 4). În plus, Figura 6 a arătat că conținutul de compus 1 în serul de șobolan a crescut de aproximativ 5 ori de la 15 min la 720 min după administrarea orală a compusului 1 (100 mg/kg). Am luat în considerare glicozidele feniletanoide ale CTE(Cistanche tubulosa extract apos)ar trece prin bariera hemato-encefalică și ar exista acțiune de chelare între CTE(Cistanche tubulosa extract apos)iar metalul. Chelarea este o reacție chimică reversibilă. Fierul este elementul esențial în ser și creier [10,40]. Figura 5 arată că trei glicozide feniletanoide ar avea activitate de chelare a metalelor cu fier și ser. Fierul și serul modifică în mod evident aria timpului de retenție maxim a trei glicozide feniletanoide. Chelarea fierului poate fi motivul crucial care duce la identificarea greșită a biodisponibilității foarte scăzute a glicozidelor feniletanoide. Prin urmare, activitatea de chelare a metalelor ar trebui luată în considerare în analiza serului sanguin și a creierului celor trei CTE(Cistanche tubulosa extract apos)glicozide feniletanoide pentru a recupera biodisponibilitatea și farmacocinetica reală. În plus, rezultatele au indicat că trei glicozide feniletanoide (1-3) vor trece prin bariera hemato-encefalică și vor ajunge la țesuturile creierului prin circulația corpului. Acest studiu a dezvoltat cea mai rapidă și mai sensibilă metodă pentru analiza 1-3 folosind UPLC/MS/MS și a oferit dovezi puternice pentru a demonstra că glicozidele feniletanoide (1-3) sunt constituenții bioactivi majori ai CTE(Cistanche tubulosa extract apos).

Extract de Cistanche tubulosa

4. Materiale și Metode

4.1. Material vegetal

Tulpinile de C. tubulosa au fost colectate în mai 2016 din Hangzhou, China. Planta a fost identificată de Dr. Lin HC. Exemplare de voucher (nr. 20016CT) au fost depuse la Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China.

4.2. Izolare și purificare

Tulpina uscată de C. tubulosa a fost măcinată în pulbere, apoi a fost extrasă de cinci ori cu 75% EtOH. După evaporarea solventului la presiune redusă, extractul brut a fost supus cromatografiei pe coloană Macroporousresin AB-8 cu sisteme de solvenți cu gradient H2O/EtOH de la 20% EtOH până la 100% EtOH. Conform cromatografiei în strat subțire, patru fracții (Fr.1~Fr.4) au fost colectate pentru separare ulterioară. pr. 2 a fost supus cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) preparativă pe o coloană COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm × 20 mm id, 5 µm) folosind un acetonitril 18% ca sistem de fază mobilă. Rata de asociere a fost de 15 ml/min. Trei vârfuri majore de interes au fost colectate selectiv. Fracțiile care conțineau compușii vizați au fost condensate în continuare la sec și au produs 1, 2 și, respectiv, 3.

4.3. Analiza Experimentala

Spectrele 1H și 13C RMN au fost obținute folosind spectrometre Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, SUA) cu tetrametilsilan (TMS) ca standard intern. HPLC preparativă a fost efectuată utilizând o coloană cu fază inversă (coloană Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japonia) pe o serie Shimadzu LC-6AD aparat cu detectori UV-Visprominence HPLC (Kyoto, Japonia).

Echinacozid (1):pudră albă; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H RMN (CD3OD, 500 MHz): δ 1.{07 (1H, d, J {= 6,2 Hz, Rha-H{{{10} }), 2,79 (2H, t, J=5,2 Hz, H{-7), 3,56 (1H, m, Ha{{{20}}), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb{-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H{-1), 4,38 (1H, d, J=7,9 Hz, H{-10 ), 5.{00 (1H, t, J {= 9,6 Hz, H-40), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H{-1), 6,27 (1H, d, J {= 15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8,1,2,0 Hz, H{-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H{-2), 6,77 (1H, d, J {= 8,2 Hz, H{ {86}} ), 6,94 (1H,dd, J=8,3, 2,0 Hz, H{-600 ), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}}), 5 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700); 13C-RMN(CD3OD, 125 MHz): 5 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C{-7), 62,6 (Glc-{-6), 69,4 (C{{{{ 124}} ), 70,5 (C{-40 ), 70,6 (Rha-C{-5), 71,5 (Glc-C{-4), 72,0 (Rha-C{-3) , 72,3 (C{-8), 72,4 (Rha-C{-2), 73,8 (Rha-C{-4), 74,7 (C{-50 ), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C{-20 ), 77,8 (Glc-C{-5), 77,9 (Glc-C{-3), 81,7 (C{-30 ) , 103,1 (Rha-C{-1), 104,2 (C{-10 ), 104,7 (Glc-C{-1), 114,7 (C{-200 ), 115,3 (C{{-1 188}} ), 116,3 (C{-500 ), 116,5 (C{-2), 117,1 (C{-5), 121,3 (C{-6), 123,3 (C{{-5 203}} ), 127,6 (C{-100 ), 131,5 (C{-1), 144,7 (C{-3), 146,1 (C{-4), 146,9 (C{{{ 218}} ), 148,2 (C{-700 ), 149,8 (C{-300 ), 168,5 (C{-900 ) (Figura S3–S5)

Acteozid (2):pudră albă; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H RMN (DMSO-d6, 50{0 MHz): 5 0,94(3H, d, J =5,9 Hz, H{{1{{ 156}}}}), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{20}}), 4,70 (1H, t, J=9,0 Hz, H{-400 ), 5,01 (1H, s, H{-1000 ), 6,18 (1H, d, J=15 0,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{-6), 6,62 (1H, d, J=7 0,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H{-2), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz , H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H{-60), 7,01 (1H, s, H{-20), 7,44 (1H) , d, J=15.8 Hz, H{-70 ); 13C RMN: (DMSO-d6, 125 MHz): 5 18,2 (C-6000), 35,1 (C{-7), 60,8 (C{-600), 68,8 (C{{{94} } ), 69,2 (C{-400 ), 70,3 (C{-3000 ), 70,3 (C{-8), 70,4 (C{-2000 ), 70,6 (C{{{109} } ), 71,7 (C{-500 ), 74,5 (C{-200 ), 79,2 (C{-300 ), 101,3 (C{-1000 ), 102,3 (C{{{124} } ), 113,6 (C{-80 ), 114,7 (C{-20 ), 115,5 (C{-5), 115,8 (C{{-50 ), 116,3 (C{{{139} }), 119,6 (C{-6), 121,5 (C{-60 ), 125,6 (C{-10 ), 129,2 (C{-1), 143,6 (C{{{154} }), 145,0 (C{-3), 145,0 (C{-30 ), 145,6 (C{-70 ), 148,5 (C{{-40 ), 165,7 (C{{{169} } ) (Figurile S6–S8).

Izo-acteozidă (3):pudră albă; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H RMN (DMSO-d6, 50{0 MHz): δ 1.07 (3H, d, J=6,1 Hz, H{{10} } ), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H{-100 ), 5,10 (1H, s, H{{ 24}} ),6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H{-80 ), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8,8 Hz, H{-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H{-50 ), 6,94 (1H, d, J {= 8,2 Hz, H{-60 ) , 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 (1H, d, J=15,8 Hz, H-70); 13C RMN (DMSO-d6, 125 MHz): 5 17,9 (C-6000), 35,2 (C{-7), 63,5 (C{-600), 68,2 (C{-5000 ), 70,4 (C{-400 ), 70,6 (C{-3000 ), 71,7 (C{-8), 72,1 (C{-2000 ), 73,7 (C{-4000 ), 74,1 (C{-500 ), 74,5 (C{-200 ), 80,9 (C{-300 ), 100,7 (C{-1000 ), 102,7 (C{-100 ), 113,9 (C{-20 ), 114,9 (C{-80 ), 115,5 (C{-5), 115,8 (C{-50 ), 116,3 (C{-2 ), 119,6 (C{-6), 121,5 (C{-60 ), 125,5 (C{-10 ), 129,2 (C{-1), 143,5 (C{-4 ), 145,0 (C{-3), 145,3 (C{-30 ), 145,6 (C{-70 ), 148,5 (C{-40 ), 165,6 (C{-90 ) (Figurile S9–S11).

4.4. Prepararea extractului apos de Cistanche Tubulosa (CTE)

Tulpina de pulbere de Cistanche tubulosa a fost extrasă de două ori prin reflux cu apă timp de 1,5 ore, iar soluția de extract a fost filtrată. Cel filtratCistanche tubulosaextract apos(CTE) a fost păstrat la 4 ◦C înainte de utilizare.

5. Concluzii

Acest studiu a demonstrat că 1-3 este componenta activă a CTE pentru activitatea anti-AD. Chelarea fierului a devenit noul concept pentru proiectarea unei noi generații de medicamente pentru tratamentul AD [41]. CTE este un potențial medicament botanic anti-AD chinezesc care vizează agregarea și depunerea A induse de chelarea fierului. În plus, am demonstrat în continuare că 1-3 ar ajunge la creier prin bariera hemato-encefalică (BBB). Componentele active și confirmarea mecanismului care stau la baza CTE vor ajuta foarte mult controlul calității și biodisponibilitatea studiilor de produse în viitor. În același timp, metoda de analiză avansată și eficientă prezentată va fi utilă în determinarea 1-3 în plante, alimente, sânge și țesuturi cerebrale pentru amprenta chimică și cercetarea farmacocinetică.

Referințe

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et al. Prevalența și incidența în schimbare a demenței în timp – dovezile actuale. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Dementa: Diagnostic în timp util și intervenție timpurie. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Supraviețuirea și caracteristicile persoanelor în vârstă cu și fără demență care sunt internate în urma autovătămării intenționate. Int. J. Geriatr. Psih. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Prevalența bolii Alzheimer și a demenței vasculare: asociere cu educația. Studiul de la Rotterdam. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Hall, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potocnik, F.; et al. Boala Alzheimer și demența vasculară în țările în curs de dezvoltare: prevalență, management și factori de risc. Lancet. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. 2018 Boala Alzheimer fapte și cifre. Dementul Alzheimer. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Ipoteza amiloidă a bolii Alzheimer: progrese și probleme pe drumul către terapie. Science 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM boala Alzheimer. N. Engl. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metalostaza în boala Alzheimer. Radic liber. Biol. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Efectele ionilor metalici asupra agregării A și Tau. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Reglarea homeostaziei cuprului și fierului de către chelatorii de metale: O posibilă chimioterapie pentru boala Alzheimer. A. Chim. Res. 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Chelatori de cupru (I) pentru boala Alzheimer. J. Fiz. Chim. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Progrese recente în chelatorii de metale multifuncționale ca potențiale medicamente pentru boala Alzheimer. Coord. Chim. Rev. 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metalomics pentru tratamentul bolii Alzheimer: Utilizarea unei noi generații de chelatori care combină proprietățile de legare și transport a cationilor de metal. EURO. J. Med. Chim. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Teranostice implicate în metal: O strategie emergentă pentru combaterea bolii Alzheimer. Coord. Chim. Rev. 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN Farmacopeea Chineză; Chemical and Industrial Publisher: Beijing, China, 2005; p. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Unul dintre cele mai bune daruri farmaceutice ale medicinei tradiționale chineze. Față. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. Un studiu deschis, non-controlat cu placebo, asupra capsulelor de glicozidă Cistanche tubulosa (recuperare memoriu (R)) pentru tratarea bolii Alzheimer moderate. A.m. J. Alzheimer Dis. Alte Demen. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Inversarea prin extracte apoase de Cistanche tubulosa din deficite comportamentale în modelul de șobolan asemănător bolii Alzheimer: Relevanța pentru depunerea de amiloid și funcția neurotransmițătorului central. Complement BMC. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Analiza glicozidelor feniletanoide din extractul de herba Cistanchis prin LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Efectele neuroprotectoare ale echinacozidei în modelul MPTP de șoarece al bolii Parkinson. EURO. J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Da, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside protejează împotriva apoptozei neuronale induse de MPP (plus) prin reglarea căii ROS/ATF3/CHOP. Neurosci. Taur. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside protejează împotriva disfuncției mitocondriale induse de 6-hidroxidopamină și a răspunsurilor inflamatorii în celulele PC12 prin reducerea producției de ROS. Evid. Complement pe bază. Alternat. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside ameliorează afectarea memoriei și deficitul colinergic indus de peptidele beta-amiloid prin inhibarea depunerii de amiloid și a toxicologiei. Funcție alimentară. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Acteoside și izo-acteoside protejează citotoxicitatea indusă de peptida beta-amiloid, deficitul cognitiv și tulburările neurochimice in Vitro și in Vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. [CrossRef]