Interferența glicozidelor feniletanoide din Cistanche Tubulosa cu testul MTT

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu și Yu-Qi Gao

Abstract:

Testul MTT, ca metodă de screening, a fost utilizat pe scară largă pentru a măsura viabilitatea și proliferarea celulelor. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că testul MTT poate să nu reflecte cu acuratețe efectulCistanche tubulosaextract etanolic pe viabilitatea celulelor EA.hy926. Pentru a investiga și identifica componentele responsabile pentru observațiile contradictorii ale testului MTT, echinacozidul și acteozidul, au fost izolate două glicozide feniletanoide principale, din extractul etanolic de C. tubulosa. Datele derivate din testele CCK-8, Hoechst 33342 și anexină V-FITC/PI sugerează că gruparea cafeoil prezentă în ambii compuși izolați a fost responsabilă pentru rezultatele contradictorii ale testului MTT. Aceste date subliniază necesitatea utilizării unei varietăți de metode diferite pentru a determina efectul agenților medicinali asupra viabilității celulare pentru a evita generarea de rezultate înșelătoare.

Cuvinte cheie: test MTT;glicozid feniletanoid; acid cafeic; viabilitatea celulei; interferență

Introducere

Planta parazitaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (familia Orobanchaceae) este larg răspândit în țările nord-africane, arabe și asiatice [1]. Devine dinCistanche tubulosașiCistanche deserticolasunt importante în medicina tradițională chineză, fiind utilizate pentru tratamentul impotenței, sterilității, lumbagoului și constipației datorate inerției colonice [2]. În plus, extractul etanolic de Cistanche tubulosa s-a dovedit a avea un efect protector semnificativ împotriva hipoxiei cerebrale la șoareci [3].

Celulele endoteliale joacă un rol crucial în patogenia hipertensiunii pulmonare hipoxice. Linia de celule endoteliale EA.hy926 este considerabil similară cu celulele endoteliale primare. În timpul propriului nostru studiu al efectului anti-hipoxic alCistanche tubulosaextract etanolic de pe celula endotelială EA.hy926, am observat că bromura de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-difeniltetrazoliu (MTT) testul, care este utilizat în mod obișnuit pentru a evalua viabilitatea celulelor în studiile de citotoxicitate și activitate citostatică, a generat rezultate contradictorii, arătând viabilitate crescută a celulelor EA.hy926 după tratament.

Evaluarea precisă a viabilității celulare este esențială pentru a identifica potențialele efecte citotoxice sau citoprotectoare ale unui agent medicinal. Prin urmare, am investigat ce componente prezente în extractul etanolic de C. tubulosa pot fi responsabile pentru rezultatele contradictorii observate cu testul MTT. Am izolat două glicozide feniletanoide (PhG) principale din extractul etanolic de C. tubulosa, echinacozidul (denumit în continuare compusul 1) și actozidul (denumit în continuare compusul 2) și am determinat efectul acestora asupra viabilității celulelor EA.hy926 folosind o varietate de metode. În plus, pentru a clarifica în continuare care substituent al compușilor 1 și 2 poate fi responsabil pentru rezultatele contradictorii, am testat agliconii acestora, acidul cafeic (denumit în continuare compusul 3) și 3,4-dihidroxilfeniletanolul (denumit în continuare compusul 4), privind viabilitatea celulelor EA.hy926 folosind aceleași metode.

Rezultate si discutii

Identificarea compușilor

Structurile celor doi compuși izolați din extractul etanolic de C. tubulosa au fost identificate prin analize de rezonanță magnetică nucleară (RMN) și spectrometrie de masă (MS) și sunt prezentate în Figura 1. Compusul 1 a fost identificat ca echinacozidă prin comparație cu RMN raportată anterior (Tabelul) 1) și date MS (m/z 785 [M-H]-) [4]. Spectrele RMN ale compusului 2 au fost foarte asemănătoare cu cele ale compusului 1, cu excepția absenței unei grupări -D-glucopiranosil (Tabelul 1). Compusul 2 (m/z 623 [M-H]-) a fost identificat ca actozidă [5]. Este important că ambii compuși au aceeași agliconă, care include acidul cafeic (compusul 3) și 3,4-dihidroxilfeniletanolul (compusul 4).

Teste de viabilitate celulară

Testele MTT și CCK{{0}} au fost utilizate pentru a analiza efectul compușilor 1-4 asupra viabilității celulelor EA.hy926. Testul MTT a arătat că viabilitatea celulelor EA.hy926 a crescut semnificativ după tratamentul cu compusul 1, 2 sau 3 cu 25 și 50 μM (166,3% și 174,1% pentru compusul 1, 205,8% și 224,3% pentru compusul). 2 și, respectiv, 164,8% și, respectiv, 189,6% pentru compusul 3; p <0,05), în="" comparație="" cu="" celulele="" de="" control="" (figura="" 2a).="" mai="" mult,="" o="" inspecție="" morfologică="" a="" celulelor="" a="" determinat="" că="" tratamentul="" cu="" 50="" μm="" compusul="" 1,="" 2="" sau="" 3="" a="" crescut="" formarea="" de="" cristale="" de="" formazan="" violet,="" care="" sunt="" considerate="" a="" fi="" o="" indicație="" directă="" a="" proporției="" de="" celule="" vii="" (figura="" 3).="" în="" schimb,="" testul="" cck-8="" a="" sugerat="" că="" viabilitatea="" celulară="" a="" scăzut="" semnificativ="" după="" tratamentul="" cu="" 12,5,="" 25="" și="" 50="" μm="" compusul="" 1,="" 2="" sau="" 3="" (75,5="" la="" sută,="" 45,1="" la="" sută="" și="" 43,7="" la="" sută="" pentru="" compusul="" 1,="" 85,5="" la="" sută,="" 51,8="" la="" sută="" și="" 34,3="" la="" sută="" pentru="" compusul="" 2="" și="" 64,5="" la="" sută,="" 48,2="" la="" sută="" și,="" respectiv,="" 36,4="" la="" sută="" pentru="" compusul="" 3;="" p="">< 0,05),="" în="" comparație="" cu="" celulele="" martor="" (figura="" 2b).="" compusul="" 4="" nu="" a="" afectat="" viabilitatea="" celulară="" nici="" în="" testul="" mtt,="" nici="" în="" testul="" cck-8.="" discrepanța="" dintre="" rezultatele="" obținute="" cu="" cele="" două="" teste="" sugerează="" că="" una="" dintre="" cele="" două="" teste="" poate="" să="" nu="" reflecte="" cu="" acuratețe="" efectele="" compușilor="" 1="" și="" 2="" asupra="" viabilității="" celulelor="">

Evaluarea apoptozei prin colorare Hoechst

Hoechst 33342 este o colorație de ADN permeabilă la celule, care este excitată de lumina ultravioletă și emite fluorescență albastră la 460 până la 490 nm. Cromatina condensată a celulelor apoptotice se colorează mai puternic decât cromatina celulelor normale [6]. În timp ce celulele de control au prezentat cromatină dispersată uniform, organite normale și membrane celulare intacte, celulele incubate cu 50 μM compuși 1, 2 sau 3 timp de 48 de ore au arătat colorarea tipică a celulelor apoptotice (Figura 4A). În schimb, expunerea celulelor la 50 μM de compus 4 nu a crescut numărul de nuclee apoptotice în comparație cu tratamentul de control.

Analiza citometrică în flux a celulelor apoptotice

Testul de dublă colorare a anexinei V-FITC/PI identifică celulele apoptotice prin legarea de mare afinitate a anexinei V-FITC la fosfatidilserina, care este exteriorizată în celulele aflate în apoptoză [7]. În acest test, celulele viabile nu se leagă nici de anexina V, nici de PI și, prin urmare, nu sunt colorate (cadranul stâng inferior), celulele apoptotice timpurii sunt colorate în verde prin legarea anexinei V-FITC (cadranul din dreapta jos) și celulele apoptotice tardive. sunt colorate cu verde și roșu prin legarea anexinei V-FITC la fosfatidilserina și respectiv a PI la celulele necrotice (cadranul din dreapta sus). După cum se arată în Figura 4B, celulele incubate cu 50 μM compuși 1, 2 sau 3 timp de 48 de ore, procentul de celule apoptotice a crescut de la 3,74% (celule martor) la 10,32%, 12,95% și, respectiv, 11,30%. Comparativ cu celulele martor, compusul 4 nu a crescut procentul de celule apoptotice EA.hy926.

În concordanță cu rezultatele obținute cu testul CCK-8 și prin colorarea Hoechst 33342, testul de citometrie în flux a arătat că compușii 1, 2 și 3 au indus apoptoza în celulele EA.hy926. În total, aceste observații sugerează că creșterea viabilității celulelor EA.hy926 observată cu testul MTT după tratamentul cu compușii 1-3 a reprezentat un rezultat fals pozitiv.

Discuţie

În 1983, Mosmann a dezvoltat un test colorimetric pe microplăci MTT pentru măsurarea proliferării celulare și a citotoxicității [8]. Acest test simplu, și modificările acestuia, sunt acum utilizate pe scară largă în laboratoarele de biologie celulară din întreaga lume. Studiile de fracționare în celulele de mamifere au indicat că cofactorul nucleotid de piridină redus, NADH, este responsabil pentru cea mai mare parte a reducerii MTT. Acest lucru a fost susținut de studii care au folosit celule întregi [9]. Prin urmare, reducerea MTT este asociată cu celulele active metabolic și nu este doar cuplată cu respirația mitocondrială, ci și cu citoplasma și membranele nemitocondriale, inclusiv compartimentul endozom/lizozom și membrana plasmatică [10]. Sarcina pozitivă netă a moleculei MTT este factorul principal pentru absorbția sa celulară prin potențialul membranei plasmatice.

În special, testul MTT poate să nu reflecte ocazional cu exactitate efectul real pe care un compus testat îl are asupra celulelor specifice. Cu toate acestea, nu au fost identificate structurile chimice sau grupurile care pot provoca rezultate contradictorii în testul MTT. Studii recente au demonstrat că testul MTT ar putea subestima efectul anti-proliferativ al (-)-epigalocatechin-3-galat, cel mai abundent polifenol din ceaiul verde [11]. În studiile care utilizează testul MTT pentru a detecta chimiosensibilitatea tumorală, agenții chimioterapeutici anticancer, cum ar fi epirubicina, paclitaxelul, docetaxelul și mesilatul de imatinib (Gleevec), au arătat o viabilitate celulară crescută [12,13]. Mai mult, o serie de studii au raportat că anumite extracte de plante și polifenoli redox-activi ar putea interfera cu testul MTT, deoarece reduc direct sarea de tetrazoliu MTT în absența celulelor [14].

Necesitatea de a solubiliza cristalele de formazan MTT înainte de analiza spectrofotometrică într-un cititor de microplăci și natura finală inerentă a reacției limitează utilizarea testului MTT la anumite aplicații. Acest lucru a condus la dezvoltarea analogilor de tetrazoliu în care fragmentele fenil au fost decorate cu grupări sulfonat încărcate negativ, cum ar fi 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-carboxamidă (XTT), o sare interioară încărcată negativ [15] și 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-({3-carboximetoxifenil){-2-({{4-sulfofenil){-2H-tetrazoliu (MTS), o sare interioară slab acidă strâns legată de MTT [16] . Aceste modificări au dus la producerea de produse formazan solubile în mediu de cultură care au eliminat necesitatea unei etape de solubilizare înainte de cuantificare. În mod corespunzător, deoarece sarcina negativă crescută a acestor molecule le-a redus capacitatea de a se deplasa prin membranele celulare [17], acceptorii de electroni intermediari (IEA), cum ar fi 1-metoxi{-5-metil fenazinium metil sulfat ({{25} }}metoxi PMS) au fost necesare pentru a facilita reducerea coloranților tetrazol sau pentru a crește rata de reducere.

Mai recent, a fost dezvoltată o nouă generație de săruri de tetrazoliu solubile în apă din care WST-1 este prototipul [18]. WST-1, o sare interioară disulfonată încărcată negativ, care conține un reziduu de iod, este mai stabilă decât XTT și MTS în prezența 1-metoxi PMS, IEA obligatorie. Acest lucru a condus la comercializarea WST-1/{1-metoxi PMS ca un kit convenabil de proliferare celulară cu un singur reactiv. Au fost dezvoltate mai multe alte săruri de tetrazoliu din seria WST, dintre care cea mai utilă fiind poate WST-8 [19]. WST-8 pare să aibă proprietăți de reducere celulară foarte asemănătoare cu WST-1 și este comercializat independent ca test CCK-8. WST-8 este impermeabil pentru celule și, prin urmare, este redus extracelular, prin transportul de electroni de la NADH intracelular la WST-8 prin membrana plasmatică mediat de 1-metoxi PMS. Deși atât reducerea MTT, cât și WST-8/{1-metoxi PMS sunt determinate de NADH intracelular, sursa NADH pare să difere în cadrul acestor două metode. Reducerea WST-8/{{1-metoxi PMS depinde mai mult de transferul malat/aspartat care leagă ciclul acidului tricarboxilic mitocondrial-NADH cu spațiul extramitocondrial [20].

În experimentele preliminare, am confirmat că compușii 1, 2, 3 și 4 nu au putut reduce direct sarea de tetrazoliu MTT (neprezentată). În studiul de față, influența directă a compușilor înșiși cu reactiv a fost eliminată prin spălarea atentă a microplăcilor cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) înainte ca soluția MTT sau CCK-8 să fie adăugată, așa cum este indicat în protocoalele producătorului. Cu toate acestea, rezultatele obținute folosind cele două metode au fost încă contradictorii (Figura 2). După cum era de așteptat, incubarea celulelor cu compușii 1, 2 și 3 a crescut reducerea sării de tetrazoliu în formazan violet, în comparație cu grupul de control (Figura 3), sugerând că simpla reducere a sării de tetrazoliu în prezența unui compus specific nu este suficient pentru a aprecia capacitatea compusului de a interfera cu testul MTT.

Pentru a determina dacă compușii 1, 2, 3 și 4 ar putea induce apoptoza în celulele EA.hy926, au fost evaluate modificările morfologice celulare și exteriorizarea fosfatidilserinei. În concordanță cu scăderea viabilității celulare observată cu testul CCK-8, rezultatele colorării Hoechst și analizei citometriei în flux folosind anexina V-FITC/PI au sugerat că inhibarea creșterii observată după tratamentul cu compusul 1, 2 și 3 a fost datorită, cel puțin parțial, apoptozei celulelor EA.hy926. Rezultatele noastre au susținut, de asemenea, ideea că gruparea cafeoil prezentă în ambii compuși 1 și 2 a fost responsabilă pentru rezultatele contradictorii obținute cu testul MTT.

Similar cu descoperirile noastre, Rottlerin, un deschizător puternic de canal de potasiu cu conductanță mare, nu a prezentat reactivitate față de MTT in vitro. Cu toate acestea, a îmbunătățit puternic formarea de cristale de formazan în interiorul celulelor, un rezultat care a fost în conflict evident cu inhibarea Rottlerin a NF-kB și proliferarea celulară observată prin analiza încorporării [3H]-timidină în ADN [21]. Mecanismul prin care Rottlerin a îmbunătățit reducerea MTT a fost atribuit efectului său de decuplare mitocondrială [22]. Rottlerin are o grupare substituentă a acidului cinamoil. În comparație cu acidul cinamoil, compusul 3 are două resturi hidroxil suplimentare, care sunt situate la C-3 și C-4. Prin urmare, speculăm că mecanismul prin care compușii 1 și 2 provoacă rezultate contradictorii în testul MTT poate fi, de asemenea, asociat cu efectele lor de decuplare mitocondrială. Pentru a testa această ipoteză, sunt necesare studii comparative între compușii 1, 2 și un decuplator chimic, cum ar fi trifluorocarbonilcianura fenilhidrazona (FCCP).

Sectiunea Experimentala

Reactivi și substanțe chimice

Compusul 3 (acid cafeic-pulbere, puritate=98,6 la sută) a fost achiziționat de la Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). Compusul 4 (3,4-dihidroxilfeniletanol-ulei, puritate=98,5 la sută) a fost obținut de la Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). MTT și dimetil sulfoxid (DMSO) au fost obținute de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Testul CCK-8 a fost achiziționat de la Dojin Laboratories (Kumamoto, Japonia). Trusele de detectare a apoptozei Hoechst 33342 și anexin V-FITC/PI au fost achiziționate de la Institutul de Biotehnologie Beyotime (Haimen, China)

Material vegetal

Tulpinile de C. tubulosa au fost colectate din Prefectura Yutian, Regiunea Autonomă Xinjiang Uygur, China. Specimenele de voucher au fost depuse în Laboratorul Cheie de Medicină de Înaltă Altitudine, Universitatea de Medicină Militară a treia (Chongqing, China) și autentificate de Yi Zhang de la Universitatea de Medicină Tradițională Chineză Chengdu (Chengdu, China)

Extracția și izolarea materialului vegetal

Tulpinile uscate de C. tubulosa (0,6 kg) au fost pudrate și extrase cu 50 procente etanol timp de 2 ore la 70 de grade. După îndepărtarea solventului la presiune redusă, extractul etanolic (212,5 g) a fost dizolvat și suspendat în apă (2 L) și extras cu n-butanol (2 L × 3). Extractul n-butanolic (110 g) a fost cromatografiat pe o coloană de poliamidă și eluat cu etanol/apă (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) producând cinci fracții (A-E) . Fracţia B (65 g) a fost fracţionată pe o coloană ODS; eluare cu etanol: apă (1:9) compus 1 separat (3 g). Fracţia D (10,5 g) a fost fracţionată pe o coloană ODS; eluare cu etanol/apă (1:4) compusul 2 separat (1 g).

Spectrele RMN au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker Avance 600 în CD3OD cu tetrametilsilan (TMS) ca standard intern. Spectrele de masă au fost efectuate pe un spectrometru de masă BioTOF-Q.

Cultură de celule

Liniile celulare EA.hy926 au fost obținute de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, SUA). Celulele au fost cultivate în mediu RPMI 1640, suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal bovin și 1% (v/v) penicilină-streptomicină într-un mediu umidificat cu 5% CO2 la 37 de grade.

Viabilitatea celulei

Viabilitatea celulară a fost evaluată folosind testele MTT și CCK{{0}}. Compușii 1 și 2 și agliconii lor, acidul cafeic (3) și 3,4-dihidroxilfeniletanol (4) au fost dizolvați în DMSO până la concentrația finală de DMSO < 0,1="" procente="" (v/v)="" în="" mediul="" de="">

Celulele EA.hy926 au fost însămânțate pe plăci de 96-godeuri la 4 × 103 celule/godeu. După incubare timp de 24 de ore, celulele au fost tratate cu 6,25-50 μM compus 1, 2, 3 sau 4 timp de 24 de ore. Mediul de cultură a fost îndepărtat și celulele au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). S-au adăugat alicote (10 μL) de soluție stoc MTT (5 mg·mL-1) la fiecare godeu care conține 100 μL de mediu și s-au incubat cu celule timp de 4 ore. După incubare, mediul a fost îndepărtat și s-au adăugat alicote de 150 μL de DMSO în fiecare godeu pentru a solubiliza cristalele de formazan. Absorbanța a fost măsurată la 490 nm folosind un cititor de microplăci (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, SUA). Viabilitatea celulară a fost exprimată ca procent de reducere a MTT, atribuind valoarea de 100% absorbanței celulelor de control. Toate experimentele au fost efectuate de trei ori și prezentate ca medie ± abatere standard (SD).

Testul CCK-8 a fost efectuat în conformitate cu literatura de specialitate cu mici modificări [23]. Mai exact, celulele au fost tratate cu 6,25-50 μM compuși 1, 2, 3 sau 4 timp de 24 de ore și spălate de două ori cu PBS înainte de adăugarea a 10 μL de soluție CCK-8 și 100 μL de mediu de cultură. După incubarea microplăcii la 37 de grade timp de 2 ore, absorbanța a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de microplăci. Viabilitatea celulară a fost exprimată ca procent de celule viabile în raport cu celulele de control (100 la sută). Toate experimentele au fost întreprinse de trei ori și exprimate ca medie ± SD.

Evaluarea apoptozei prin colorarea Hoechst 33342

Modificări morfologice apoptotice au fost observate prin colorarea Hoechst 33342. Pe scurt, celulele EA.hy926 au fost însămânțate pe plăci de 48-godeuri (2 × 104 celule/godeu) și tratate cu 50 μM compusul 1, 2, 3 sau 4 timp de 48 de ore la 37 de grade, spălate de două ori cu PBS, şi fixat cu 4 procente (v/v) paraformaldehidă timp de 15 min la temperatura camerei. După clătire de două ori cu PBS, celulele au fost colorate cu Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) timp de 5 minute la temperatura camerei și spălate de două ori cu PBS. Nucleele colorate cu Hoechst au fost vizualizate folosind un microscop cu fluorescență (Olympus, Tokyo, Japonia).

Analiza apoptozei prin citometrie în flux

Celulele apoptotice au fost detectate prin dublă colorare a anexinei V-FITC/PI și analiza citometriei în flux. Pe scurt, după tratamentul cu 50 μM compus 1, 2, 3 sau 4 timp de 48 de ore, celulele au fost recoltate și resuspendate în PBS la 1 × 105 celule · mL-1. După centrifugare la 500 x g timp de 5 minute la 25 de grade, s-au adăugat 195 µL de tampon de legare a anexinei V-FITC și 5 µL de anexină V-FITC. După amestecare blândă în vortex, amestecul a fost incubat timp de 10 minute la temperatura camerei în întuneric. După centrifugare la 500 x g timp de 5 minute la 25 de grade, s-au adăugat 190 μL de tampon de legare a anexinei V conjugat cu FITC și 10 μL PI. După amestecare blândă în vortex, probele au fost analizate folosind un citometru de flux FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, SUA) în 30 de minute.

Analize statistice

Toate datele experimentale au fost exprimate ca medie ± SD. Semnificația diferențelor dintre probele experimentale și controlul corespunzător a fost evaluată prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) folosind software-ul SPSS (versiunea 11.5). Semnificația statistică a fost stabilită la p <>

Concluzii

Rezultatele noastre sugerează că supraestimarea numărului de celule viabile observate în testul MTT ar putea masca citotoxicitatea anumitor compuși. Prin urmare, în timpul proceselor de screening a medicamentelor, vă recomandăm să utilizați o varietate de metode pentru a determina efectul compusului specific asupra viabilității celulare (cum ar fi testele CCK-8 și 3 H-TdR) pentru a evita generarea de rezultate înșelătoare.