Izolarea și cuantificarea ginsenozidei Rh23, un nou compus anti-melanogenic din frunzele de Panax Ginseng

Abstract:

O nouă ginsenozidă, denumită ginsenozidă Rh23 (1) și 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahidroxidamar-23-enă (2) au fost izolate din frunzele de ginseng hidroponic Panax. Compușii au fost izolați prin diferite cromatografii pe coloană, iar structurile lor au fost determinate pe baza metodelor spectroscopice, inclusiv spectrometrie de masă cu patrupol de înaltă rezoluție/timp de zbor (HR-QTOF/MS), spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (RMN) și spectroscopie în infraroșu (IR). . Pentru a determina activitatea anti-melanogenă, a fost testată modificarea conținutului de melanină din celulele Melan-a tratate cu compuși identificați.

În plus, am investigat efectele inhibitoare ale melaninei ale ginsenozidei Rh23 asupra pigmentării într-un model in vivo de pește-zebră. Compusul 1 a inhibat melanogeneza puternică în celulele melan-a cu 37,0 procente de inhibare a melanogenezei la 80 µM și a prezentat, de asemenea, inhibare asupra pigmentării corpului în modelul de pește-zebra. Deși compusul 2 a arătat o activitate inhibitorie puțin mai mică decât compusul 1, a arătat, de asemenea, o scădere semnificativă a melanogenezei în celulele Melan-a și modelul pește-zebră. Aceste rezultate au indicat că compușii izolați din P. ginseng hidroponic pot fi utilizați ca noi compuși pentru albirea pielii prin sistemele in vitro și in vivo. Mai mult, acest studiu a demonstrat utilitatea compusului 1 pe bază de MS pentru analiza cantitativă. Ginsenoside Rh23 (1) a fost găsit la un nivel de 0,31 mg/g în frunzele de P. ginseng hidroponic.

Pentru melanină, am constatat că Cistanche poate reduce semnificativ activitatea tirozinazei, care este principala enzimă care limitează rata în biosinteza melaninei pielii și este un complex de cupru și proteine. Poate hidroxila tirozina, principala materie primă pentru producerea de melanină în organism, pentru a produce L-dopa și apoi oxida dopa la dopachinonă. Dopachinona suferă o serie de procese metabolice, se rearanjează și se polimerizează, iar în cele din urmă se combină cu Proteinele se combină pentru a produce o serie de pigmenți de melanină care provoacă rumenirea. Melanina este cel mai important factor în determinarea culorii pielii corpului uman. Sinteza excesivă poate provoca formarea de boli pigmentare ale pielii, cum ar fi pistruii, cloasma, petele de vârstă și melanomul. Prin urmare, prin cercetările privind inhibarea activității tirozinazei, ingredientele eficiente pentru inhibarea pigmentării pielii pot fi eliminate, astfel încât se poate observa că glicozidele totale ale Cistanche deserticola au efect de inhibare a pigmentării pielii și de albire a frumuseții.

Faceți clic pe produs de dozare cistanche

Cuvinte cheie:

ginsenozidă Rh23; Panax ginseng; RMN; UPLC-QTOF/MS; peste zebra; analiza cantitativa.

1. Introducere

Panax ginseng CA Meyer este o plantă medicinală tradițională foarte faimoasă în țările asiatice. Panax provine dintr-un „panacea”, care înseamnă un leac pentru toate bolile. P. ginseng este o plantă erbacee perenă aparținând familiei Araliaceae [1]. Rădăcinile de P. ginseng de patru până la șase ani sunt utilizate în principal în scopuri terapeutice. Florile înfloresc în iunie, iar frunzele, au o formă de palat. P. ginseng a fost cultivat în principal în Asia de Est, inclusiv Coreea, China și Japonia [2]. Până în prezent, au fost raportate multe studii despre constituenții chimici ai rădăcinilor, frunzelor și fructelor de ginseng; au fost izolate peste 100 de tipuri de ginsenozide. Au fost raportate diverse bioactivități ale P. ginseng, cum ar fi îmbunătățirea activității imunomodulatoare, fortificarea nutrițională, îmbunătățirea funcției hepatice, antidiabet, activități anticancerigene, anti-apoptotice și antioxidante [3–10].

În prezent, interesul pentru produsele agricole de înaltă calitate legate de bunăstare crește treptat, ceea ce duce la cultivarea hidroponică a ginsengului. Cultura hidroponică are avantajele unui proces de cultivare simplu și o perioadă de creștere mai scurtă decât cultivarea solului. Ginsengul hidroponic are nevoie de doar 2-4 luni într-un sistem care controlează temperatura, nu conține pesticide, umed, ușor, are ingrediente organice etc. [11]. Frunzele de ginseng de sol nu sunt folosite în scopuri medicinale și legume funcționale, în timp ce frunzele de ginseng hidroponic pot fi folosite.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. În mod concludent, condițiile hidroponice au condus la un conținut ridicat de ginsenozidă, iar conținutul total de ginsenozidă din frunze a fost semnificativ mai mare decât în ​​rădăcini, sugerând că frunzele de ginseng ar putea fi o sursă bună de legume funcționale și ierburi medicinale.

Mai mulți compuși de albire cunoscuți, cum ar fi arbutina și acidul kojic, au fost investigați pentru eficacitatea lor în reducerea melanogenezei [13]. Din păcate, este necesar să se găsească agenți de albire a pielii mai siguri și mai eficienți, datorită potențialului carcinogen al acidului kojic și atât siguranței, cât și efectelor secundare ale arbutinei [14]. Astfel, o mare atenție a fost investigată în mod continuu pentru dezvoltarea de noi produse naturale în industria cosmetică [15,16]. Mai multe studii au raportat inhibarea sintezei melaninei din P. ginseng cultivat în sol [17–20].

Cu toate acestea, aceste studii au fost raportate cu compuși bine cunoscuți, cum ar fi acidul cinamic și compușii fenolici, iar activitatea de albire nu a fost raportată din frunzele de P. ginseng hidroponic (HPGL). Munca noastră continuă a condus la izolarea ginsenozidelor minore din HPGL. De obicei, ginsenozidele în cantități minore sau urme nu pot fi detectate prin HPLC. În caz contrar, timpul analitic este foarte lung, ceea ce nu este convenabil pentru calificarea ginsenozidelor din condimentele de ginseng [21,22]. Pentru a cuantifica rapid compuși noi, ar trebui stabilită o metodă rapidă și sensibilă, care să poată detecta în detaliu urmele de compuși noi. În studiul de față, a fost stabilită o cromatografie lichidă sensibilă de ultraînaltă performanță cuplată cu metoda spectrometriei de masă cu patrupol/timp de zbor (UPLC-QTOF-MS) pentru a cuantifica noul compus.

Pe baza descrierii de mai sus, în această lucrare, izolarea și identificarea unui nou compus, inclusiv proprietățile fizice și cuantificarea, au fost dezvăluite prin metode spectroscopice, iar activitățile lor anti-melanogenice au fost investigate prin sisteme in vitro și in vivo.

2. Rezultate și discuții

Frunzele de Panax ginseng hidroponic (HPGL) au fost extrase cu MeOH apos și împărțite în fracțiuni de acetat de etil (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) și, respectiv, H2O. Cromatografiile repetate pe coloană Si02 și ODS ale fracției n-BuOH au condus la o nouă ginsenozidă (1) și o ginsenozidă rară (2) a fost izolată din fracția EtOAc a HPGL.

Compusul 1, pulbere albă (metanol), a prezentat o culoare violet pe TLC, prin pulverizarea 10 procente H2SO4 și încălzire. Formula moleculară a fost determinată a fi C37H64O10 din vârful ionului cvasi-molecular m/z 713,44723 [M plus COOH]- în QTOF/MS negativ. Spectrul IR a sugerat prezența unei grupări hidroxil (3377 cm-1) și a unei duble legături (1647 cm-1). Spectrul 1H-RMN (Tabelul 1 și materiale suplimentare) a arătat două semnale de protoni de olefină metină (δH 6,02, 5,64), trei semnale de protoni de metină oxigenate (δH 4,38, 4,03, 3,49), un semnal de protoni metoxi (δH 3,8) și opt. semnale de protoni metil singlet (5H 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), indicând că compusul 1 are o porțiune triterpenică tetraciclică incluzând o legătură dublă cu conformație trans și trei grupări hidroxil.

În plus, compusul 1 este confirmat a fi un tip de protopanaxatriol (PPT) de la schimbarea chimică a unui semnal de proton metil la 5H 1,94 (H-28). Deplasarea chimică a H-28 în tipul protopanaxadiol (PPD) este de obicei observată la ca δH 1,30 [23]. Mai mult, un semnal de protoni hemiacetal (δH 5,15) și mai multe metine oxigenate și semnal de protoni de metilen la δH 4,45–3,95 au fost observate ca semnale ale unui fragment de zahăr. Din constanta de cuplare a semnalului de proton anomer (J=7.6 Hz), atât protonul hemiacetal cât și H-2 al fragmentului de zahăr au fost într-un aranjament axial. Combinația datelor menționate mai sus a concluzionat că compusul 1 este o aminoglicozidă protopanaxatriol. Spectrul 13C-RMN a prezentat 37 de semnale de carbon datorită fragmentelor triterpene, metoxi și hexoză. Doi atomi de carbon olefin metin (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C{-23)), un carbon cuaternar oxigenat (δC 74,9 (C{-25)), trei atomi de carbon metan oxigenat (δC 78,5 (C-3), 7{{9{0}},3 (C{-12), 67,7 (C{-6)), un carbon metoxi (δC 50,2 ( 25-OCH3)) și opt atomi de carbon metil (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C{-27), 26,1 (C{-26), 23,0 (C{{{ pentru fragment aglicon. Datele RMN ale compusului 1 au fost similare cu cele ale compusului 2, cu excepția deplasării chimice pentru un carbon cuaternar oxigenat, adică C-25. În plus, zahărul a fost identificat ca o -glucopiranoză din semnalele de carbon hemiacetal (δC 98,3, (C-10 )), patru metine oxigenate (δC 78,9 (C{-30), 78,2 (C{{{82}). }} ), 75,2 (C-20 ), 71,6 (C{-40 )) și o metilenă oxigenată (δC 63,0 (C{-60 )). În spectrele de corelație cu legături multiple heteronucleare de gradient (gHMBC), s-a observat o corelație pe distanță lungă între semnalul proton anomeric (δH 5,15 (H{-10)) și semnalul de carbon cuaternar oxigenat al agliconului (δC 83,0 (C). -20)), indicând faptul că -glucopiranoza a fost legată de hidroxilul C-20 (Figura 1).

În plus, corelația dintre semnalul metoxi proton (δH 3,18 (25-OCH3)) și semnalul de carbon cuaternar oxigenat (δc 74,9 (C{-25)) a indicat că metoxi a fost legat de C{{ 7}} (Figura 1). Pe baza datelor de mai sus, structura chimică a lui 1 a fost determinată a fi 20-O- -D-glucopiranosil{-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahidroxi-25- methoxydammar-23-enă și numită ginsenozidă Rh23. Compusul 2 a fost identificat ca fiind 20-O- -D-glucopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroxidamar-23-enă din comparațiile RMN și Datele MS cu cele raportate în literatură [23,24] (Figura 1). Compușii 1 și 2 au fost, pentru prima dată, izolați din HPGL.

Puritatea ginsenozidei Rh23 a fost determinată a fi mai mare de 99% prin normalizarea zonelor de vârf detectate prin analiza UPLC. Deoarece UPLC-OTOF/MS s-a dovedit a fi un instrument adecvat pentru identificarea ginsenozidei Rh23, separarea constituenților din extractul HPGL a fost efectuată de UPLC-OTOF/MS în modul cu ioni negativi. Figura 2 prezintă o cromatogramă ionică totală (TIC) tipică a ginsenozidei Rh23 și extract cu detectarea masei.

S-a obținut o curbă de calibrare liniară pentru ginsenozidă Rh23 la diferite niveluri de concentrație. Caracteristicile diagramelor de calibrare sunt rezumate în tabelul 2. După cum se vede în tabel, ginsenozida Rh23 prezintă coeficienți de corelație excelenți. Numărările detectoarelor (suprafața relativă a vârfului) au fost dependente liniar de concentrația probei în intervalul de 0.02–0,8 µg/mL pentru ginsenozida Rh23. LOD-ul ginsenozidei Rh23 a fost de 0.002 ppm. LOQ-urile ginsenozidei Rh23 au fost determinate a fi de 0,005 ppm prin UPLC-QTOF/MS în modul cu ioni negativi. Cantitatea de ginsenozidă Rh23 din HPGL obţinută prin metode de validare (Tabelul 2) a fost de 0,319 mg/g.

Pentru a determina activitatea anti-melanogenă, a fost studiată modificarea conținutului de melanină în celulele melan-a tratate cu compuși purificați și identificați. Celulele Melan-a au fost tratate timp de 72 de ore cu compușii 1 și 2 la concentrații cuprinse între 0 și 80 uM, iar viabilitatea celulară a fost evaluată printr-un kit de analiză a viabilității celulare CCK-8. Viabilitatea celulară a compuşilor 1 şi 2 la o concentraţie de 80 pM pentru celula melan-a a fost de peste 98,1%, respectiv 97,8% (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate au indicat că compușii 1 și 2 au o natură necitotoxică. Efectul activităților anti-melanogenice ale compușilor este prezentat în Figura 3. Inhibarea sintezei de melanină a compusului 1 la 20, 40 și 80 pM a fost de 8,4%, 15,6% și 37,0% comparativ cu martor. Compusul 2 a prezentat o activitate inhibitoare ușor mai mică decât compusul 1 la 7,6%, 12,8% și 17,8% la 20, 40 și, respectiv, 80 pM. Ambii compuși au inhibat sinteza melaninei într-o manieră dependentă de doză.

În special, compusul 1 a prezentat cea mai mare activitate inhibitoare a melaninei, 37,0 procente la o concentrație de 80 µM. Se pare că extractul de radix ginseng la 0–1000 µg/mL nu a prezentat nicio inhibare semnificativă a melaninei [19], iar acidul cinamic, un agent de albire găsit în principal în P. ginseng, a arătat o inhibare de 29% a sintezei melaninei la 675 µM. [20]. În comparație cu extractul de radix ginseng și acid cinamic, compusul 1 a prezentat o activitate inhibitoare puternică a sintezei melaninei și chiar a prezentat o activitate inhibitorie de 1,2-ori mai mare a sintezei melaninei la o concentrație de opt ori mai mică în comparație cu acidul cumaric [ 17,20].

Peștele-zebră este un model de organism vertebrat foarte avantajos datorită sistemelor sale de organe și secvențelor genice similare cu ființele umane [25]. În plus, utilizarea embrionilor de pește-zebră primește o atenție din ce în ce mai mare, deoarece aceștia sunt considerați o metodă de înlocuire pentru experimentele pe animale [26]. Peștii zebra au pigmenți de melanină la suprafață, permițând observarea simplă a procesului de pigmentare fără proceduri experimentale complicate [27].

Astfel, am investigat efectele inhibitoare ale melaninei ale compusului 1 asupra pigmentării peștilor zebra. Am folosit PTU (N-feniltiouree; un inhibitor de tirozinază care conține sulf) ca control pozitiv (Figura 4B), care este utilizat pe scară largă în cercetarea peștilor zebra [28,29]. După cum se arată în Figura 4C, D, 40 și 80 uM, tratamentul cu compusul 1 a produs o inhibare remarcabilă a pigmentării corpului peștelui zebra, care a scăzut remarcabil conținutul total de melanină în comparație cu vehiculul de control (Figura 4A).

În acest studiu, am izolat noua ginsenozidă Rh23 (1) din frunzele hidroponice de P. ginseng. Astfel, au fost raportate peste 100 de ginsenozide din speciile de ginseng. Cu toate acestea, 25-ginsenozidele hidroxilate apar rar în natură, inclusiv în plantele de ginseng. În plus, activitatea de albire nu a fost raportată. Activitatea inhibitoare a ginsenozidei Rh23 a arătat 37% la o concentrație de 80 uN fără citotoxicitate celulară în celulele melan-a, în timp ce nu a fost observată nicio inhibare a activității tirozinazei ciupercilor in vitro de către ginsenozida Rh23 (datele nu sunt prezentate). Recent, extractele sau ginsenozidele purificate din rădăcinile și frunzele de ginseng s-au dovedit că posedă pe scară largă proprietăți antioxidante (30,31), în timp ce apa sau extractul organic de ginseng au prezentat activități de captare a DPPH, anion superoxid și radical hidroxil (32). Prin urmare, noul nostru ginsenozid Rh23 izolat din frunzele de P. ginseng hidroponic poate avea tirozinaza reglată în jos prin proprietatea sa antioxidantă. Cu toate acestea, rolul său în melanogeneză nu a fost încă investigat. Prin urmare, în studii suplimentare, este necesar să se determine mecanismele precise ale acțiunii ginsenozidei Rh23 asupra reglarii sintezei melaninei.

3. Experimental

3.1. General

Pentru cromatografia pe coloană au fost utilizate rășini Kieselgel 60 și LiChroprep RP-18 (Merck, Darmstadt, Germania). Kieselgel 60 F254 (Merck) și RP-18 F254S (Merck) au fost utilizate ca faze solide pentru experimentul TLC. Detectarea petelor de pe placa TLC a fost efectuată prin observare sub o lampă UV (Spectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, SUA) sau prin pulverizarea cu 10% H2SO4 apos pe soluția dezvoltată. placa urmata de incalzire. Rotațiile optice au fost măsurate folosind un polarimetru digital JASCO P-1010 (Tokyo, Japonia). Punctele de topire au fost obținute folosind un aparat Fisher-Johns Melting Point (Fisher Science Company, Pittsburgh, PA, SUA) cu un microscop. Spectrele ultraviolete au fost măsurate cu un spectrofotometru UV-1601 Shimadzu (Shimadzu Corp., Kyoto, Japonia). Spectrele IR au fost obținute de la un spectrometru FT-IR Perkin Elmer Spectrum One (Buckinghamshire, Marea Britanie). Spectrele RMN au fost înregistrate pe un spectrometru Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, SUA). Analiza UPLC-QTOF/MS a fost efectuată utilizând o serie Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, SUA) care funcționează în modul ion negativ.

3.2. Materiale vegetale

Ginsengul hidroponic Panax a fost cultivat în sera Departamentului de Cercetare a Culturii pe Ierburi situat în Eumseong, provincia Chungbuk, conform protocolului „ghidului standard de cultivare pentru ginseng GAP” [11,33] elaborat de Administrația pentru Dezvoltare Rurală, Republica Coreea. Rădăcinile de răsaduri de ginseng de un an, cântărind 0,8 până la 1 g au fost achiziționate de la Departamentul de Cercetare a Culturilor pe Ierburi, Institutul Național de Horticultura și Științe din Ierburi (NIHHS), Administrația pentru Dezvoltare Rurală (RDA) și depozitate într-un camera la temperatură scăzută (1–2 ◦C) înainte de utilizare. Rădăcinile răsadurilor de ginseng au fost transplantate în băi de nutrienți și cultivate în sistem hidroponic. După trei luni de cultură, ginsengurile hidroponice au fost scoase pentru recoltare. Plantele de ginseng hidroponic recoltate au fost spălate de praf cu apă și sortate în frunze și rădăcini, care au fost apoi uscate timp de 72 de ore într-un uscător prin congelare (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Coreea). Un exemplar de voucher (NIHHS14-03) a fost depus la herbarul Departamentului de Cercetare a Culturii pe Ierburi, NIHHS, RDA, Eumseong, Republica Coreea.

3.3. Extracție și izolare

Frunzele uscate și pulverizate de P. ginseng hidroponic (HPGL, 6 kg) au fost extrase cu 80% MeOH (30 L × 3) la temperatura camerei timp de 24 de ore. Extractele au fost filtrate prin hârtie de filtru și evaporate sub presiune redusă la 45 °C pentru a se obține 1,4 kg de extract. Extractul a fost turnat în H2O (3 L) și extras cu EtOAc (3 L × 3) și n-BuOH (2,6 L × 3), succesiv. Fiecare strat a fost concentrat sub presiune redusă pentru a obţine fracţii EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) şi H20 (855 g).

Fracția n-BuOH (HPGLB, 130 g) a fost aplicată pe coloana de silicagel (φ 13 × 17 cm) și a fost eluată cu CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) pentru a produce 20 fracții (HPGLB1 la HPGLB20). Fracțiile HPGLB3 și HPGLB4 au fost combinate (18,9 g, Ve/Vt=0.05–{0,12) și fracționate în continuare pe coloana de silicagel (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) pentru a produce 14 fracții (HPGLB3-1 la HPGLB3-14). Fracțiile HPGLB3-4 și HPGLB{3-5 au fost combinate (1,27 g, Ve/Vt {{4{0}},09–0,16) și fracționate în continuare pe coloana ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) pentru a produce nouă fracții (HPGLB3-4-1 la HPGLB{3-4-9). Fracția HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0,14–0,26) a fost fracționată în continuare pe coloana ODS (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) pentru a produce nouă fracții (HPGLB3-4-3-1 la HPGLB{3-4-3-9) inclusiv compusul 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0,42–0,55, TLC Rf=0,40 (RP{-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Fracțiile HPGLB5 la HPGLB7 au fost combinate (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22) și fracționate în continuare pe coloana de silicagel (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) pentru a produce 16 fracții (HPGLB5-1 la HPGLB5-16). Fracția HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt {= 0.28–0,31) a fost fracționată în continuare pe coloana ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3: 2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) pentru a produce zece fracții (HPGLB5-6-1 la HPGLB{5-6-10), inclusiv compusul 2 (HPGLB{5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP{-18 F254S, MeOH–H2O {= 2:1), Rf {= 0}.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Date spectroscopice

Compusul 1. Pulbere albă, p.t.: 138–140 °C; [] 25 D plus 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (fereastră CaF2): 3377, 2932, 1382 cm-1; QTOF/MS negativ m/z 713,44723 [M plus COOH]- (calculat pentru C37H64O10, 668,4499); Date 1H- și 13C-RMN, vezi Tabelul 1.

Compusul 2. Pulbere albă, p.t.: 133–136 °C; [] 25 D plus 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (fereastră CaF2): 3359, 2929, 1384 cm-1; QTOF/MS negativ m/z 699,48311 [M plus COOH]- (calculat pentru C36H62O10, 654,4323); date 1H- și 13C-RMN, vezi Tabelul 1.

3.5. Analiza cantitativă a noului compus 1 utilizând UPLC-QTOF/MS

O soluție stoc standard de compus 1 a fost preparată prin dizolvarea a 1,00 mg fiecare în 1 mL metanol pentru a produce o concentrație de 1,{00 mg/mL și a fost menținută la 4 ◦C. Soluția stoc standard (1) a fost diluată cu metanol pentru a obține soluții de calibrare cu intervale de 0.{{10}}2–0,8 µg/mL, respectiv. Un gram de extract HPGL a fost cântărit cu precizie și dizolvat în volume fixe (10 mL) de metanol, filtrat printr-o hârtie de filtru de 0,2{0 mm și refrigerat la 4 ◦C . UPLC a fost efectuată utilizând un UPLC Waters ACQUITY H-Class (Waters Corp., Milford, MA, SUA) cu o coloană ACQUITY BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Fazele mobile au constat din apă (A) cu 0,1% acid formic (v/v) și acetonitril (B) cu 0,1% acid formic (v/v). Gradientul de eluare a fost după cum urmează: 0–4 min, B 10–30 la sută; 4–15 min, B 30–60 la sută; 15–16 min, B 60–100 la sută; 16–19 min, B 100–10 la sută . Debitul a fost de 0,45 mL/min, iar volumul de injectare a fost de 2 uL pentru fiecare cursă.

Apoi, analiza HR-MS a fost efectuată utilizând un Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, SUA) care funcționează în modul ion negativ. Spectrometrele de masă au efectuat scanări alternante de înaltă și joasă energie cunoscute sub numele de modul de achiziție MSE. Măsurătorile precise ale masei au fost obținute utilizând un sistem de livrare automatizat de calibrare care conține leucină encefalină, m/z 554,262 (mod ESI neg.) ca referință internă. Parametrii optimi de funcționare au fost setați așa cum se arată în Tabelul 3.

3.6. Cultură de celule

Melanocitele Melan-a sunt o linie celulară normală de melanocite murine foarte pigmentate, imortalizate, derivate de la șoareci C57BL/6. Celulele melan-a utilizate în acest studiu au fost obținute de la dr. Dorothy Bennett (Spitalul St. George, Londra, Marea Britanie). Celulele au fost cultivate la 37 °C într-o atmosferă de 95% aer, 10% CO2 în mediu RPMI 1640 suplimentat la o concentrație finală cu 10% ser fetal bovin inactivat termic, 1% penicilină/streptomicina și 200 nM PMA. Viabilitatea celulară a fost determinată de trusa de numărare a celulelor CCK-8-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japonia).

3.7. Testul Melaninei

Celulele Melan-a au fost tratate cu compuși timp de 72 de ore și apoi celulele au fost dizolvate în NaOH 1 N la 60 °C timp de 30 de minute. Apoi, lizatele au fost măsurate la 450 nm folosind un spectrofotometru. Datele au fost normalizate la conținutul de proteine ​​din lizatele celulare. Lizatele celulare au fost ulterior procesate pentru determinarea concentrației de proteine ​​folosind un kit de analiză a proteinei BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, SUA).

3.8. Originea și întreținerea peștilor parentali

Peștii zebră adulți au fost obținuți de la un dealer comercial și 10–15 pești au fost ținuți într-un rezervor acrilic de 5 L în următoarele condiții: 28,5 ◦C, cu un ciclu lumină/întuneric de 14/10 ore. Peștii zebră au fost hrăniți de trei ori pe zi, șase zile pe săptămână, cu hrană în fulgi TetraMin suplimentată cu creveți de saramură vii (Artemia salina). Embrionii au fost obținuți din depunerea naturală a icrelor care a fost indusă dimineața prin aprinderea luminii. Colectarea de embrioni a fost finalizată în 30 de minute. Toate protocoalele și procedurile experimentale au fost aprobate și efectuate în conformitate cu ghidurile și regulamentele aprobate ale Comitetului de etică a animalelor al Universității Naționale Chungnam (CNU-00866).

3.9. Tratamentul compușilor și evaluarea bazată pe fenotip

Embrionii sincronizați au fost colectați și aranjați cu pipetă (7-9 embrioni per godeu în plăci de godeuri 24-conținând 1 ml de mediu embrionar). Compușii de testat au fost dizolvați în 0,1% DMSO și apoi adăugați în mediul embrionar de la nouă la 72 ore post-fertilizare (hpf) (63 ore de expunere). Efectele asupra pigmentării peștilor zebră au fost observate la stereomicroscop. Agitarea ocazională, precum și o înlocuire a mediului, au fost efectuate zilnic pentru a asigura distribuția uniformă a compușilor. În toate experimentele, a fost folosită 0,2 mM 1-fenil-2-tiouree (PTU) pentru a genera pește-zebra transparent fără a interfera în procesul de dezvoltare [33] și a fost considerat un control pozitiv standard. Evaluările pe bază de fenotip ale pigmentării corpului au fost dechorioonate cu forceps, anesteziat în soluție de tricaină metansulfonat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), montat în 3% metilceluloză pe o farfurie de 35 mm (SPL Lifesciences, Pocheon, Coreea), și fotografiat sub stereomicroscopul MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania).

4. Concluzii

În acest studiu, ginsenozidul Rh23 (1) a fost izolat din frunzele hidrofonice de ginseng Panax împreună cu 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroxidamar{10}}enă (2). În general, am avut succes în încercarea noastră de a obține efectul hipopigmentar al compușilor din P. ginseng hidroponic. Ginsenozid Rh23 și 20-O- -D-glucopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentahidroxidamar23-ene au activități inhibitorii asupra biosintezei melaninei fără efecte citotoxice în celula melan-a. În plus, ginsenozidul Rh23 a îmbunătățit depigmentarea peștelui zebra ca model animal alternativ. Scăderea conținutului de melanină și a pigmentării în organism poate avea potențialul de activitate de albire, iar efectul non-citotoxic este punctul mai favorabil, deoarece siguranța este un aspect primordial pentru agenții de albire din produsele cosmetice.

Astfel, pe baza rezultatelor noastre actuale, este important ca noi compuși hidrofonici de P. ginseng să poată fi utilizați ca un potențial agent eficient de iluminare a pielii. Studiile ulterioare vor elucida mecanismele precise ale acțiunii ginsenozidei Rh23 asupra reglarii sintezei melaninei și relația dintre caracteristicile structurale ale ginsenozidei Rh23 și melanogeneză, pentru a stabili dacă este un potențial agent de albire pentru industria cosmetică. Avantajele spectrometriei de masă hibride Q-TOF includ nu numai capacitatea de detectare a calității și sensibilitatea, ci și măsurarea precisă, facilitând elucidările structurale. Poate fi folosit pentru determinarea calitativă și cantitativă a compușilor minori sau noi, ceea ce ajută la îmbunătățirea controlului calității condimentelor de ginseng.

Materiale suplimentare:

Spectrele 1H-RMN și 13C-RMN de 1 sunt disponibile în materialele suplimentare.

Mulțumiri:

Această activitate a fost realizată cu sprijinul „Programului de cercetare cooperativă pentru dezvoltarea științei și tehnologiei agriculturii” (PJ01136203), Administrația pentru Dezvoltare Rurală, Republica Coreea. Îi mulțumim lui Cheol-Hee Kim (Universitatea Națională Chugnam) pentru că a împărtășit facilitatea de pește zebra.

Contribuții ale autorului:

DYL și N.-IB au conceput și proiectat experimentele; H.-GK şi Y.-GL au izolat compuşii; DYL a elucidat structurile; I.-BJ a contribuit la pregătirea materialelor vegetale; JHK a efectuat testul biologic și a ajutat la pregătirea manuscrisului; JWL și B.-RC au efectuat RMN-urile și UPLC-QTOF/MS ale probelor; G.-SK a asistat la revizuirea manuscrisului; iar DYL a scris lucrarea și a gestionat proiectul de cercetare. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Conflicte de interes:

Autorii declară că nu există conflicte de interese. Sponsorii fondatori nu au avut niciun rol în proiectarea studiului; colectarea, analizele sau interpretarea datelor; scrierea manuscrisului; sau decizia de a publica rezultatele.

Referințe

1. Ben, EW; Michael, W. Plante medicinale ale lumii. În Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, SUA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Activitățile biologice și chimia saponinelor din Panax ginseng CA Meyer. Phytochemistry 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Efectul de îmbunătățire a sistemului imunitar al ginseng-ului de munte, al ginseng-ului cultivat de munte și al ginseng-ului Panax. J. Orient. Neuropsihiatrie 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Farmacologia ginsengului Panax: O legătură de oxid nitric? Biochim. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Efectul extractului de metanol de ginseng solar asupra leziunilor hepatice induse de lipopolizaharide la șobolani. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Efectele compusului K asupra hiperglicemiei și rezistenței la insulină la șobolani cu diabet zaharat de tip 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Efectele ginsenozidei Rg3 și Rh2 asupra proliferării celulelor canceroase de prostată. Arc. Farmacă. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Proprietățile afrodisiace și adaptogene ale ginsengului. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Activitățile antioxidante și antitumorale ale extractului metanolic de ginseng prelucrat termic. Rac Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Nu, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Efectele produselor naturale bioactive asupra creșterii și conținutului de ginsenozide al ginsengului Panax cultivat într-un sistem aeroponic. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Comparație între conținutul de ginsenozid și ingrediente fenolice din frunzele, fructele și rădăcinile de ginseng cultivate hidroponic. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Studii ale medicamentelor pentru cuticule din surse naturale. II. Efectele inhibitoare ale plantelor Prunus asupra biosintezei melaninei. Biol. Farmacă. Taur. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Efectul nitritului de sodiu, clorurii de sodiu și nitratului de sodiu asupra germinării și creșterii sporilor anaerobi. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Un nou stilben cu activitate inhibitoare a tirozinazei de la Chlorophora excelează. Chim. Farmacă. Taur. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Parc, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: Un nou inhibitor de melanogeneză și mecanismul său. Celulă. Mol. Viața 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Fiul, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Efectele inhibitoare ale acidului cinamic asupra biosintezei melaninei în piele. Biol. Farmacă. Taur. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Analiza cantitativă a compușilor fenolici din diferite părți ale Panax ginseng CA Meyer și efectul său inhibitor asupra biosintezei melaninei. coreean J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Efectul radix ginseng și radix trichosanthis asupra melanogenezei. Biol. Farmacă. Taur. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Comparația conținutului de compuși fenolici între ginseng alb și roșu și efectul lor inhibitor asupra biosintezei melaninei. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Song, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Analiza ginsenozidelor cu polar scăzut în ginseng Panax aburit la temperatură înaltă prin HPLC-ESI-MS/MS. Chim. Res. Bărbie. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Transformări chimice induse de abur și evaluarea holistică a calității ginseng-ului roșu derivat din ginseng Panax utilizând amprenta digitală de cuantificare multicomponentă bazată pe HPLC-ESI-MS/MSn. J. Agric. Food Chim. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MEA; Yang, B.; Jin, YR Trei noi saponine triterpenice de tip dammarane din frunzele de Panax ginseng CA Meyer. J. Asiatic Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Comprehensive HILIC x RPLC cu detecție prin spectrometrie de masă pentru analiza saponinelor în Panax notoginseng. Analist 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Dragoste, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Tehnologie pentru ecran de mare randament: prezentul și viitorul folosind peștele zebra. Curr. Opinează. Biotehnologia. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Embrionii de pește-zebră ca alternativă la experimentele pe animale - Un comentariu asupra definiției debutului etapei de viață protejate în reglementările privind bunăstarea animalelor. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish ca un nou model pentru screening-ul bazat pe fenotip al compușilor regulatori melanogenici. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Feniltioureea perturbă funcția tiroidiană în dezvoltarea peștilor zebra. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Nu, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Potențialul ginsenozidelor minore izolate din frunzele de Panax ginseng ca inhibitori ai melanogenezei. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Omule, saponinele RY Panax quinquefolium protejează lipoproteinele cu densitate joasă de oxidare. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenozide în rădăcinile și frunzele de ginseng american. J. Agric. Food Chim. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Proprietăți antioxidante ale diferitelor extracte de solvenți din frunzele de ginseng sălbatic. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Institutul Național de Știința Culturii. Ghinseng GAP Standard Cultivation Guideline; Institutul Național de Știința Culturii, Administrația pentru Dezvoltare Rurală: Suwon, Coreea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Generarea de pește-zebra transparent: O metodă rafinată pentru a îmbunătăți detectarea expresiei genelor în timpul dezvoltării embrionare. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Disponibilitatea eșantionului:

Probele de compuși 1 și 2 sunt disponibile de la autori.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 și Nam-In Baek 2,*

1 Departamentul de Cercetare a Culturilor pe bază de Ierburi, Institutul Național de Horticultură și Științe din Ierburi, RDA, Eumseong 27709, Coreea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Departamentul de Biotehnologie de Medicină Orientală, Universitatea Kyung Hee, Yongin 17104, Coreea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Primit: 28 noiembrie 2017; Acceptat: 26 ianuarie 2018; Publicat: 29 ianuarie 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com