Boala de rinichi: Cum induce nichelul autofagia în rinichi?

Pentru mai multe informații:Ali.ma@wecistanche.com

Partea Ⅰ:Nichelul induce autofagia prin căile PI3K/AKT/mTOR și AMPK în rinichiul de șoarece

Heng Yin, Zhicai Zuo și colab.

1. Introducere

Nichel(Ni), un element natural, este distribuit pe scară largă în compartimentele de mediu, inclusiv sol, apă și aer (Schrenk et al, 2020). Ni (Nichel)compuși și Ni metalic (Nichel)au multe aplicații industriale și comerciale, cum ar fi producția de aliaje, galvanizarea, bateriile cu nichel-cadmiu și catalizatorul în industria chimică și alimentară (Genchi et al., 2020). Cu toate acestea, vasta utilizare industrială a Ni (Nichel)conduce la o poluare pe scară largă a mediului, ceea ce crește riscul expunerii umane la Ni prin alimente și apă potabilă (Das et al, 2018). Deși Ni (Nichel) este un micronutrient esențial pentru oameni și animale, supraexpunerea la Ni este extrem de periculoasă pentru sănătatea umană (Das et al., 2018).

Odată cu creșterea incidenței Ni (Nichel)contaminarea în ultimii ani, toxicologia cu Ni, inclusiv imunotoxicitatea, hepatotoxicitatea, nefrotoxicitatea și toxicitatea pulmonară, a atras o atenție tot mai mare (Gathwan și colab., 2013; Deng și colab., 2016; Hasanein și Felegari, 2017; Guo și colab., 2020a). 2020b). Therinichi, ca un organ țintă important în Ni (Nichel)toxicologie, cu acumulare de Ni (Nichel)și Ni (Nichel)compușii din acesta prin expunere cronică pot induce leziuni renale semnificative (Elangovan și colab., 2018). Cercetările existente ale echipei noastre de cercetare au demonstrat inducerea stresului oxidativ, apoptozei, inflamației și opririi ciclului celular înrinichide pui de carne de NiCl2 (Nichelclorura 2) în alimente care depășesc 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a,2016b). Mai multe studii au sugerat că mecanismul toxicologiei renale Ni include deteriorarea oxidativă, ruperea catenei ADN și apoptoza (Lee și colab., 2001; Chen și colab., 2010).

Jucând un rol crucial în homeostazia celulară,autofagies-a descoperit că are o asociere cu incidența și patogeneza diverselor boli (Martin și colab., 2019). Studii recente au arătat că moartea celulară poate fi intermediată prin scăderea sub control sau suprastimulareaautofagie(Denton și Kumar, 2019). Ca proces intracelular complex și foarte ordonat,autofagieîncepe de la formarea veziculelor cu membrană dublă cunoscute sub numele de autofagozomi care înghit o parte din citosol și organele (Martin și colab., 2019). Ulterior, autofagozomii participă la proteoliza substanțelor înghițite după trecerea la lizozomi.

Autofagieeste sensibil la diferite tipuri de stres celular, cum ar fi deprivarea factorului de creștere sau de nutrienți, hipoxia, deteriorarea ADN-ului, speciile reactive de oxigen (ROS), agregarea proteinelor, agenții patogeni intracelulari sau deteriorarea organelelor (Dodson et al, 2013). Este un proces extrem de complex de reglementatautofagie, care implică o mulțime de căi de semnalizare, inclusiv protein kinaza activată de adenozin monofosfat (AMPK), fosfatidilinozitol 3-kinaza-I (PI3K) și căile țintă a rapamicinei de mamifere (mTOR) (Cao et al2021). Și, calea mTOR are un efect esențial înautofagieiniţiere. Activitatea mTOR este un punct de control central alautofagie, al cărui efect inhibitor duce la defosforilarea ameliorării ULK1autofagieinhibiție (Parzvch și Klionsky, 2014). În plus, PI3K/Akt și AMPK sunt principalii regulatori din amonte ai mTOR (Gong și colab., 2020; Xu și colab., 2020). Cercetările anterioare au sugerat că metalele grele (cum ar fi Cd, Hg, Cu și Pb) pot induce aparițiaautofagie(Su et al, 2017). Deși Huang și colab. (2016) și Son și colab. (2017) au constatat că Ni (Nichel)expunerea ar putea induce eficientautofagieîn celulele epiteliale bronșice, mecanismul precis este încă neclar,

Efectul Ni (Nichel)peautofagiea fost raportată rar și doar câteva studii sunt disponibile despre efectele Ni asupra rinichilorautofagiede șoareci in vivo. Prin urmare, lucrarea actuală își propune să confirme dacă NiCl2 (Nichelclorura 2)tratamentul poate induceautofagieși pentru a evalua mecanismul potențial al NiCl (Nichelclorură)-induseautofagie, inclusiv căile AMPK și PI3K/AKT/mTOR.

Nichelul afectează rinichii și provoacă boli de rinichi

Faceți clic pe Cistanche pentru boală de rinichi

2. Materiale și metode

2.1. Produse chimice și anticorpi

Nichelclorură(NiCl) a fost furnizat de Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (Chengdu, China). În analiza imunoblot, toți anticorpii au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (CST, SUA), inclusiv lanțul ușor 3B(LC3B)(Cat nr.43566T), anti-iepure p62(SQSTM1)(Cat proteina asociată microtubulilor anti-iepure). nr.5114D), anti-iepure Beclin1 (Cat nr.3495T), anti-iepureautofagieproteină înrudită12 (Atg12)(Nr. cat.4180T), Atg5 anti-iepure(Nr.12994T),Atg16L1 anti-iepure(Nr.8089T), Atg7 anti-iepure (Nr.8558T),Atg3 anti-iepure ( Cat nr. 3415T), anti-iepure țintă a rapamicinei mamifer (mTOR) (Cat nr. 2983T), anti-iepure p-mTOR (Cat nr. 5536T), anti-iepure unc-51 asemănător kinazei 1 (ULK1) )(Cat nr.8054D), anti-iepure p-UIK1(Cat nr.5869T), anti-iepure PI3K(Cat nr.4292S),anti-iepure p PI3K(Cat nr.4228T,anti-iepure Akt(Cat nr. .9272S), anti-iepure p-Akt (nr. cat. 4060T), anti-iepure mTOR (nr. cat. 2972S), anti-iepure p-mTOR (nr. cat. 5536S), anti-iepure AMPK (nr. cat. 5831S ), anti-iepure p-AMPK (Nr. Cat. 2535S) și -actină (Nr. Cat. 4970T).

2.2.Animale și tratamente

Compania Dashuo Biological Technology (Chengdu, China) furnizează în total 160 de șoareci ICR masculi sănătoși de opt săptămâni. Toate animalele au fost ținute în condiții constante (temperatură 25±2C;12-h ciclu lumină-întuneric) în medii aseptice și hrănite cu dietă standard cu pelete și apă ad libitum. Șoarecii au fost clasificați în patru grupuri aleatoriu, fiecare conținând patruzeci de microfoane după aclimatizarea timp de șapte zile. Apa distilată a fost administrată intragastric martorului, în timp ce Ni (Nichel)(NiCl2 (Nichelclorura 2).6H2O) cu doze de 7,5, 15 și 30 mg/kg a fost furnizat intra-gastric pentru animalele din loturile experimentale. Ni-ul adoptat aici a fost determinat în funcție de valoarea dozei letale medii (DL50, 306,11 mg/kg) atinsă în cercetarea privind toxicitatea orală acută a șoarecilor masculi. NiCl (Nichelclorură),.6HZO a fost diluat folosind apă distilată înainte de efectuarea experimentelor. Cele patru grupuri au fost administrate cu o doză de gavaj de 1 ml per 100 g greutate corporală o dată pe zi timp de 28 de zile. După tratament timp de 14 și 28 de zile, toate animalele au fost sacrificate în mod uman pentru a le colectarinichimostre pentru analiză în secțiunile de mai jos. Toate animalele experimentale și procedurile au fost efectuate în urma acordului care a primit aprobarea de la Comitetul pentru îngrijirea animalelor și de etică din cadrul Universității Agricole din Sichuan (Nr. de aprobare:2012-024, Chengdu, China).

2.3. Determinarea indicelui și funcțiilor rinichilor

Toți șoarecii au fost cântăriți în fiecare săptămână și sacrificați în mod uman la terminarea tratamentului și apoirinichiau fost tăiate și cântărite. Therinichiindicele utilizat a fost un raport întrerinichigreutatea și greutatea corporală.

Cercetătorii au măsurat azotul ureic din sânge (BUN) și nivelurile de creatinine serice (CRE) urmând instrucțiunile truselor comerciale produse de Institutul de Bioinginerie Naniing Jiancheng din China (Nanjing, China),

2.4. Determinarea acumulării renale de Ni (Nichel)

Rinichiprobele au fost prelevate în a 28-a zi în timpul experimentului. Apoi, 1 mL HCIO și 9 mL HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co.,Ltd., China) au fost folosite pentru a digera umedă 0.5 g de probe timp de 24 de ore în tuburi cu rezistență la temperatură ridicată. Apoi, aceste tuburi au fost puse pe o placă fierbinte pentru a evapora tot lichidul, urmată de suspendarea reziduului folosind 1 0 mL 0,1 M/L HNO. Ulterior, cercetătorii au analizat mostre în termeni de Ni (Nichel)cu ajutorul unui spectrofotometru de absorbție atomică cu flacără (AAS700, PerkinElmer, SUA).

2.5. Observare histopatologică și ultrastructură

După ce a fost colectat și apoi fixat în paraformaldehidă 4 procente,rinichiprobele au fost deshidratate cu alcool, încorporate în parafină, tăiate la 5 um și prelucrate pentru a se colora cu hematoxilină și eozină. O cameră digitală (Nikon DS-Ri1, Japonia) a fost folosită pentru a observa feliile și pentru a face fotografii pentru modificări histopatologice. Zece câmpuri microscopice din fiecarerinichiau fost revizuite. Imaginile afișate în lucrare au fost cele reprezentative.

Pentru evaluarea ultrastructurală, s-a aplicat glutaraldehidă 2,5% pentru fixarerinichițesuturi (aproximativ 1 mm5) la temperatura camerei. Aceasta a fost urmată de post-fixarea acestor țesuturi în tetroxid de osmiu 1%, deshidratat în acetonă și încorporat în rășină epoxidică. Feliile ultra-subțiri pregătite au fost puse pe grile de cupru și apoi colorate folosind acetat de uranil și acetat de plumb. Imaginile ultrastructurii au fost capturate folosind un microscop electronic cu transmisie flash JEM-1400(JEOL, Japonia).

reface si imbunatateste functia renala: cistanche

2.6. Imunohistochimice

După ce au fost deparafinate folosind xilen, feliile de parafină au fost rehidratate folosind un set gradat de soluție de etanol. Aceasta a fost urmată de spălare cu apă distilată și PBS și blocarea timp de 15 minute a activităților peroxidazei endogene (EPA) prin incubare folosind 3% H,O. în metanol pentru stingerea EPA. Pentru a facilita recuperarea antigenului, am tratat feliile prin încălzire cu microunde timp de 15 minute în 0.0Tampon citrat de sodiu 1 M cu pH de 6,0. După ce au fost saturate cu ser normal de capră 10% timp de 30 de minute, feliile au fost apoi incubate folosind anticorpi primari peste noapte la 4 grade. Anticorpul secundar IgG anti-iepure/șoarece biotinilat de capră 1% (Boster, Wuhan, China) a fost folosit pentru a incuba felii spălate cu PBS la 37 de grade timp de 1 oră, iar apoi la 37 de grade, complexul streptavidină-biotină (SABC;Boster). , Wuhan, China) a fost utilizat timp de 30 de minute. Aceasta a fost urmată de imersarea feliilor în clorhidrat de diaminobenzidină (DAB; Boster, Wuhan, China) pentru vizualizarea imunoreacției. În final, după contracolorare ușoară cu hematoxilină, feliile au fost deshidratate cu etanol, curățate cu xilen și montate, succesiv.

Densitatea optică integrată (IOD) a fost utilizată pentru cuantificarea nivelurilor de proteine ​​ale LC3B și p62. Metoda analitică pentru valoarea IOD s-a referit la Fanget al. (2018). Pentru realizarea imaginilor a fost adoptat un sistem de cameră digitală cu microscop Nikon DS-Ril (Japonia). Cercetătorii au selectat apoi cinci câmpuri (0.064 mm²) în fiecare zonă de imagini din fiecare secțiune pentru analiză cu ajutorul software-ului Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, SUA ).

2.7. Western blot

Extracția proteinelor dinrinichiprobele au fost efectuate utilizând tampon de liză RIPA, iar reactivul de analiză a proteinei BCA (P0010S, Beyotime Technology, China) a fost utilizat pentru măsurarea concentrației. SDS-PAGE a fost apoi efectuat pentru probe de proteine, care au fost transferate ulterior pe membranele de nitroceluloză. Blocate folosind lapte degresat 5% timp de 1 oră la temperatura camerei, membranele au fost incubate cu anticorp primar la 4 grade peste noapte. După utilizarea anticorpului secundar conjugat cu peroxidază de hrean pentru incubare timp de 1 oră, a fost folosit un Chemidoc XRS pentru a detecta benzile proteice pe membrane folosind kitul ECL (P0018A, Beyotime Technology, China).

2.8. Reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qRT-PCR)

Rinichiau fost luate și măcinate cu azot lichid într-un mortar folosind un pistil și apoi conservate la temperatură scăzută (-80 grade), ARN-ul total renal a fost extras folosind RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japonia) urmând recomandările de la producatorul. Aceasta a fost urmată de sinteza ADN-ului complementar (ADNc) cu un kit de reactivi RR047A Prim-ScriptTM RT produs de Takara în Japonia, urmând instrucțiuni. Ulterior, qRT-PCR a fost efectuată prin utilizarea unui sistem PCR în timp real LightCycler ⑩ 480 (Bio-Rad, SUA) și a unui kit SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Japonia). Primerii utilizați pentru o PCR sunt enumerați în Tabelul 1. -actina a fost utilizată pentru normalizarea expresiei genelor, iar expresia relativă a ARNm a fost calculată prin metoda 2-4ac (Livak și Schmittgen, 2001).

2.9. analize statistice

Datele au fost exprimate sub formă de medie ± abatere standard și analizate prin LSD sau analiza varianței T3 a lui Dunnett. Software-ul SPSS (versiunea 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, SUA) a fost utilizat pentru toate analizele statistice pentru Windows. P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tabelul 1: Secvența de primeri utilizați în studiu,

3. Rezultate

3.1.NiClz (Nichelclorură)afectează funcția renală

După cum se arată în Fig.1A, greutatea corporală a scăzut în trei grupuri tratate cu NiCl2 (Nichelclorura 2). Și, o scădere semnificativă a fost găsită și în greutatea relativă arinichi(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

CRE și BUN serice au fost utilizați ca biomarkeri standard pentru funcția renală. Rezultatele funcției renale au fost afișate în Fig.1C și D, iar concentrațiile de CRE și BUN au fost semnificativ crescute (P<0.05)in the=""> (Nichelclorura 2)-grupe de tratament in zilele 14 si 28 rude la martor.

Fig.1E a arătat că cei trei Ni (Nichel)grupurile de tratament au concentrații semnificativ mai mari de Ni în rinichi (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Nichelclorură)- induce variatii histopatologice ale rinichilor

Fig.2 arată că NiClz (Nichelclorură)tratamentul a determinat variații histopatologice alerinichicu doze și timp, implicând glomerul umflat împreună cu spațiu capsular îngustat, vacuolar și degenerare granulară în epiteliul tubular renal.

Fig. 2. NiCl2 (Nichelclorura 2)induce modificări histopatologice în rinichi.

Leziunile histopatologice au inclus glomerul umflat împreună cu spațiu capsular îngustat (*), degenerare vacuolară (săgeți negre) și degenerare granulară (săgeți albe) în epiteliile tubulare renale. Colorare HE, bară de scară=50 µm.

3.3.NiCl (Nichelclorură)induce autofagia și crește genele și proteinele legate de autofagie în rinichi

LC3 și p62 sunt biomarkerii cruciali aiautofagie(Gomez-San-chez et al..2016). În comparație cu controlul, cele trei NiCl2 (Nichelclorura 2) grupurile de tratament au fost martorii unei creșteri semnificative a nivelului proteic al LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autofagieeste, de asemenea, determinarea de către TEM în acest studiu. După cum se arată în Fig, 3F, observațiile TEM au arătat că numărul de autolizozomi a fost crescut în țesutul renal după NiCl2 (Nichelclorura 2)expunere.

Fig. 3. NiCl2 (Nichelclorura 2)crește autofagia în rinichiul șoarecilor.

(A) Rezultatele Western blot ale LC3 și p62. (B, C) Cuantificarea LC3-II/I și p62. (DE) Expresia ARNm a LC3 și p62. (F)

Structura ultrastructurală a celulei epiteliale a tubului contort proximal (figurele din dreapta arată mărirea parțială a figurilor din stânga; săgețile negre indicând structuri autolizozomale).

Valorile sunt prezentate cu mediile ± abaterea standard (n {{0}}). Coloanele marcate cu litere diferite sunt diferențe semnificative (P <>

În plus, imunohistochimia a fost utilizată pentru măsurarea nivelurilor de proteine ​​ale LC3B și p62 înrinichițesut în studiul de față. După cum se arată în Fig.4, celulele pozitive s-au colorat maro, iar LC3B și p62 au fost exprimate în principal în citoplasma celulelor epiteliale tubulare renale. În comparație cu controlul, valorile IOD ale LC3B au prezentat o creștere semnificativă (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nichelclorură) în zilele 14 și 28. În plus, valorile IOD ale p62 au fost semnificativ scăzute (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Fig. 4. Rezultatele imunohistochimiei LC3B și p62 în rinichiul șoarecilor.

(A) Imaginile de imunohistochimie ale LC3B. (bară de scară=50 µm) (B) Imaginile de imunohistochimie ale p62 (bară de scară=50 µm)

(C) Densitatea optică integrată (IOD) a LC3B. (D) Densitatea optică integrată (IOD) a p62.

Valorile sunt prezentate cu mediile ± abaterea standard (n {{0}}). Coloanele marcate cu litere diferite sunt diferențe semnificative (P <>

Genele și proteinele legate deautofagieși implicat înautofagiefluxul a fost măsurat pentru a verifica în continuare efectele NiCl (Nichelclorură) peautofagie. Acestea au inclus Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 și Atg3 (Li și Zhang.2019; Nishimura și Tooze, 2020). După cum se arată în Fig. 5A-C, în comparație cu controlul, grupurile de tratament cu Ni (Nichel)arată niveluri semnificativ mai mari de proteine ​​de Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 și Atg3(P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Fig. 5. NiCl2 (Nichelclorura 2)crește genele și proteinele legate de autofagie în rinichiul șoarecilor.

(A) Rezultatele Western blot ale Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 și Atg3. (B&G) Cuantificarea expresiei proteinei Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 și Atg3.

(HM) Expresia ARNm a lui Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 și Atg3. Valorile sunt prezentate cu mediile ± abaterea standard (n=8). Coloanele marcate cu litere diferite sunt diferențe semnificative (P <>

3.4.NiCl2 (Nichelclorura 2)induce căile PI3K/Akt/mTOR și AMPK în rinichi

mTOR este un regulator esențial alautofagie(Wang și colab., 2017). Și căile de reglare bine stabilite din amonte ale mTOR includ PI3K/Akt și AMPK (Gong și colab..2020:Xu și colab..2020). Astfel, acest studiu a măsurat proteina căilor AMPK și PI3K/Akt.

După cum Fg.6A și B arată că nivelurile de proteine ​​ale p-PI3K, p-AKT și p-mTOR s-au dovedit a avea o scădere semnificativă (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nichelclorura 2)în zilele 14 și 28 ale experimentului relativ la martor. Grupurile de tratament au prezentat niveluri de proteine ​​ale p-AMPK și p-ULK1 semnificativ mai mari (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Nichelclorura 2)-s-a constatat că grupurile de tratament au o scădere semnificativă a expresiilor ARNm ale PI3K, AKT și mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Aceste rezultate dezvăluie căautofagieindus de NiCl2 (Nichelclorura 2)în rinichi de șoarece implicați căile AMPK și PI3K/Akt/mTOR.

Fig. 6. NiCl2 (Nichelclorura 2)induce căile de semnalizare PI3K/Akt/mTOR și AMPK în rinichii șoarecilor.

(A) Rezultatele Western blot ale p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 și ULK1.

(BF) Cuantificarea expresiei proteinei p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR și p-ULK1/ULK1. (G, K)

Expresia ARNm a PI3K, AKT, AMPK, mTOR și ULK1. Valorile sunt prezentate cu mediile ± abaterea standard (n=8). Coloanele marcate cu litere diferite sunt diferențe semnificative (P <>

CLICK AICI PENTRU PARTEAⅡ