Pierderea catabolismului BCAA mediată de factorul asemănător Krüppel 6 contribuie la leziuni renale la șoareci și oameni

edmund.chen@wecistanche.com

Metabolismul celular alterat înrinichicelulele tubului proximal (PT) joacă un rol critic în acutleziuni renale (AKI). Factorul de transcripție Krüppel-like factor 6 (KLF6) este indus rapid și robust la începutul PT după AKI. Am descoperit că knockdown-ul Klf6 specific PT (Klf6PTKD) este protector împotriva AKI șirinichifibroza la soareci. Analiza combinată de secvențiere a imunoprecipitării ARN și cromatinei a demonstrat că expresia genelor care codifică enzimele catabolice de aminoacizi cu lanț ramificat (BCAA) a fost păstrată la șoarecii Klf6PTKD, cu KLF6 ocupând regiunea promotoare a acestor gene. În schimb, supraexpresia KLF6 inductibilă a suprimat expresia genelor BCAA și a exacerbatleziuni renaleși fibroză la șoareci. In vitro, celulele rănite care supraexprimă KLF6 au avut scăderi similare ale expresiei genei catabolice BCAA și au fost mai puțin capabile să utilizeze BCAA. În plus, distrugerea BCKDHB, care codifică o subunitate a enzimei limitatoare de viteză în catabolismul BCAA, a dus la o producție redusă de ATP, în timp ce tratamentul cu amplificator de catabolism BCAA BT2 a crescut metabolismul. Analizafunctia rinichilor, KLF6 și expresia genelor BCAA în cronica umanăboală de rinichipacienții au prezentat corelații inverse semnificative între KLF6 și ambelefunctia rinichilor și expresia BCAA. Astfel, țintirea suprimării mediate de KLF6-a catabolismului BCAA poate servi ca o țintă terapeutică cheie în AKI șirinichifibroză.

CISTANCHE VA AMUNĂȚI INSUFICIENȚA RENALĂ/RENALĂ

Cronicboală de rinichi(CKD) cauzează morbiditate și mortalitate semnificative și are o prevalență în populația adultă din SUA de ~ 15 la sută. CKD poate rezulta din crize repetate de acutleziuni renale(AKI) pot fi atribuite insultelor de mediu sau toxice sau sunt secundare altor boli sau tratamentelor acestora. În majoritatea cazurilor, tubul proximal (PT) este un loc primar de afectare în AKI, deoarece activitatea metabolică ridicată a celulelor PT le face susceptibile la leziuni ischemice, iar rolul lor în excreția de medicamente și toxine necesită un flux de potențial dăunător. agenți prin celulele PT (1). O astfel de clasă de agenți este chimioterapicele care dăunează ADN-ului, care se acumulează în celulele PT, provocând AKI și pierderea nefronului. După leziune, celulele PT dediferențiază și secretă factori solubili, cum ar fi membrii familiei Wnt și Hedgehog și citokinele (1-4). Celulele PT de-diferențiate care supraviețuiesc pot reintra în ciclul celular și pot prolifera pentru a repara PT lezat, urmată de rediferențierea la celule PT complet funcționale (2). Cu toate acestea, celulele care suferă, în schimb, oprirea ciclului celular la punctul de control G2/M, s-ar putea să nu se recupereze, ceea ce duce la atrofie și la reglarea în sus a semnalizării profibrotice (5), declanșând fibroza prin stimularea diferențierii fibroblastelor rezidente la miofibroblaste care secretă proteine ​​din matricea extracelulară și recrutarea celulelor imune, cum ar fi macrofagele și celulele T (1).

Cuvinte cheie:rinichi; leziuni renale acute; tubul proximal; factor de transcripție; aminoacizi cu catenă ramificată

Pe lângă inducerea căilor de semnalizare patogene, celulele PT lezate demonstrează, de asemenea, un metabolism celular drastic modificat. Celulele PT nevătămate se bazează în mare măsură pe oxidarea mitocondrială a acizilor grași, ciclul acidului tricarboxilic (TCA) și fosforilarea oxidativă pentru producerea de ATP. Cu toate acestea, în cazul leziunii, oxidarea acizilor grași este suprimată, cu doar o reglare compensatorie modestă a glicolizei, astfel încât nivelurile generale de ATP sunt reduse în PT lezat (6). În plus, inhibarea oxidării acizilor grași in vitro a cauzat dediferențierea și apoptoza celulelor epiteliale tubulare și s-a agravat in vivo.leziuni renaledupă tratamentul cu acid folic (6). Interesant, reglarea în sus a oxidării acizilor grași mitocondriali sau a oxidării acizilor grași peroxizomali (FAO) poate proteja împotrivaleziuni renale(6, 7), sugerând că păstrarea metabolismului celular poate fi o țintă terapeutică în AKI. Studiile transcriptomice în biopsiile de rinichi cu CKD umană, precum și după leziunea de reperfuzie ischemică (IRI) la șoareci demonstrează metabolismul dereglat a acizilor grași, precum și metabolismul aminoacizilor (6, 8). Deși rolul oxidării acizilor grași PT a fost descris anterior în AKI, rolul metabolismului aminoacizilor PT în AKI rămâne de explorat. Mai mult, mecanismele de leziuni ale PT descrise până în prezent au fost în mare măsură explorate folosind modele de șoarece cu knock-out și supraexprimare a moleculelor de semnalizare individuale, dar mecanisme prin care căile globale, atât fibrotice/inflamatorii, cât și metabolice, și comutarea între recuperarea normală și atrofie. sunt reglementate în AKI nu sunt bine caracterizate.

Factorii de transcripție acționează ca regulatori principali ai proceselor biologice fundamentale, datorită capacității lor de a regla expresia mai multor ținte din aval și de a forma bucle de feedback. În AKI, factorii de transcripție bine studiați, cum ar fi membrii familiei FOS și JUN, sunt puternic reglați. Studii recente ale răspunsurilor moleculare la IRI în probe umane și profilarea translațională a PT după obstrucția ureterală unilaterală (UUO) la șoareci au identificat, de asemenea, factorul de transcripție cu degetul de zinc Krüppel-like factor 6 (KLF6) ca o genă similară a răspunsului precoce al leziunii (9, 10). ). KLF-urile cuprind o familie de factori de transcripție cu degete de zinc cu domenii de legare a ADN-ului C-terminal foarte conservate și N-terminale variabile care sunt exprimate pe scară largă, inclusiv înrinichi(11). KLF6 are roluri în procese multiple, cum ar fi proliferarea și diferențierea celulelor, apoptoza, răspunsurile la deteriorarea ADN-ului și funcția mitocondrială (12) și a fost identificat că joacă roluri în hepatice, cardiace șirinichifibroza, cu efecte dependente de context (13, 14). În cadrulrinichi, KLF6 este exprimat în podocitele glomerulare și este un regulator esențial al funcției mitocondriale în contextul glomerulosclerozei segmentare focale (FSGS) (15). Pe lângă expresia sa în podocitele glomerulare, KLF6 este, de asemenea, exprimat variabil în PT, dar rolul său în celulele PT, fie în funcționarea normală, fie după leziune, nu este înțeles. Supraexprimarea KLF6 în celulele HK-2 a dus la un fenotip de-diferențiat cu scăderea E-cadherinei și creșterea expresiei vimentinei și, de asemenea, a condus la o expresie crescută a proteinei inflamatorii macrofage-3 (16). În plus, expresia KLF6 a crescut ca răspuns la nivelul ridicat de glucoză, iar acest efect a fost blocat prin distrugerea TGFB1 sau prin tratamentul cu anticorp de neutralizare a TGF- 1. Tratamentul direct cu TGF- 1 a indus și expresia KLF6, indicând o posibilă buclă de feedback pozitiv în celulele HK-2 (16). De asemenea, s-a demonstrat că KLF6 este indus în celulele canceroase in vitro prin doze subapoptotice de cisplatină, medicament chimioterapeutic care dăunează ADN-ului (17). Pentru a determina rolul PT KLF6 ca răspuns la deteriorarea ADN-ului, am folosit toxina acid aristolohic I (AAI) care apare în mod natural. Nefropatia asociată cu AAI este relevantă din punct de vedere clinic (18), iar toxicitatea AAI este foarte specifică PT, permițând astfel studiul rolului PT KLF6 în mod specific ca răspuns la leziunea PT. În plus, AAI provoacă în mod fiabil atât AKI, cât și o tranziție la fibroză la șoareci, spre deosebire de majoritatea regimurilor cu cisplatină (19). AAI pătrunde în celulele PT prin intermediul transportatorilor de anioni organici bazolaterali (OAT) 1 până la 3 și are atât efecte genotoxice, prin formarea de aducti de aristolactamă (AL)-ADN, cât și efecte citotoxice, provocând leziuni mitocondriale, care generează specii reactive de oxigen și, în special, inhibă normalul normal. PT funcționează cum ar fi endocitoza mediată de receptor (18–20). Aici, demonstrăm prin modularea expresiei KLF6 în mod specific în PT prin studii de câștig și pierdere a funcției la șoareci că suprimarea mediată de KLF6-catabolismul aminoacizilor cu lanț ramificat (BCAA) contribuie la AKI. si urmandrinichifibroză.

Rezultate

Tratamentul AAI crește expresia renală PT Klf6. Deoarece mai mulți membri ai familiei KLF sunt exprimați în celulele epiteliale dinrinichi(21), am întreprins inițial qRT-PCR pentru aceste Klfs epiteliale înrinichicortexul a fost recoltat la 24 de ore după o singură doză de toxină specifică PT, AAI, față de vehicul (dimetil sulfoxid [DMSO]) la șoarecii C57BL/6. Klf4, Klf5 și Klf6 au fost semnificativ reglați în sus, în timp ce Klf15 a fost semnificativ reglat în jos (Fig. 1A), iar aceste modificări ale expresiei genelor au avut loc înainte de o creștere semnificativă a creatininei serice (Fig. 1B). Pentru a determina dacă reglarea Klf6 este tranzitorie sau prelungită, am administrat AAI în mai multe injecții 3 dapart fie pentru două injecții, fie 3 săptămâni (fază activă) sau timp de 3 săptămâni, urmate de 3 săptămâni fără AAI (faza de remodelare) (Fig. 1C) . PT a rămas intactă la 24 de ore după o injecție, dar după două injecții, celulele PT au suferit moartea celulelor, iar șoarecii tratați cu mai multe doze de AAI au demonstrat pierderea PT, infiltrate inflamatorii, proteine.

gipsuri și fibroză la sfârșitul fazei de remodelare (Fig. 1D). Expresia Klf6 a rămas semnificativ crescută în fazele active și de remodelare ale leziunii (Fig. 1E), sugerând un rol pentru KLF6 în fazele acute și fibrotice ale leziunii. KLF6 este exprimat în celule glomerulare, tubulare și inflamatorii și pentru a determina contribuția expresiei Klf6 specifice PT la creșterea observată a exprimării Klf6 corticale renale, am întreprins secvențierea ARN (ARN-seq) în segmentele PT S2/S3 microdisecate 24 h după o injecție AAI, înainte de pierderea celulelor PT. Klf6 a fost puternic reglat la un nivel comparabil cu bine-cunoscuții factori de transcripție de răspuns timpuriu Fos și Jun, ceea ce indică faptul că inducerea timpurie a expresiei ARN mesager (ARNm) Klf6 înrinichieste determinată de expresia sa în celulele PT (Fig. 1F). Aceste constatări sunt în concordanță cu datele publicate recent de ARN-seq unicelular/nuclear care arată o reglare în sus a Klf6 în celulele PT la șoarecele și om răniți.rinichi(22, 23). În cele din urmă, extragerea datelor de matrice de expresie din studiile de timp IRI raportate anterior (8) a confirmat inducerea timpurie a expresiei KLF6, în termen de 2 ore de la AKI, în mod similar cu Fos și Jun (Fig. 1G). Aceste date sugerează că Klf6 este o genă de răspuns precoce la leziuni inductibile după tratamentul cu toxina specifică PT AAI și după IRI și rămâne crescută în ciuda încetării AAI.

Pierderea specifică PT a KLF6 atenuează leziunea renală în fazele active și de remodelare post-tratament AAI.Pentru a determina contribuția KLF6 specific PT la rănirea indusă de AAI, am generat șoareci cu deprimare specifică PT a Klf6 (Klf6PTKD) prin încrucișarea șoarecilor Klf6fl/fl (24) cu șoareci Pepck-Cre (25). Șoarecii Klf6PTKD au fost viabili și fertili, cu o reducere semnificativă a expresiei proteinei KLF6 specifice PT, dar nicio modificare a expresiei ARNm Klf6 în ficat, în comparație cu șoarecii Klf6fl/fl (Anexa SI, Fig. S1 A-C). Nu au existat diferențe evidente înrinichihistologie sau funcție între șoarecii Klf6fl/fl și Klf6PTKD la vârsta de 24 săptămâni (Anexa SI, Fig. S1 D și E) și nivelurile de expresie ale OAT 1 până la 3 (Slc22a6, Slc22a7 și Slc22a8), calea de intrare în AAI PT, nu au fost semnificativ diferite (Anexa SI, Fig. S1F).

Șoarecii martor (Klf6fl/fl) și Klf6PTKD au fost tratați cu vehicul (DMSO) sau 3 mg/kg AAI intraperitoneal la fiecare 3 zile timp de 3 săptămâni și eutanasiați la 3 zile după ultima injecție AAI pentru a evalua faza activă a leziunii sau la 3 săptămâni după ultima injecție AAI pentru a evalua faza de remodelare a leziunii (Fig. 1C). Șoarecii Klf6fl/fl și Klf6PTKD au avut cantități similare de aducti AL-ADN atât după o injecție, cât și la sfârșitul fazelor active și de remodelare (Anexa SI, Fig. S1 G și H), sugerând absorbția similară a PT a AAI și repararea AL. -Aducții ADN la șoarecii Klf6fl/fl și Klf6PTKD. În timpul injecțiilor, șoarecii care au primit AAI au pierdut în greutate în comparație cu cei care au primit DMSO, cu o reducere similară de aproximativ 18% față de valoarea inițială atât la șoarecii Klf6fl/fl, cât și la Klf6PTKD la injectarea finală de AAI, urmată de recâștigarea unor cantități similare de greutate corporală ( Anexa SI, Fig. S2A).Rinichigreutățile raportate la greutatea corporală inițială (ziua 0) au fost similare între șoarecii Klf6fl/fl și Klf6PTKD tratați cu DMSO și AAI la sfârșitul fazei active (Anexa SI, Fig. S2B). In faza de remodelare,rinichide la șoarecii Klf6fl/fl tratați cu AAI au cântărit semnificativ mai puțin decât cei de la șoarecii tratați cu DMSO, dar la șoarecii Klf6PTKD tratați cu AAI,rinichigreutățile au fost păstrate (Anexa SI, Fig. S2B).Funcția rinichilora fost evaluată prin măsurarea concentrațiilor de creatinine serice (Fig. 2A) și azot ureic (Fig. 2B). Atât concentrațiile serice ale creatininei, cât și ale azotului ureic au fost semnificativ crescute la șoarecii care au primit AAI față de DMSO; cu toate acestea, creșterile au fost semnificativ mai mici la șoarecii Klf6PTKD în comparație cu șoarecii Klf6fl/fl (Fig. 2 A și B). Analiza histologică folosind colorația cu hematoxilină și eozină și acid periodic Schiff a arătat că atât șoarecii Klf6fl/fl, cât și Klf6PTKD tratați cu AAI prezentau tubuli excretori cu membrane bazale rămase, infiltrate inflamatorii care erau predominant localizate în

cortexul exterior și mai multe turnuri de proteine ​​atât în ​​cortex, cât și în medulară (Fig. 2 C și D). Cu toate acestea, aceste caracteristici au fost mai puțin severe la șoarecii Klf6PTKD în comparație cu șoarecii Klf6fl/fl, cu conservarea tubilor și a infiltratelor inflamatorii mai mici. Analiza zonei PT a fost efectuată folosind colorarea fluorescentă cu lectină Lotus pentru a identifica marginile intacte ale PT în celulele PT complet diferențiate și imunofluorescența pentru citocheratina-20 (KRT-20) pentru a identifica PT-urile rănite (8). În comparație cu șoarecii tratați cu DMSO, atât șoarecii Klf6fl/fl, cât și Klf6PTKD tratați cu AAI au avut o pierdere semnificativă a PT matur, așa cum se arată prin pierderea colorării cu lectină Lotus și inducerea expresiei KRT-20, indicând deteriorarea PT în ambele zone. fazele active și de remodelare (Fig. 2E și SI Anexa, Fig. S2C). Șoarecii Klf6PTKD tratați cu AAI au avut o conservare semnificativă a PT matur în comparație cu șoarecii Klf6fl/fl, însoțit de niveluri similare de inducție KRT- 20 atât în ​​faza activă, cât și în faza de remodelare. Colorarea tricrom a fazei de remodelarerinichia arătat depunere extinsă de material fibrotic la șoarecii Klf6fl/fl, cu mult mai puțină fibroză la șoarecii Klf6PTKD (Fig. 2F, colorare cu albastru; Anexa SI, Tabelul S1). Depunerea colagenului I a componentei matricei fibrotice, detectată prin imunofluorescență (Fig. 2G și apendicele SI, Fig. S2D), a arătat că colagenul I a fost semnificativ crescut la șoarecii Klf6fl/fl cu AAI, dar nu la șoarecii Klf6PTKD cu AAI, comparativ cu DMSO în faza activă. În faza de remodelare, colagenul I a fost crescut semnificativ la șoarecii Klf6fl/fl și Klf6PTKD cu AAI, cu o suprafață procentuală semnificativ mai mică la șoarecii Klf6PTKD cu AAI comparativ cu șoarecii Klf6fl/fl cu AAI. Celulele inflamatorii interstițiale constând din CD68 plus macrofage și GR-1 plus monocite mieloide au fost prezente în Klf6fl/fl

și șoarecii Klf6PTKD tratați cu AAI, dar au fost semnificativ mai puțin abundenți la șoarecii Klf6PTKD atât în ​​faza activă, cât și în faza de remodelare (Fig. 2H). Astfel, pierderea KLF6 specifică PT protejează împotriva leziunii PT induse de AAI, a fibrozei și a inflamației, în ciuda prezenței unor cantități similare de aducti AL-ADN în comparație cu șoarecii martor tratați cu AAI. Pierderea specifică PT a KLF6 reduce semnalizarea inflamatorie și păstrează metabolismul celular după tratamentul AAI. Am căutat să înțelegem mecanismele prin care pierderea PT KLF6 protejează împotriva rănilor și, prin urmare, am întreprins ARN-seq derinichicortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- sau<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

Pentru a determina căile potențial reglate direct și indirect de KLF6, am analizat în continuare genele exprimate diferențial, clasificându-le pe baza prezenței și locației site-urilor de legare a KLF6, folosind datele de secvențiere a imunoprecipitării cromatinei KLF6 (ChIP-Seq) din proiectul Encyclopedia of DNA Elements. . Genele clasa 2 au fost definite ca având cel puțin 1 situs de legare KLF6 în ± 1 kb de la locul de începere a transcripției (TSS), genele clasa 1 ca având cel puțin 1 situs de legare KLF6 între ± 1 și 10 kb din TSS și genele de clasă 0 ca neavând loc de legare KLF6 în ±10 kb de TSS. Au existat 538 de gene care au fost atât reglate în sus la șoarecii Klf6fl/fl, cât și scădete semnificativ la șoarecii Klf6PTKD față de șoarecii Klf6fl/fl în faza activă. Analiza de îmbogățire a căilor a acestor 538 de gene a arătat că căile legate de imunitatea înnăscută (de exemplu, TYROBP, fagozomul și macrofage) și adeziunea celulară (de exemplu, integrina, adeziunea focală) au fost semnificativ îmbogățite (Fig. 3A). Clasificarea genelor în funcție de situsurile de legare KLF6 a arătat că majoritatea DEG-urilor (428/538) nu aveau site-uri de legare KLF6 (clasa 0) și analiza de îmbogățire a genelor de clasa 2 (72) și a genelor de clasa 0 separat a arătat că semnificația acestor căi a fost puternic determinată de genele de clasă 0, ceea ce indică faptul că expresia mai scăzută a acestor gene la șoarecii Klf6PTKD a fost probabil un efect indirect al mai puține leziuni PT ca urmare a distrugerii Klf6 specifice PT (Fig. 3A).

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE

Au existat 388 de gene care au fost atât reglate în jos la șoarecii Klf6fl/fl, cât și conservate semnificativ (reglate în sus) la șoarecii Klf6PTKD față de șoarecii Klf6fl/fl. Analiza de îmbogățire a căilor a arătat că aceste gene reprezentau căi metabolice, metabolismul aminoacizilor și metabolismul acizilor grași fiind proeminente (Fig. 3B și apendicele SI, Fig. S4). Analiza de îmbogățire a genelor de clasă 2 (1{{10}}3) și gene de clasă 0 (246) a arătat că, în ciuda faptului că numai ~ 25% dintre gene au site-uri de legare KLF6 în ± 1 kb de TSS ( clasa 2), acest subset de gene a fost motorul pentru valorile P foarte semnificative ale acestor căi. În mod surprinzător, căile metabolice specifice aminoacizilor (Val, Leu și Ile [BCAA] și Gly, Ser și Thr) au fost la fel de semnificative atunci când au fost analizate numai genele de clasa 2, sugerând o potențială reglare directă a acestor căi de către KLF6 (Fig. 3B) . În schimb, semnificația ridicată a căilor metabolice a acizilor grași și a căii de semnalizare a PPAR au fost în mare măsură determinate de genele de clasă 0, sugerând conservarea indirectă a acestor căi ca urmare a distrugerii Klf6 specifice PT. Analiza de îmbogățire a setului de gene pentru căile metabolice specifice Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (degradarea acizilor grași, metabolismul aminoacizilor, ciclul TCA și glicoliza), folosind toate genele reglate diferențial, a confirmat că acestea sunt semnificativ supra-reglate (conservate) în Klf6PTKD față de șoareci Klf6fl/fl (Fig. 3C).

Inducerea KLF6 Se exacerbaLeziuni renaleși suprimă tratamentul genelor catabolice BCAA post-AAI. Pentru a determina dacă supraexprimarea KLF6 ar avea efecte opuse, am folosit sistemul „tet-on” pentru a genera un model de șoarece cu expresia inductibilă de doxiciclină (DOX) a KLF6 uman (hKLF6OE; dublu transgenic CAG-rtTA, TRE-hKLF6). șoareci) (Anexa SI, Fig. S5A). Șoarecii hKLF6OE au avut o inducție robustă a expresiei hKLF6 după suplimentarea dietei cu DOX timp de 7 zile, fără diferențe semnificative în expresia Klf6 la șoarece (Anexa SI, Fig. S5B) șirinichinu a prezentat vătămare histologică evidentă sau pierdere afunctia rinichilordupă tratament continuu cu DOX timp de 15 săptămâni (Anexa SI, Fig. S5 C și D) comparativ cu șoarecii martor (TRE-hKLF6 cu tratament DOX). Cu toate acestea, pentru a determina dacă inducerea hKLF6 în PT a exacerbat AKI șirinichifibroza, hKLF6OE și șoarecii martor au fost tratați cu o doză mai mică de 1 mg/kg AAI sau DMSO la fiecare 3 zile timp de 2 săptămâni, urmată de eutanasie după încă 3 zile (faza activă) sau încă 2 săptămâni (faza de remodelare) (Anexa SI, Fig. S6A). Șoarecii de control și hKLF6OE care au primit AAI au pierdut cantități similare de greutate corporală (Anexa SI, Fig. S6B) șirinichigreutățile au fost similare între toate grupurile (Anexa SI, Fig. S6C). Șoarecii hKLF6OE au crescut semnificativ creatinina serică și azotul ureic în comparație cu șoarecii martor după tratamentul AAI în faza activă (Fig. 4 A și B). Acest lucru a fost însoțit de pierderea PT matur cu o proporție mai mare de PT pozitiv KRT-20, care a fost exacerbată la șoarecii hKLF6OE în ambele momente (Fig. 4 C-E și apendicele SI, Fig. S6D) și a crescut fibroză în ambele faze (Fig. 4F și apendicele SI, Fig. S6E). Analiza qRT-PCR a genelor care codifică enzime din calea metabolică BCAA a arătat suprimarea genelor BCAA după tratamentul AAI la șoarecii de control și hKLF6OE, cu suprimare suplimentară la șoarecii hKLF6OE în comparație cu șoarecii de control (Fig. 4G). În plus, expresia mai multor gene BCAA a fost, de asemenea, redusă semnificativ (Hibch) sau a arătat o tendință către o expresie mai scăzută la șoarecii hKLF6OE față de control, chiar și fără tratament AAI (tratați DMSO) (Fig. 4G). Aceste date sugerează că inducerea hKLF6 la șoarecii adulți face carinichimai susceptibil la AKI și eventual fibroză cu dereglare semnificativă a genelor care codifică catabolismul BCAA.

Inducerea KLF6 suprimă catabolismul BCAA, care este un substrat important pentru producția de ATP in vitro.Tabolismul BCAA mitocondrial poate contribui la fosforilarea oxidativă prin producerea de acetil-CoA și succinil-CoA (Anexa SI, Fig. S4B). Pentru a investiga dacă KLF6 reglează BCAA și metabolismul celular in vitro, am evaluat mai întâi expresia genelor metabolice BCAA în celulele HK-2 cu supraexpresia KLF6 (KLF{6-OE), cu sau fără tratament AAI. Ca și în cazul șoarecilor hKLF6OE, supraexprimarea KLF6 în celulele HK-2 a dus la o tendință de suprimare a mai multor gene care codifică enzimele BCAA, în special BCKDHB. Tratamentul celulelor KLF6-Con de control cu ​​25 μM AAI timp de 6 ore a suprimat în mod semnificativ expresia mai multor enzime, iar acestea au fost suprimate în continuare în celulele KLF{6-OE tratate cu AAI (Fig. 5A). La

Fig. 3. Pierderea KLF6 suprimă căile profibrotice și păstrează căile metabolice după tratamentul AAI. (A) Clasificarea și analiza de îmbogățire a căilor genelor reglate în sus la șoarecii Klf6fl/fl după AAI, dar semnificativ mai puțin reglate în sus la șoarecii Klf6PTKD după AAI în funcție de clasa site-ului de legare: clasa 2 cu mai mare sau egal cu 1 site de legare KLF6 în ±1 kb de TSS; clasa 1 cu mai mare sau egal cu 1 site de legare KLF6 la ±1 până la 10 kb din TSS; și clasa 0 fără site de legare KLF6 în ± 10 kb de la TSS. (B) Clasificarea și analiza îmbogățirii căilor a genelor reglate în jos la șoarecii Klf6fl/fl după AAI, dar semnificativ mai puțin reglate în jos (adică, conservate) la șoarecii Klf6PTKD după AAI în funcție de clasa site-ului de legare: clasa 2 cu Mai mare sau egal cu 1 situs de legare KLF6 în ±1 kb de TSS; clasa 1 cu mai mare sau egal cu 1 situs de legare KLF6 la ±1 până la 10 kb din TSS; și clasa 0 fără loc de legare a KLF6 la ±10 kb de la TSS. (C) Grafice de analiză a îmbogățirii setului de gene folosind toate genele exprimate diferențial, pentru degradarea acizilor grași KEGG (FA DEGRAD), metabolismul aminoacizilor (AA METAB) și ciclul TCA (KEGG_TCA).

pentru a determina dacă această suprimare a expresiei genei BCAA în prezența AAI a condus la modificări în catabolismul BCAA, am măsurat concentrațiile intracelulare de BCAA. După tratamentul cu AAI, celulele KLF6- Con au prezentat o scădere a BCAA, în concordanță cu catabolismul crescut al BCAA, potențial ca o compensare pentru pierderea oxidării FA (Fig. 5B). Cu toate acestea, acest efect a fost pierdut în celulele KLF6-OE, care nu au avut o scădere a BCAA intracelular după tratamentul AAI, în concordanță cu capacitatea redusă de a cataboliza BCAA (Fig. 5B), iar acest lucru s-a corelat cu producția redusă de ATP mitocondrial. comparativ cu celulele KLF6-Con tratate cu AAI (Fig. 5C).

Mediile standard utilizate pentru a măsura producția de ATP conține concentrații mari de glucoză (glucoză 10 mM, glutamină 1 mM și piruvat 2 mM) și pentru a determina dacă supraexpresia KLF6 singură ar putea modifica utilizarea diferitelor surse de energie, am efectuat în schimb teste de rata consumului de oxigen (OCR) în medii cu restricții energetice (medii fără ser cu glucoză 1 mM, fără glutamină și fără piruvat). Celulele KLF6-OE aveau OCR mitocondrial redus (definit ca OCR inițial minus OCR nemitocondrial determinat după administrarea de rotenonă/antimicină A), dar au avut o compensație similară după blocarea glicolizei cu 2-deoxiglucoză (2- DG) și FAO similare (reducerea OCR după blocarea FAO cu etomoxir) (Fig. 5 D și E). Deoarece răspunsul mitocondrial la pierderea glicolizei și OCR rezultat din oxidarea FA nu au fost modificate în celulele KLF6-OE, acest lucru sugerează că funcția mitocondrială generală nu a fost afectată, ci mai degrabă o incapacitate de a utiliza BCAA ca sursă. țin cont de reducerea liniei de bază a OCR mitocondrial în aceste condiții de energie restricționată. Pentru a determina dacă pierderea catabolismului BCAA ar duce la scăderea producției mitocondriale de ATP, am generat celule HK-2 cu distrugerea BCKDHB (Anexa SI, Fig. S7). BCKDHA și BCKDHB codifică două dintre subunitățile complexului proteic mare cetoacid dehidrogenază cu lanț ramificat (BCKDH), care catalizează prima etapă ireversibilă și limitatoare de viteză în catabolismul BCAA și este inhibată prin fosforilarea de către BCKDH kinaza (BCKDK) (28). Pentru a muta celulele BCKDHB-SCR de control și distrugerea BCKDHB-sh către producția mitocondrială de ATP, acestea au fost preincubate în 2-DG pentru a bloca glicoliza timp de 1 oră înainte de a efectua testul Ratei de producție de ATP. Eliminarea BCKDHB a dus la o scădere semnificativă a producției de ATP, arătând că BCAA sunt utilizați pentru a genera ATP la om.rinichicelule (Fig. 5F). Invers, la

Fig. 4. Șoarecii hKLF6OE au exacerbatleziuni renalecu suprimarea genelor BCAA. (A și B) Concentrațiile serice de creatinină (A) și azot ureic (B) la șoarecii martor și hKLF6OE tratați cu DMSO sau AAI în faza activă. n=4 până la 9 per grup; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" față="" de="" același="" genotip="" cu="" dmso;="" **p="">< 0.01="" față="" de="" control="" cu="" ​​aai;="" anova="" unidirecțional="" cu="" corecție="" sidak="" pentru="" teste="" multiple.="" (c="" și="" d)="" imagini="" histologice="" reprezentative="" colorate="" folosind="" pete="" de="" hematoxilină="" și="" eozină="" (c)="" și="" acid="" periodic="" schiff="" (d).="" săgeți="" galbene:="" tubuli="" de="" vărsare;="" săgeți="" negre:="" membrane="" bazale="" rămase;="" vârfuri="" de="" săgeți="" galbene:="" ghips="" de="" proteine;="" și="" vârfuri="" de="" săgeți="" negre:="" infiltrate="" inflamatorii.="" (bare="" de="" scară,="" 100="" μm.)="" (e)="" colorare="" imunofluorescentă="" pentru="" citocheratină{-20="" (krt{-20)="" ca="" marker="" al="" pt="" lezat="" (roșu)="" cu="" colorare="" cu="" lectină="" lotus="" (ll)="" )="" ca="" un="" marker="" al="" pt="" nevătămată="" (verde).="" (bare="" de="" scară,="" 250="" μm.)="" (f)="" colorare="" imunofluorescentă="" pentru="" -sma="" (verde)="" cu="" colorare="" pentru="" edu="" (magenta).="" (bare="" de="" scară,="" 100="" μm.)="" (g)="" expresia="" arnm="" a="" genelor="" bcaa="" la="" șoareci="" de="" control="" și="" hklf6oe="" tratați="" cu="" dmso="" sau="" aai="" în="" faza="" activă.="" n="5" la="" 9="" per="" grup;="" $p="">< 0,01,="" $$p="">< 0,001="" versus="" control="" cu="" ​​dmso;="" toate="" hklf6oe="" cu="" aai="" sunt="" p="">< 0,001="" față="" de="" hklf6oe="" cu="" dmso;="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" față="" de="" control="" cu="" ​​același="" tratament;="" teste="" multiple="" t="" cu="" corecție="" falsă="" a="" ratei="" de="" descoperire="" folosind="" modelul="" step-up="" în="" două="" etape="" al="" lui="" benjamini,="" kreiger="" și="" yekutieli.="" datele="" sunt="" medii="" ±="" sem="" cu="" n="" indicând="" numărul="" de="" replici="">

îmbunătățirea catabolismului BCAA, am tratat celulele HK-2 cu BT2, care inhibă BCKDK, blocând astfel fosforilarea inhibitorie a BCKDH. În condiții de restricție energetică, tratamentul cu BT2 a crescut OCR în celulele tratate cu DMSO, care a fost susținut după inhibarea glicolizei și nu datorită modificării FAO sau OCR nemitocondrial (Fig. 5 G și H). Aceste constatări indică faptul că suprimarea mediată de KLF6-a catabolismului BCAA reduce producția de ATP mitocondrial, ceea ce ar exacerba probabil leziunea PT în contextul stresului celular, în care există condiții similare cu restricții energetice din cauza compromisului FAO.

Expresia genei BCAA este redusă la diverși șoareci și oameniLeziuni renale. Pentru a determina dacă pierderea expresiei genei BCAA are loc înainte de pierderea PT și creșterea nivelului de creatinine în leziunile induse de AAI, am efectuat qRT-PCR la șoareci C57BL/6 tratați cu o singură doză de AAI și eutanasiați după 24 de ore. Bckdhb, Hibch și Mccc2 au fost deja subreglate în mod semnificativ în acest moment, alte gene (de exemplu, Acadm) arătând o tendință puternică spre reglare în jos (Fig. 6A). Pentru a studia expresia genei BCAA la alți șoarecileziuni renalemodele, am întreprins qRT-PCR la șoareci tratați cu cisplatină (Fig. 6B) sau supuși UUO (Fig. 6C). În ambele modele, expresia Klf6 a fost puternic reglată față de vehicul/controale. La șoarecii tratați cu cisplatină, câteva dintre genele BCAA testate au fost în mod semnificativ reglate în jos, cu tendințe spre reglarea în jos a celorlalte gene (Fig. 6B). La șoarecii supuși UUO, toate genele testate au fost reduse semnificativ atât la 3, cât și la 7 zile după UUO (Fig. 6C), sugerând că reglarea în jos a genelor BCAA are loc devreme după vătămare.

Fig. 5. Supraexpresia KLF6 suprimă expresia genei BCAA, producția de ATP și utilizarea BCAA in vitro. (A) Exprimarea genelor metabolice KLF6 și BCAA în celulele HK-2 care exprimă stabil plasmidele de control (Con) sau supraexpresia KLF6 (OE), tratate cu DMSO sau AAI. n=4 per grup; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" versus="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{4{0}}}}5,="" $$p="">< 0,01,="" $$$p="">< 0,001="" față="" de="" aceeași="" linie="" celulară="" cu="" dmso;="" anova="" bidirecțional="" cu="" corecția="" lui="" tukey="" pentru="" teste="" multiple.="" (b)="" cuantificarea="" bcaa="" totală="" în="" celulele="" con="" și="" oe="" tratate="" cu="" dmso="" sau="" aai.="" n="6" per="" grup;="" $p="">< 0,05="" față="" de="" con="" dmso;="" anova="" unidirecțional="" cu="" corecția="" sidak="" pentru="" teste="" multiple.="" (c)="" modificarea="" procentuală="" a="" ratei="" producției="" de="" atp="" mitocondrial="" în="" celulele="" con="" și="" oe="" tratate="" cu="" aai="" față="" de="" dmso.="" n="27" până="" la="" 30="" per="" grup;="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" față="" de="" dmso,="" $p="">< 0,05="" față="" de="" con="" aai;="" anova="" unidirecțional="" cu="" corecția="" sidak="" pentru="" teste="" multiple.="" (d)="" măsurătorile="" ocr="" pentru="" celulele="" con="" și="" oe="" în="" medii="" restricționate.="" acolo="" unde="" este="" indicat,="" s-au="" adăugat="" 2-dg,="" etomoxir="" (eto)="" și="" o="" combinație="" de="" rotenonă/antimicină="" a="" (rot).="" n="16" per="" grup.="" (e)="" cuantificări="" ale="" ocr="" mitocondrial="" bazal="" (ocr="" de="" pornire="" minus="" ocr="" post-rot),="" ocr="" nemitocondrial="" (ocr="" post-rot)="" și="" modificări="" ale="" ocr="" după="" adăugarea="" 2-dg="" (compensare="" mitocondrială="" după="" 2-dg)="" și="" etomoxir="" (fao).="" n="16" per="" grup;="" **p="">< 0,01="" față="" de="" con;="" anova="" bidirecțional="" cu="" corecția="" lui="" tukey="" pentru="" teste="" multiple.="" (f)="" rata="" de="" producție="" mitocondrială="" de="" atp="" în="" celulele="" bckdhb-scr="" și="" bckdhb-sh.="" n="14" per="" grup;="" **p="">< 0,05,="" test="" t="" nepereche.="" (g)="" măsurătorile="" ocr="" în="" celule="" hk-2="" în="" medii="" restricționate="" în="" absența="" sau="" prezența="" bt2.="" acolo="" unde="" este="" indicat,="" au="" fost="" adăugate="" 2-dg,="" eto="" și="" rot.="" (h)="" cuantificări="" ale="" ocr="" mitocondrial="" bazal,="" ocr="" nemitocondrial="" și="" modificări="" ale="" ocr="" după="" adăugarea="" 2-dg="" și="" etomoxir="" în="" celulele="" hk{-2="" în="" absența="" sau="" prezența="" bt2.="" n="8" per="" grup;="" *p="">< 0,05="" față="" de="" fără="" bt2;="" anova="" bidirecțional="" cu="" corecția="" lui="" tukey="" pentru="" teste="" multiple.="" datele="" sunt="" medii="" ±="" sem="" cu="" n="" indicând="" numărul="" de="" replici="">

În mod similar, extragerea datelor unei matrice de expresii raportate anterior din compartimentul tubulointerstițial a 36 de pacienți umani cu IRC (hipertensivi și diabetici).boli de rinichi) în comparație cu pacienții de control (6) au arătat că mai multe gene BCAA sunt reglate în jos într-un mod similar cu șoarecii tratați cu AAI (Fig. 6D). Pentru a elucida în continuare relația dintrefunctia rinichilor, expresia KLF6 și expresia genelor BCAA în CKD umană, am folosit o matrice de expresie publicată din compartimentul lointerstițial tubu al unei serii de 164 de pacienți cu diverseboli de rinichi (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 mL/min/1,73 m2) (P <0,001 pentru="" toate="" genele),="" demonstrând="" că="" aceste="" modificări="" ale="" expresiei="" genelor="" pot="" apărea="" precoce="" în="" legătură="" cu="" modificările="" funcționale.="" în="" mod="" colectiv,="" aceste="" date="" sugerează="" că="" suprimarea="" mediată="" de="" klf6-genele="" critice="" pentru="" catabolismul="" bcaa="" ar="" putea="" juca="" un="" rol="" critic="" în="">leziuni renaleîn modele murine derinichifibroză, precum și în CKD umană.

Discuţie

În acest studiu, demonstrăm rolul in vivo al KLF6 specific PT în contextulleziuni renale.KLF6 este puternic și constant reglementat la începutul PT ca răspuns laleziuni renale, dar acesta este un răspuns dezadaptativ, așa cum demonstrează efectul protector al pierderii PT Klf6 după tratamentul cu toxina AAI relevantă clinic și foarte specifică PT. În plus, demonstrăm potențiala semnificație a metabolismului dereglat BCAA în PT vătămată ca posibil contributor la AKI și fibroza ulterioară. Pierderea Klf6 a condus la păstrarea exprimării enzimei catabolice BCAA, mai multe dintre genele care codifică aceste enzime având site-uri de legare KLF6 în imediata apropiere a TSS-urilor lor, sugerând că KLF6 poate fi un supresor transcripțional al catabolismului BCAA. Deși un alt membru al familiei KLF, KLF15, s-a dovedit anterior că reglează expresia aminotransferazei 2 (Bcat2) cu lanț ramificat al mușchilor scheletici (30), reglarea altor enzime BCAA nu a fost raportată. Noi postulăm că KLF6 acționează pentru a suprima expresia mai multor gene care codifică enzimele BCAA.

În PT nevătămată, expresia Klf6 este scăzută și exprimată variabil în unele celule PT și nu în altele. Reglarea rapidă și robustă care apare după mai multe tipuri de leziuni sugerează un rol important din punct de vedere fiziologic pentru KLF6. În fibroblaste, s-a demonstrat recent că KLF6 este reglat în sus ca răspuns la stresul oncogen și oxidativ, ceea ce duce la senescența celulară, în timp ce tăcere a KLF6 a condus la acumularea de markeri de deteriorare a ADN-ului și instabilitate genomică (31). Astfel, rolul fiziologic al KLF6 în leziune poate fi inducerea senescenței celulare, permițând repararea leziunilor ADN care pot rezulta din insulte toxice sau oxidative/ischemice. Cu toate acestea, în celulele PT lezate, o a doua consecință a reglajului Klf6 pare să fie suprimarea catabolismului BCAA, care în special în celulele PT este probabil dăunătoare. Interesant este că, în ciuda distrugerii parțiale a Klf6 specific PT la momentul inițial la șoarecii Klf6PTKD, aceasta a fost încă capabilă să confere un efect protector clar după rănire. Acest lucru are implicații terapeutice importante, deoarece sugerează că doar o mică manipulare a nivelurilor sau activității KLF6 (de exemplu, prin utilizarea unui inhibitor de moleculă mică) ar putea arăta eficacitate terapeutică. Într-adevăr, factorii de transcripție sunt mai probabil decât alte familii de gene

în genomul uman să aibă sensibilitate la dozare (32). În mod similar, o limitare a modelului murin de supraexpresie KLF6 inductibil este că nu este celule PT restricționate și, ca atare, studiile viitoare vor trebui să se concentreze pe utilizarea unui model inductibil de celule specifice pentru a elucida rolul dependent de contextul celular al KLF6.

Am demonstrat anterior că pierderea Klf6 în podocitele glomerulare a fost dăunătoare în stabilirea FSGS datorită rolului său în activarea transcripțională a sintezei citocromului c oxidazei 2 (Sco2). Pierderea Klf6 în FSGS a dus la o fibroză mai gravă, cu activarea crescută a căii apoptotice intrinseci (15). Interogarea seturilor de date ARN-seq unicelulare disponibile arată că la șoarecele sănătosrinichi,Klf6 este exprimat într-o proporție mult mai mare de cite podo decât celulele PT și la un nivel mult mai ridicat (ref. 33; https://susztaklab.com/). Prin urmare, KLF6 joacă probabil un rol fiziologic mai important în podocitele normale decât celulele PT, în timp ce alți regulatori mitocondriali cunoscuți (de exemplu, Ppara) sunt exprimați mult mai mult în celulele PT decât în ​​podocite. Astfel, pierderea Klf6 în podocite are, prin urmare, probabil un efect mai dăunător decât în ​​celulele PT. Rolurile contrastante ale KLF6 în diferite tipuri de celule din cadrulrinichieste în paralel cu descoperirile anterioare ale efectelor specifice celulelor în inimă și ficat. Astfel, distrugerea Klf6 în miocitele cardiace la șoareci a atenuat fibroza cardiacă după o suprasarcină cu angiotensină II, sugerând un rol pentru KLF6 în propagarea fibrozei, dar distrugerea Klf6 în miofibroblastele cardiace nu a avut niciun efect asupra fibrozei (14). În schimb, în ​​ficat, distrugerea Klf6 în hepatocitele de șoarece nu a avut niciun efect asupra fibrozei hepatice după administrarea cronică de CCl4, dar supraexprimarea KLF6 în celulele stelate hepatice a dus la scăderea fibrozei, sugerând că KLF6 este protector (13).

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

Pierderea FAO în timpulleziuni renaleeste cunoscut acum a fi un eveniment important în patologialeziuni renaleși într-adevăr poate contribui direct la fibroză. În absența FAO, care este principala sursă de energie pentru PT nevătămată, alte surse potențiale de energie pot avea o importanță mai mare. BCAA contribuie la ciclul TCA prin producerea de acetil-CoA și succinil-CoA. Un studiu recent a demonstrat că nu numai BCAA marcat cu 13C contribuie la intermediarii ciclului TCA înrinichicu exceptiarinichia avut a patra cea mai mare încorporare a 13C în intermediarii ciclului TCA ai organelor testate, după pancreas, mușchi și țesutul adipos alb (34), sugerând că BCAA sunt potențial un contributor important la ciclul TCA. Cu toate acestea, semnificația catabolismului BCAA în contribuția la ciclul TCA, fie în normal, fie în răni.rinichi, nu a fost explorat anterior. De exemplu, nu se știe dacă numai pierderea catabolismului PT BCAA ar provoca modificări ale homeostaziei și/sau reparației PT, iar aceste studii vor necesita generarea de noi modele de șoareci, cum ar fi șoarecii knockdown Bckdhb specifici PT. În decorul derinichivătămare, atunci când FAO este suprimată sever, suprimarea suplimentară a

genele care codifică enzimele metabolice BCAA pot priva celulele tubulare de o importantă sursă de energie potențială alternativă. Este important de remarcat faptul că expresia genei BCAA a fost deja reglată în jos la 24 de ore după o singură injecție, înainte de orice modificare a creatininei serice sau a pierderii PT, ceea ce indică faptul că aceste reduceri au fost o consecință specifică a leziunii PT și nu au fost legate de scăderea cererii de energie PT care rezultă. de la reducerea RFG și, în consecință, o cerință redusă de absorbție a soluției. Aceste căi au fost conservate la șoarecii Klf6PTKD care au fost protejați de răni și au fost suprimați în continuare la șoarecii hKLF6OE care au avut răni mai grave. În plus, celulele KLF6-OE au redus producția mitocondrială de ATP după tratamentul AAI în comparație cu celulele KLF{6-Con și în timp ce BCAA intracelulare au fost reduse în celulele KLF{6-Con, în concordanță cu catabolismul lor. , această scădere nu a fost detectată în celulele KLF6-OE. În plus, distrugerea BCKDHB în celulele HK-2 a dus la scăderea producției de ATP mitocondrial. Astfel, expresia păstrată a genelor BCAA la șoarecii Klf6PTKD poate oferi protecție împotriva rănilor prin furnizarea de intermediari vitali ai ciclului TCA în contextul oxidării FA sever reduse. Studiile viitoare folosind șoareci cu manipulări genetice ale catabolismului BCAA și/sau tratament cu BT2 ne-ar permite să investigăm dinamica dintre catabolismul BCAA și FAO înleziuni renale.

Am arătat că pierderea expresiei genelor BCAA duce la scăderea respirației mitocondriale și a producției de ATP, iar acesta reprezintă un mecanism prin care pierderea catabolismului BCAA poate contribui laleziuni renale. Un mecanism alternativ ar putea fi prin acumularea de BCAA, care poate avea un efect toxic. Într-adevăr, acest lucru a fost demonstrat în cadrul IRI cardiac. S-a demonstrat că acumularea de BCAA din cauza pierderii catabolismului inhibă utilizarea piruvatului mitocondrial prin inactivarea posttranslațională a piruvat dehidrogenazei, eliminând astfel o altă sursă de energie celulară și exacerbarea leziunii (35). Acest lucru a fost inversat fie prin creșterea catabolismului BCAA prin tratarea șoarecilor cu BT2, fie prin creșterea metabolismului glucozei prin supraexprimarea GLUT1. Un studiu recent a arătat, de asemenea, exacerbarea IRI cardiacă prin pierderea catabolismului BCAA la șoarecii diabetici. Acest lucru a fost însoțit de stres oxidativ crescut și din nou a fost inversat prin reactivarea catabolismului BCAA (36). Se știe că BCAA și în special leucina activează semnalizarea complexului 1 al rapamicinei (mTOR) la mamifere (mTORC1). Într-un model de șoarece de polichisticboală de rinichi,în care celulele din jurul chistului au activarea mTOR

semnalizarea, suplimentarea cu BCAA a activat în continuare semnalizarea mTORC1, ducând la creșterea proliferării (37). Profilul transcripțional al carcinoamelor hepatocelulare a evidențiat scăderea expresiei genei BCAA, ceea ce duce la acumularea de BCAA în țesutul tumoral. Acest lucru a fost asociat cu creșterea semnalizării și proliferării mTORC1, care a fost redusă prin restricționarea BCAA sau tratarea cu BT2 și a fost exacerbată la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în BCAA (38). Semnalizarea mTORC1 este necesară pentru funcția PT, iar studiile care utilizează inhibitori mTOR înleziuni renaleau arătat rezultate contradictorii, probabil din cauza regimurilor de dozare diferite, a calendarului tratamentelor și a modelelor de leziuni (39-42). Semnalizarea mTORC1 duce la o multitudine de răspunsuri celulare, inclusiv creșterea și proliferarea celulelor, sinteza lipidelor, sinteza mitocondrială și suprimarea autofagiei (43). Este probabil ca subactivarea sau supraactivarea semnalizării mTORC1 să fie dăunătoare și că este necesar un echilibru pentru funcționarea corectă a celulelor. De exemplu, supraactivarea semnalizării mTORC1 în leziunea PT poate duce la suprimarea dăunătoare a autofagiei, care este necesară pentru îndepărtarea mitocondriilor deteriorate și s-a dovedit a fi importantă pentru recuperarea după PT.accidentare (39, 42, 44, 45). Astfel, acumularea de leucină poate avea un rol dăunător înleziuni renaleprin supraactivarea semnalizării mTORC1 și suprimarea autofagiei. În concluzie, am arătat că reglarea robustă a lui Klf6 care are loc înleziuni renaleeste dăunătoare, în care pierderea Klf6 specifică PT a păstrat expresia genei BCAA și a atenuat AKI și eventual fibroză. În schimb, inducerea KLF6 la șoareci a suprimat expresia genei BCAA și a făcut carinichisusceptibil laleziuni renale.În plus, genele care codifică mai multe enzime BCAA au site-uri de legare KLF6, ceea ce sugerează că KLF6 poate fi un regulator transcripțional al catabolismului BCAA. Reglarea în jos a catabolismului BCAA in vitro prin supraexprimarea KLF6 și tratamentul cu AAI, sau prin distrugerea BCKDHB, condusăla scăderea producției de ATP mitocondrial. În mod colectiv, tesdatele sugerează că vizarea terapeutică a prezervăriiCatabolismul BCAA poate oferi o alternativă mitocondrialăsursă de energie în contextulleziuni renaleîn care FAOeste redus.