Lipsa APOL1 în tubii proximali ai rinichilor umani normali și ai rinichilor de șoarece transgenici APOL1 proteinurici
Mar 15, 2022
pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com
Natalya A. Binecuvântare1, Zhenzhen Wu2, Sethu M. Madhavan3, Jonathan W. Choy4,Michelle Chen4, Myung K. Shin4, Maarten HoekID5, John R. Sedor2,6,7, John F. O'Toole2,6,Leslie A. BruggemanID2,6*
1 Rammelkamp Center for Education and Research, MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Statele Unite ale Americii, 2 Department of Inflammation & Immunity, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Statele Unite ale Americii of America, 3 Department of Medicine, Ohio State University, Columbus, OH, Statele Unite ale Americii, 4 Merck & Company, Inc., Kenilworth, NJ, Statele Unite ale Americii, 5 Maze Therapeutics, SouthSan Francisco, CA, Statele Unite ale Americii , 6 Departamentul de Nefrologie, Cleveland Clinic, Case WesternReserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Statele Unite ale Americii, 7 Departamentul de Fiziologie și Biofizică, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Statele Unite ale Americii.
Abstract
Mecanismul patogenezei asociate cu polimorfismele APOL1 și riscul de boală renală cronică nondiabetică (IRC) nu este pe deplin înțeles. Studiile anterioare au minimizat un rol cauzal pentru proteina circulantă APOL1, deci eforturi de înțelegererinichipatogeneza s-a concentrat pe APOL1 exprimat în celulele renale. Dintrerinichicelulele raportate la expresAPOL1, thetubul proximalmodelele de expresie sunt inconsecvente în rapoartele publicate și dacă APOL1 este sintetizat de cătretubul proximalsau, eventual, proteina APOL1 din sânge este filtrată și reabsorbită de tubul proximal rămâne neclară. Folosind atât metode de proteină, cât și ARNm in situ, modelul de expresie renală al APOL1 a fost examinat la șoareci transgenici cu cromozomi artificiali umani normali și APOL1 bacterieni cu și fără proteinurie. Proteina APOL1 și ARNm au fost detectate în podocite și celule endoteliale, dar nu și în epiteliile tubulare. În cazul proteinuriei, proteina plasmatică APOL1 nu pare să fie filtrată sau reabsorbită de cătretubul proximal. O examinare paralelă a anticorpilor comerciali utilizați în studiile anterioare sugerează că rapoartele originale ale APOL1 în tubii proximali reflectă probabil nespecificitatea anticorpilor. Ca atare, expresia APOL1 în podocite și endotelii ar trebui să rămână în centrul atenției pentru studiile mecaniciste în APOL1-mediaterinichiboli.
Introducere
Polimorfismele din gena APOL1 contribuie la un risc semnificativ pentru mai multe forme de cronică non-diabeticărinichiboala (CKD) [1–3]. Acest risc apare dintr-o combinație de moștenire recesivă a alelelor variantei APOL1 plus expunerea la un factor de stres de mediu. Funcția patogenă a variantelor APOL1 și modul în care acestea interacționează cu stresorul de mediu pentru a cauza CKD nu sunt pe deplin înțelese. Deși APOL1 este prezent în mod constitutiv în circulație, studiile anterioare au minimizat un rol cauzal pentru proteina circulantă APOL1 [4-7] și eforturile de a înțelegerinichiPatogeneza s-a concentrat pe APOL1 exprimat în celulele renale. Modelul de expresie renală APOL1 rămâne neclar cu discrepanțe publicate între imunohistochimia și rezultatele hibridizării in situ ARNm, în special proteina APOL1 abundentă observată în epiteliul tubului proximal [8–10]. Deoarece APOL1 este abundent în sânge, nu este clar dacă APOL1 este filtrat, în special în cazul proteinuriei, care ar putea duce la reabsorbția proteinei APOL1 de cătretubul proximal. Apariția APOL1 în tubul proximal, fie prin expresia genei, fie prin reabsorbție din filtrat, ar indica rolul potențial important altubul proximalîn patogeneza CKD asociată APOL1-.
APOL1 în circulație este legat de o particulă HDL3 de 500 kDa, cunoscută sub numele de factorul tripanolitic 1, un complex IgM sărac în lipide de 1000 kDa, cunoscut sub numele de factorul tripanolitic 2 și, posibil, alți complexe săraci în lipide, de moleculă înaltă, asociați cu complementul factori [7, 11–13]. Proteinele produse de cele două alele variante APOL1 asociate cu CKD, G1 și G2, leagă factorii tripanolitici cu greutate moleculară mare, similari cu alelei comune G0 [14]. Deși proteina APOL1 (42,5 kDa) este suficient de mică pentru a trece de limita de restricție a dimensiunii barierei de filtrare glomerulară, nu se știe că circulă independent de aceste complexe cu greutate moleculară mare [15]. Cu toate acestea, lipoproteinele și alte componente ale HDL-urilor pot fi filtrate [16], iar în cazul proteinuriei, proteinele cu greutate moleculară mai mare, restricționate în mod normal de bariera de filtrare, pot apărea infiltrate. Nu este clar dacă complexele care conțin APOL1 sau APOL1-poate fi filtrate în cazul proteinuriei.
Pentru a rezolva aceste probleme, am examinat atât expresia genei APOL1, cât și a proteinei la omrinichițesut și rinichi de la modele de șoareci transgenici umanizați care recreează expresia APOL1 nativă umană. Pentru aceste studii, am validat anticorpii comerciali anti-APOL1 pentru specificitate care ar fi putut contribui la discrepanțe anterioare privind modelele de expresie renală. În plus, au fost realizate modele de șoareci transgenici APOL1proteinuriceprin încrucișarea cu un model de nefropatie asociată cu HIV (HIVAN), o CKD puternic asociată cu transportul alelelor de risc APOL1, pentru a determina dacă proteinuria ar modifica aspectul proteinei APOL1 în epiteliul tubular.
Faceți clic pentru organicCistanche pentru boala cronica de rinichi
Materiale și metode
Modele de țesut uman și șoarece
Om fixat cu formalină, încorporat în parafinărinichi(n {{0}}) și țesutul hepatic (n=3) de la marginile normale ale rezecțiilor canceroase au fost obținute de la Cleveland Clinic Lerner ResearchInstitute Biorepository. Au fost descrise anterior trei linii de șoarece transgenice care exprimă un fragment genomic uman de 47 kb într-un cromozom artificial bacterian (BAC) care cuprinde promotorul și regiunile de codificare ale genei umane APOL1 pentru fiecare alele G0, G1 sau G2 [17, 18]. Fiecare dintre liniile transgenice BAC-APOL1 a fost �10 generații retroîncrucișate cu FVB/Nj, un fundal genetic susceptibil la HIVAN. Modelul HIVAN de șoarece folosit pentru a induce proteinuria a fost Tg26 HIVAN4 congenic [19] care dezvoltă proteinurie și glomeruloscleroza segmentară focală progresivă ca modelul parental Tg26 (JacksonLaboratory #22354), dar progresia bolii este mai lentă. Pentru toate studiile, boala renală a fost monitorizată săptămânal după înțărcare prin măsurarea proteinuriei (adică a cantității de proteine din urina evacuată spontan) prin analiză de urină utilizând rize de diagnosticare (Uristix, Siemens Healthcare). Obiectivul uman aprobat de IACUC pentru boala renală în acest model a fost proteinurie care ajunge la 4 plus pe tija. Niciun animal nu a atins acest obiectiv uman înainte de obiectivul predeterminat al studiului, deoarece acest studiu a necesitat un stadiu incipient al disfuncției renale (proteinurie pe tija de 2 plus până la 3 plus) ca funcționare.rinichierau necesare încă capabile de filtrare și reabsorbție. Toate animalele și-au menținut greutatea normală și au prezentat niveluri tipice de îngrijire și activitate și nu au suferit durere sau suferință în timpul studiului. Toate animalele au fost monitorizate de două ori pe săptămână de către tehnicieni veterinari care nu sunt asociați cu acest studiu pentru sănătatea generală și bunăstarea și niciun animal nu a necesitat analgezice sau alte îngrijiri de susținere. Fiecare linie de șoarece transgenic BAC-APOL1 a fost încrucișată cu modelul de șoarece HIVAN4 și a fost sacrificat la 8– La vârsta de 10 săptămâni, când boala lor de rinichi a progresat la niveluri de proteinurie de 2 plus prin rijă de urină (G0 n=15, G1 n=11, G2 n=9). Colecțiile terminale de urină, sânge și țesuturi au fost efectuate sub anestezie profundă cu izofluran, urmată imediat (în timp ce era încă sub anestezie) de eutanasie folosind luxația cervicală. Albuminuria a fost evaluată prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă a 1 ul de urină, urmată de colorarea Coomassie. Utilizarea țesutului uman a fost revizuită și aprobată de Cleveland Clinic IRB (IRB-06-050). S-a renunțat la consimțământul informat deoarece țesutul a fost considerat aruncat și nu au fost colectate date identificabile. Toate studiile pe animale au fost revizuite și aprobate de comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor de la Cleveland Clinic și Case Western Reserve University (IACUC-2430).
Imunofluorescența tisulară
Fixat cu formalină, încorporat în parafinărinichisecțiunile de țesut au fost supuse recuperării antigenului așa cum s-a descris anterior [8]. Anticorpii utilizați pentru a examina expresia APOL1 în această lucrare a fost un iepure anti-APOL1 uman (Sigma, HPA018885, lot E105260, diluție 1:400). Au fost de asemenea evaluate numeroase loturi din acest policlonal de iepure Sigma, în plus față de alți anticorpi monoclonali comerciali, iar rezultatele sunt rezumate. în Tabelul suplimentar 1A 1C și Figura suplimentară 1 în Datele S1. De notat, multe dintre aceste loturi de anticorpi policlonali au fost epuizate și nu mai sunt disponibile de la Sigma. Alți anticorpi primari includ APOA1 anti-șoarece de iepure (ThermoFisher, diluție 1:500), CD31 anti-șoarece de capră (sisteme R&D, diluție 1:200), anti-nefrină de cobai (USB, 1:200) și anti-GLEPP1 de șoarece ( darul lui Roger Wiggins, 1:50). Lectina Lotus tetragonolobus marcată cu FITC (VectorLabs) a fost folosită pentru etichetaretubul proximalcelule așa cum a fost descris anterior [8]. Pentru testarea anticorpilor comerciali împotriva APOL1 uman, țesuturile renale au fost fixate folosind o varietate de metode și au fost încorporate în parafină pentru imunohistochimie folosind diferite metode de recuperare a antigenului. Detalii pentru fiecare dintre aceste metode de procesare sunt furnizate în Metodele detaliate suplimentare în datele S1.
Expresia genei și proteinei APOL1
Concentrația de proteină APOL1 în plasmă a fost determinată utilizând imunotestul electrochemiluminiscență Meso Scale Discovery așa cum a fost descris anterior [5]. Concentrația a fost determinată în raport cu o soluție cunoscută de lipoproteine de înaltă densitate umană calibrată prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă. Nivelurile serice ale proteinei APOL1 și APOA1 au fost comparate utilizând Westernblotting așa cum a fost descris anterior [20].
hibridizarea ARNm in situ
Expresia genei APOL1 a fost examinată la șoarece și la omrinichiși țesut hepatic folosind hibridizarea ARNm in situ. Kit-ul manual de hibridizare in situ RNAScope (ACDBio) a fost utilizat pentru țesutul fixat în formol, încorporat în parafină, urmând instrucțiunile kit-ului pentru detectarea fie cu sondă simplă, fie cu sondă dublă. Sondele au inclus APOL1 uman (număr de catalog 439871), nefrină murină (Nphs1, număr de catalog 433571) și CD31 murin (Pecam1, număr de catalog 316721). Pretratările au fost fierbere de 15 minute și digestia cu protează de 30-minute. Semnalul de hibridizare in situ apare ca puncte; un punct la zece celule este fundalul așteptat.
Rezultate
Mai mulți anticorpi comerciali anti-APOL1 uman (Tabelul suplimentar 1A din Datele S1) au fost examinați pentru specificitatea față de APOL1 umană folosind extracte de țesut sau proteine de la om și șoarecerinichisi celule. Deoarece șoarecii nu au un ortolog al APOL1 uman, celulele murine și țesuturile nu ar trebui să fie imunoreactive la anticorpii împotriva APOL1 uman. În Western blotting, majoritatea anticorpilor monoclonali și policlonali comerciali au fost capabili să detecteze APOL1, deși mai mulți APOL1 au detectat slab cu o detectare mai puternică a proteinelor nespecifice (benzi de geluri care nu au coincis cu greutatea moleculară a APOL1, SupplementalTable 1B în S1 Data). Majoritatea anticorpilor au detectat proteine nespecifice suplimentare, care diferă în funcție de sursa extractelor proteice (Tabelul suplimentar 1B din Datele S1). Unele dintre aceste benzi de gel nespecifice ar putea fi eliminate prin pretratarea extractelor proteice cu enzime de glicozilare (neprezentate), sugerând că recunoașterea epitopului a fost dependentă de glicani. În testele de imunohistochimie, rinichiul de șoarece de tip sălbatic utilizat ca control negativ a fost comparat cu rinichiul de șoarece transgenic APOL1 (Tabelul suplimentar 1C în Datele S1). Mulți dintre anticorpii anti-APOL1 au detectat în mod eronat proteine la șoarecele de tip sălbatic.rinichi, inclusiv imunocolorarea foarte puternică în tubuli (Figura suplimentară 1 din Datele S1). Pe baza acestor studii de validare, am selectat un lot de anticorpi policlonali Sigma cu detecție limitată în afara țintei pentru a examina modelele de expresie APOL1.
În umanrinichi, proteina APOL1 a fost detectată prin imunofluorescență în glomeruli, dar nu în tubuli (Fig 1A). Modele de expresie similare în rinichii umani au fost observate utilizând hibridizarea ARNm in situ. ARNm APOL1 a fost prezent în glomeruli, capilarele peritubulare și vasele mai mari ale rinichilor, dar nu în niciun segment de tub (Fig 1B). Un studiu anterior al primitorilor de transplant de ficat uman a stabilit că proteina APOL1 circulantă este în mare parte produsă de ficat [21]. În ficatul uman, modelele de expresie ale proteinei APOL1 și ARNm au fost similare, expresia fiind detectată în hepatocite și endotelii vasculare. La șoareci, expresia APOL1 a fost calitativ mai scăzută în hepatocitele din zona 1 și 2, comparativ cu hepatocitele din zona 3, în timp ce, la om, hepatocitele din toate cele trei zone au fost similare ca nivel de expresie (Figura suplimentară 2 din Datele S1). Țesuturile hepatice de șoarece proveneau de la adulți sănătoși, în timp ce țesuturile hepatice umane erau margini normale de la rezecțiile canceroase care aveau, de asemenea, dovezi histopatologice de steatoză, contribuind potențial la această diferență.
Simptome cistanche-insuficiență renală
Modelul de expresie observat în țesutul uman a fost confirmat în trei linii de șoarece transgenice care exprimă un BAC uman care cuprinde întreaga regiune genomică APOL1 fie pentru alelele G0, G1 sau G2 [17, 18]. Proteina APOL1 a fost abundentă în podocite și, de asemenea, a fost prezentă în celule endoteliale ale capilarelor glomerulare, capilare peritubulare și endoteliilor vaselor mai mari (Fig 2A). Nu a fost detectată nicio proteină APOL1 întubul proximalsau orice alt segment tubular (Fig 2B). De asemenea, similar cu oamenii, șoarecii transgenici BAC-APOL1 au avut APOL1 din abundență în sânge (Figura 3) și au exprimat proteina APOL1 și ARNm în hepatocitele hepatice (Figura 2 suplimentară din Datele S1). Înrinichi, această proteină APOL1 circulantă ar putea fi detectată și în sângele prins în spațiile vasculare (Fig 2B). Nu a existat nicio diferență în modelele de expresie APOL1 între șoarecii care exprimă APOL1-G{0, -G1 sau -G2 (Fig 2B) și este în concordanță cu studiile anterioare în biopsiile umane de la pacienți cu APOL1 diferit. genotipuri[8, 10, 22]. Modelele de expresie a proteinei APOL1 au fost, de asemenea, confirmate utilizând hibridizarea in situ a ARNm (Fig 4). Toate cele trei genotipuri APOL1 au fost examinate, dar nu au existat diferențe bazate pe genotipul APOL1. În concordanță cu umanulrinichi(Fig 1), APOL1 a fost exprimat inpodocite (tipul de celule confirmat cu etichetarea ecologică cu Nphs1) și endoteliul vascular (tipul de celule confirmat cu etichetarea ecologică cu Pecam1), inclusiv capilarele glomerulare, capilarele peritubulare și vase mai mari. Expresia APOL1 nu a fost detectată întubii proximalisau orice alt segment tubular.
Fig. 1. Proteina APOL1 și expresia ARNm la omrinichi. A. Exprimarea proteinei APOL1 prin microscopie cu imunofluorescență folosind anticorpi anti-APOL1 validați, cu co-imunocolorare cu GLEPP1 pentru a identifica podocitele și DAPI ca colorație nucleară. B. Expresia ARNm APOL1 prin hibridizare in situ. Expresia a fost evidentă în podocite ("P") și endoteliile vasculare ale capilarelor glomerulare ("E"), capilarelor peritubulare ("1", săgeți) și epiteliilor vaselor mai mari ("2"), dar nu epiteliilor tubulare. Bară de scară=40μm
Cistanche-rinichi
Niciunul dintre șoarecii BAC-APOL1 nu a dezvoltat spontan proteinurie, ceea ce este în concordanță cu descrierea inițială a acestor modele de șoarece [17, 18], dar a dezvoltat proteinurie grea atunci când a fost încrucișat cu un model de nefropatie asociată HIV (Fig 5). Folosind imunofluorescența, a fost observată imunocolorarea nespecifică a anticorpilor anti-APOL1 la șoarecele de tip sălbatic și HIVAN.rinichi, mai ales în capsula Bowman (Fig 6A). La șoarecii încrucișați cu proteinurie, proteina APOL1 a fost evidentă în glomeruli, dar nicio proteină APOL1 nu a fost detectată în infiltrat sau întubii proximali(Fig 6B). Prin Western blot, APOL1 nu a putut fi detectat în urina evacuată a șoarecilor proteinurici (datele nu sunt prezentate). De asemenea, nu a existat nicio diferență în modelul de expresie a APOL1 întreproteinuriceȘoareci care exprimă APOL{{0}}G0, -G1 sau -G2. Acești rinichi de șoarece au fost imunocolorați pentru APOA1 și apolipoproteina care este filtrată, ca control pozitiv pentru distribuția vasculară șitubul proximalmodele de reabsorbție. Similar cu APOL1, APOA1 în plasmă a fost ușor detectat în lumeni capilare glomerulari. Cu toate acestea, deoarece APOA1 este filtrat, a fost prezent și în picăturile de reabsorbție a proteinelor de la marginea periei tubului proximal (Fig 6C). În cazul proteinuriei, picăturile de reabsorbție care conțin APOA1-au crescut în număr și dimensiune latubul proximalmarginea pensulei. Modelul similar în tubul proximal nu a fost observat cu APOL1.
Fig 2. Expresia proteinei APOL1 la șoarecele transgenic BAC-APOL1rinichi. A. Colorare imunofluorescentă pentru APOL1, nefrină (pentru identificarea podocitelor) și CD31 (pentru identificarea celulelor endoteliale) în rinichiul de șoarece transgenic BAC-APOL1 (este prezentat șoarecele G1). B. Compararea modelelor de expresie APOL1 în toate cele trei linii transgenice APOL1.Tubuli proximaliau fost identificate prin etichetarea cu lectină fluorescentă Lotus tetragonolobus (LT). APOL1 a fost prezent în endoteliile vasculare (vârfuri de săgeți), în podocite (săgeți) și prins în spațiile vasculare (�), dar nu în epiteliile tubulare. Bară de scară=40μm
Fig 3. Proteina APOL1 în circulație în modelele de șoarece transgenic BAC-APOL1. Nivelurile de proteine APOL1 din plasmă au fost măsurate prin imunotestare la șoarecii transgenici în comparație cu tovarășii de tip sălbatic (WT) de tip sălbatic (WT, n=10; G0, n=6; G1, n { {11}}; G2, n=10; toate animalele erau masculi, în vârstă de aproximativ 21 de săptămâni). Nivelurile de expresie APOL1 în fiecare linie transgenică au fost toate semnificativ diferite de WT (P<0.0001). data="" are="" mean±sd,="" one="" measurement="" per="" animal,="" with="" significance="" determined="" by="" one-way="">
Discuţie
Specificitatea anticorpilor a fost recunoscută ca una dintre cele mai semnificative provocări care afectează cercetarea reproductibilă [23]. Noi și alții am raportat inițial că proteina APOL1 este prezentătubii proximalia subiecților normali și bolnavi [8, 9]. Cu toate acestea, munca noastră continuă cu alți anticorpi anti-APOL1 și folosind hibridizarea ARNm in situ a indicat că APOL1 nu a fost exprimat în tubii proximali [10]. O posibilitate rămasă este ca sângele proteinei APOL1 să fie filtrat și reabsorbit, ducând la apariția proteinei APOL1 înproximaltubuli. Folosind metode in situ care nu se bazează pe anticorpi, împreună cu șoarecii transgenici umani BAC-APOL1 nou disponibili, nici proteina APOL1, nici ARNm APOL1 nu au putut fi detectate în epiteliile tubulare. În cazul proteinuriei, APOL1 nu a fost, de asemenea, filtrat. În mâinile noastre, anticorpul policlonal de iepure Sigma recunoaște în mod constant APOL1 uman, dar diferențe între lot și recunoașterea altor proteine. Lotul policlonal de iepure Sigma folosit în studiile de aici nu reproduce cel puternictubul proximalcolorare observată în loturile anterioare vândute sub același număr de catalog. Deși anticorpii monoclonali ar elimina variația inerentă în loturile de producție de anticorpi policlonali, anticorpii monoclonali comerciali testați au avut o nespecificitate semnificativă sau o sensibilitate scăzută pentru APOL1. Un raport recent care descrie dezvoltarea și validarea unui număr mare de anticorpi monoclonali împotriva APOL1 uman, de asemenea, nu a identificat colorarea tubului proximal la om.rinichi[24].
Dovezi împotrivatubul proximalexpresia APOL1, sau un rol pentru tubul proximal în CKD asociate APOL1-, se acumulează din alte câteva grupuri. Un studiu care utilizează modele similare de șoarece transgenic APOL1 umanizat creat cu fosmide, de asemenea, nu a găsit expresia APOL1 în tubul proximal folosind atât metode de detectare a proteinelor, cât și a ARNm [25]. Utilizarea modelelor transgenice cu expresie inductibilă a APOL1 care limitează expresia fie la podocite, fie la tubuli găsite proteinurie și patologia renală apare numai atunci când APOL1 este exprimată în podocite, și nu în tubul [6]. Ca dovezi de coroborare la oameni, mai multe studii care au analizat proteomul urinei umane [26–30] nu au identificat proteina APOL1 în urină, indicând, de asemenea, că APOL1 nu este filtrat în nicio cantitate detectabilă.
Studiile noastre nu exclud posibila eliberare a unor cantități mici de APOL1 în filtratul primar din podocite, fie prin secreție, fie prin eliberare pasivă atunci când un podocit moare și lizează. Spre deosebire de APOL1 exprimat și secretat de hepatocite, podocitele majore ale transcriptinei APOL1 nu au o peptidă semnal completă [15] și nu există dovezi concludente că podocitele secretă APOL1. Alternativ, unele studii au observat că nivelurile înalte ale APOL1 induse de boală pot produce, de asemenea, izoforme rare îmbinate alternativ, cu diferite secvențe de peptide semnal care permit posibil secreția [24, 31-33]. Aceste potențiale surse alternative de infiltrat APOL1 ar fi fost sub limitele de detectare în testele pe care noi și alți investigatori le-am folosit înrinichițesut și urină și ar fi o explicație puțin probabilă pentru expresia robustă a APOL1 raportată anterior în tubii proximali. În plus, nu este clar dacă acest nivel scăzut potențial de infiltrat APOL1 derivat din podocite ar avea o semnificație fiziologică, având în vedere că la om, nivelurile bazale ale expresiei APOL1 nu sunt asociate cu CKD. De asemenea, studiile noastre nu pot exclude posibile diferențe în expresia APOL1 între oameni și șoarecii transgenici BAC-APOL1. Funcția podocitelor șiproximaltubuliîn filtrarea și reabsorbția sângelui sunt fundamental similare între oameni și șoareci, cu toate acestea, există limitări recunoscute ale utilizării șoarecilor în ceea ce privește replicarea bolilor renale glomerulare umane [34].
Fig 4. Expresia ARNm APOL1 în modelele de șoarece transgenic BAC-APOL1. Hibridarea in situ a ARNm duplex pentru expresia genei (AD)APOL1 și nefrină (Nphs1) și expresia (EK) APOL1 și CD31 (Pecam1) la celulele orendoteliale podocite identificate. Expresia APOL1 a fost detectată în capilarele peritubulare („săgețile 1”), arteriole („săgețile 2”), capilarele glomerulare („săgețile 3”), podocite (săgețile „4” și arterele mai mari (interlobulare) („5”) și vene ("6") dar nutubii proximali("PT") sau orice alt segment tubular. Imaginile afișate sunt de la șoareci BAC-APOL1-G0 și BAC-APOL1-G1.
Fig. 5. Modelele de șoarece transgenic BAC-APOL1 au dezvoltat proteinurie similară atunci când au fost încrucișate cu modelul HIVANmouse. A. Exemplu de proteinurie la șoareci transgenici unici și duali evaluați prin electroforeză pe gel a urinei (colorație Coomassie). Vârful de săgeată marchează albumina și alte proteine urinare cu greutate moleculară mică (asterisc) sunt descoperiri anormale la șoareci. B. Western blot de ser de șoarece la aceiași șoareci transgenici unici și duali care arată menținerea unor niveluri ridicate de proteină APOL1 seric în stabilirea proteinuriei. APOA1 Western blot ca control pentru proteina serică comună care este filtrată liber. Este prezentată pata reprezentativă; numărul de animale examinate în fiecare grup de genotip au fost: tip sălbatic, n=3; HIVAN4, n=6; G0 x HIVAN4, n=6; G1 x HIVAN4, n=3; G2 x HIVAN4,n=4
Lucrările prezentate aici și alte studii publicate au arătat asemănări semnificative între oameni [8–10, 24] și modelele de expresie APOL1 de șoarece transgenic [17, 18, 24]. O observație reproductibilă și consistentă din aceste studii combinate este o expresie a APOL1 în podocite și în celulele endoteliale ale capilarelor glomerulare, capilare peritubulare și vaselor de sânge mai mari. În plus, observațiile de aici susțin indirect concluziile din studiile anterioare [4, 5] că proteina APOL1 în circulație este puțin probabil să contribuie larinichipatogeneza bolii, deoarece nu este sursa APOL1 localizată în rinichi. Evaluarea contribuției APOL1 exprimat în podocite și endoteliu este un obiectiv logic pentru studiile viitoare care examinează mecanismul pentru contribuțiile variantei de risc APOL1 la patogenia CKD.
Fig 6. APOL1 nu apare în tubii proximali înproteinuriceȘoareci transgenici BAC-APOL1. A. Controlul imunocolorării la șoarecii HIVAN4 netransgenici (de tip sălbatic) și proteinurici pentru APOL1 împreună cu legarea lectinei fluorescente Lotustetragonolobus ("LT") pentru a delimitatubul proximalmarginea pensulei. Deoarece șoarecii de tip sălbatic și HIVAN4 nu au APOL1, colorarea observată în celulele parietale (săgeți) este un artefact. B. Imunocolorarea pentru APOL1 înproteinuriceȘoarecii BACtransgenici ai fiecărui genotip APOL1 (sunt prezentate imagini reprezentative, numărul de animale examinate în fiecare grup de genotip a fost același ca pentru Fig 5). Imaginile aratătubii proximalila trecerea cu capsula Bowman. Regiunea în casetă este mărită sub fiecare panou împreună cu canalele fluorescente izolate prezentate în alb și negru. C. Imunocolorarea controlului pozitiv pentru o lipoproteină filtrată, APOA1, şi lectină Lotus tetragonolobus („LT”) marcată fluorescent. Sunt prezentate un șoarece APOL1-G0 și un șoarece transgenic dual APOL{1-G{{0 x HIVAN4 cu proteinurie; sub fiecare panou de culoare respectiv sunt canalele fluorescente individuale (în alb și negru) ale regiunii în casete fie pentru lectina LT, fie pentru APOA1. Săgețile albe marchează capilarele glomerulare care conțin proteină APOA1 circulantă în lumenii capilare, săgețile roșii indică APOA1 în picăturile de reabsorbție a proteinelor la marginea periei a tubilor proximali. Bară de scară=40μm.
Informatii justificative
Date S1. Figuri și tabele suplimentare. (PDF)
S1 Imagini brute. Imagini cu gel originale, nedecupate.(PDF)
Mulțumiri
Mulțumim lui William Baldwin și Nina Dvorina pentru asistență cu studiile de validare a anticorpilor
Contribuții ale autorului
Conceptualizare: Sethu M. Madhavan, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, JohnF. O'Toole, Leslie A. Bruggeman.Controlarea datelor: Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin, Leslie A. Bruggeman.Analiza formală: Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin ,Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman.Achiziție de finanțare: John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman.Investigație: Natalya A. Blessing, Zhenzhen Wu , Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Leslie A. Bruggeman.Metodologie: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, LeslieA. Bruggeman.Administrarea proiectului: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole,Leslie A. Bruggeman.Resurse: Myung K. Shin.Supervizarea: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A.Bruggeman.Validare: Myung K. Shin.Scriere – schiță originală: Natalya A. Blessing, Leslie A. Bruggeman.Scriere – recenzie și editare: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, MichelleChen, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A.Bruggeman.
Referințe
1. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et al. Asocierea variantelor ApoL1 tripanolitice curinichiboala la afro-americani. Ştiinţă. 2010; 329(5993):841–5.https://doi.org/10.1126/science.1193032 PMID: 20647424
2. Genovese G, Tonna SJ, Knob AU, Appel GB, Katz A, Bernhardy AJ și colab. O alela de risc pentru glomeruloscleroza segmentară focală la afro-americani este situată într-o regiune care conține APOL1 și MYH9. Rinichi Int. 2010; 78(7):698–704. https://doi.org/10.1038/ki.2010.251 PMID: 20668430
3. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. Mutațiile misense ale genei APOL1 sunt foarte asociate cu riscul de boală renală în stadiu terminal atribuit anterior genei MYH9. Hum Genet. 2010; 128(3):345–50. https://doi.org/10.1007/s00439-010-0861-0 PMID:20635188
4. Bruggeman LA, O'Toole JF, Ross MD, Madhavan SM, Smurzynski M, Wu K, et al. Nivelurile plasmatice ale apolipoproteinei L1 nu se corelează cu CKD. J. Am. Soc. Nefrol. 2014; 25(3):634–44. https://doi.org/10.1681/ASN.2013070700 PMID: 24231663
5. Kozlitina J, Zhou H, Brown PN, Rohm RJ, Pan Y, Ayanoglu G și colab. Nivelurile plasmatice ale variantei de risc APOL1 nu se asociază cu bolile renale într-o cohortă bazată pe populație. J. Am. Soc. Nephrol.2016; 27(10):3204–19. https://doi.org/10.1681/ASN.2015101121 PMID: 27005919
6. Beckerman P, Bi-Karchin J, Park AS, Qiu C, Dummer PD, Soomro I, et al. Exprimarea transgenică a variantelor de risc uman APOL1 în podocite inducerinichiboala la soareci. Nat. Med. 2017; 23(4):429–38. https://doi.org/10.1038/nm.4287 PMID: 28218918
7. Weckerle A, Snipes JA, Cheng D, Gebre AK, Reisz JA, Mura M, et al. Caracterizarea complexelor de proteine APOL1 circulante la afro-americani. J Lipid Res. 2016; 57(1):120–30. https://doi.org/10.1194/jlr.M063453 PMID: 26586272
8. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Ganesan S, Bruggeman LA, Sedor JR. Localizarea APOL1 în boli renale normale și nondiabetice. J. Am. Soc. Nefrol. 2011; 22(11):2119–28.https://doi.org/10.1681/ASN.2011010069 PMID: 21997392
9. Ma L, Shelness GS, Snipes JA, Mura M, Antinozzi PA, Cheng D și colab. Localizarea proteinei APOL1 și ARNm la omrinichi: țesut neboli, celule primare și linii celulare imortalizate. J. Am.Soc. Nefrol. 2015; 26(2):339–48. https://doi.org/10.1681/ASN.2013091017 PMID: 25012173
10. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Barisoni L, Thomas DB, Ganesan S, et al. Variantele APOL1 modifică dinamica conformațională C-terminală și legarea la proteina SNARE VAMP8. JCI Insight.2017; 2(14):e92581. https://doi.org/10.1172/jci.insight.92581 PMID: 28724794
11. Raper J, Fung R, Ghiso J, Nussenzweig V, Tomlinson S. Caracterizarea unui nou factor litic tripanozom din ser uman. Imunitatea la infecție. 1999; 67(4):1910–6. https://doi.org/10.1128/IAI.67.4.1910-1916.1999 PMID: 10085035
12. Smith AB, Esko JD, Hajduk SL. Uciderea tripanozomilor de către proteina umană legată de haptoglobina. Ştiinţă. 1995; 268(5208):284–6. https://doi.org/10.1126/science.7716520 PMID: 7716520
13. Vanhamme L, Paturiaux-Hanocq F, Poelvoorde P, Nolan DP, Lins L, Van Den Abbeele J, et al. Apolipoproteina LI este factorul litic tripanozomal al serului uman. Natură. 2003; 422(6927):83–7. https://doi.org/10.1038/nature01461 PMID: 12621437
14. Gutierrez OM, Judd SE, Irvin MR, Zhi D, Limdi N, Palmer ND, et al. Variantele de risc de nefropatie APOL1 sunt asociate cu profiluri modificate de lipoproteine de înaltă densitate la afro-americani. Nefrol DializaTransplant. 2016; 31(4):602–8. https://doi.org/10.1093/ndt/gfv229 PMID: 26152403
15. Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, Kane JP. Familia de gene a apolipoproteinei L: expresie specifică țesutului, splicing, regiuni promotoare; descoperirea unei noi gene. J Lipid Res. 2001; 42(4):620–30.PMID: 11290834
16. Yang H, Fogo AB, Kon V. Rinichi: modulatori cheie ai nivelurilor și funcției de lipoproteine de înaltă densitate. CurrOpin Nephrol Hypertens. 2016; 25(3):174–9. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000217 PMID:27008596
17. Okamoto K, Rausch JW, Wakashin H, Fu Y, Chung JY, Dummer PD și colab. ARN-ul alelei de risc APOL1 contribuie la toxicitatea renală prin activarea protein kinazei R. Comm. Biol. 2018; 1:188. https://doi.org/10.1038/s42003-018-0188-2 PMID: 30417125
18. Ryu JH, Ge M, Mescher S, Rosenberg AZ, Descente M, Roshanravan H, et al. Variantele cu risc renal APOL1 promovează acumularea de colesterol în țesuturi și macrofage cultivate de la APOL1 transgenicmic. Plus unu. 2019; 14(4):e0211559. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211559 PMID:30998685
19. Prakash S, Papeta N, Sterken R, Zheng Z, Thomas RL, Wu Z și colab. Identificarea locusului de susceptibilitate la nefropatie HIVAN4. J. Am. Soc. Nefrol. 2011; 22(8):1497–504. https://doi.org/10.1681/ASN.2011020209 PMID: 21784893
20. Bruggeman LA, Wu Z, Luo L, Madhavan SM, Konieczkowski M, Drawz PE și colab. Modelele transgenice APOL1-G0 sau APOL1-G2 dezvoltă preeclampsie, dar nuRinichiBoala. J. Am. Soc. Nefrol. 2016; 27(12):3600–10. https://doi.org/10.1681/ASN.2015111220 PMID: 27026370
21. Shukha K, Mueller JL, Chung RT, Curry MP, Friedman DJ, Pollak MR și colab. Majoritatea ApoL1 este secretată de ficat. J. Am. Soc. Nefrol. 2017; 28(4):1079–83. https://doi.org/10.1681/ASN.2016040441 PMID:27932478
22. Sampson MG, Robertson CC, Martini S, Mariani LH, Lemley KV, Gillies CE, et al. Genomica integrativă identifică asociații noi cu genotipurile de risc APOL1 la subiecții NEPTUNE negru. J. Am. Soc.Nephrol. martie 2016; 27(3):814–23. https://doi.org/10.1681/ASN.2014111131 PMID: 26150607
23. Bradbury A, Pluckthun A. Reproductibilitate: Standardizarea anticorpilor utilizați în cercetare. Natură. 2015; 518(7537):27–9. https://doi.org/10.1038/518027a PMID: 25652980
24. Scales SJ, Gupta N, De Mazière AM, Posthuma G, Chiu CP, Pierce AA, et al. Anticorpii specifici pentru apolipoproteina L1-Detectă APOL1 endogen în interiorul reticulului endoplasmatic și pe membrana plasmatică a podocitelor. J. Am. Soc. Nefrol. 2020; 31(9):2044–64. https://doi.org/10.1681/ASN.2019080829 PMID: 32764142
25. Aghajan M, Booten SL, Althage M, Hart CE, Ericsson A, Maxvall I, et al. Tratamentul cu oligonucleotide antisens ameliorează proteinuria indusă de IFN-gamma la șoarecii transgenici APOL1-. JCI Insight. 2019; 4(12).https://doi.org/10.1172/jci.insight.126124 PMID: 31217349
26. Adachi J, Kumar C, Zhang Y, Olsen JV, Mann M. Proteomul urinar uman conține mai mult de 1500 de proteine, inclusiv o proporție mare de proteine membranare. Genom Biol. 2006; 7(9):R80. HTTPS://doi.org/10.1186/gb-2006-7-9-R80 PMID: 16948836
27. Li QR, Fan XK, Li RX, Dai J, Wu CC, Zhao SL și colab. O abordare cuprinzătoare și neprefracționată la nivel de proteine pentru proteomul urinar uman: atingerea fosforilării în urină. Spectrom de masă rapidă. 2010; 24(6):823–32. https://doi.org/10.1002/rcm.4441 PMID: 20187088
28. Marimuthu A, O'Meally RN, Chaerkady R, Subbannayya Y, Nanjappa V, Kumar P și colab. O hartă cuprinzătoare a proteomului urinar uman. J Proteome Res. 2011; 10(6):2734–43. https://doi.org/10.1021/pr2003038 PMID: 21500864
29. Santucci L, Candiano G, Petretto A, Bruschi M, Lavarello C, Inglese E, et al. De la sute la mii: extinderea urinomului uman normal. Rezumat de date. 2014; 1:25–8. https://doi.org/10.1016/j.dib.2014.08.006 PMID: 26217681
30. Zhao M, Li M, Yang Y, Guo Z, Sun Y, Shao C și colab. O analiză cuprinzătoare și adnotare a proteomului urinar normal uman. Rapoarte științifice. 2017; 7(1):3024. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03226-6 PMID: 28596590
31. Cheatham AM, Davis SE, Khatua AK, Popik W. Blocarea situsului de îmbinare 5' al exonului 4 de către un morfolinooligomer declanșează comutarea izoformei proteinei APOL1. Rapoarte științifice. 2018; 8(1):8739. https://doi.org/10.1038/s41598-018-27104-x PMID: 29880816
32. Khatua AK, Cheatham AM, Kruzel ED, Singhal PC, Skorecki K, Popik W. Secvența codificată cu exon 4-este un determinant major al citotoxicității apolipoproteinei L1. Am J Physiol Cell Physiol. 2015; 309(1):C22–37. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00384.2014 PMID: 25924622
33. Nichols B, Jog P, Lee JH, Blackler D, Wilmot M, D'Agati V, et al. Căile imunității înnăscute reglează gena nefropatiei Apolipoproteina L1.RinichiInt. 2015; 87(2):332–42. https://doi.org/10.1038/ki.2014.270 PMID: 25100047
34. Pippin JW, Brinkkoetter PT, Cormack-Aboud FC, Durvasula RV, Hauser PV, Kowalewska J, și colab. Modele de rozătoare inductibile ale bolilor podocitelor dobândite. Am J. Physiol Renal Physiol. 2009; 296(2):F213–29. https://doi.org/10.1152/ajprenal.90421.2008 PMID: 18784259
