Peroxidarea lipidicelor lizozomale reglează imunitatea tumorală

Inhibarea lizozomală determinată de inhibitorii palmitoil-protein tioesterazei 1 (PPT1), cum ar fi DC661, poate produce moartea celulei, dar mecanismul pentru aceasta nu este complet înțeles. Căile de moarte celulară programate (autofagie, apoptoză, necroptoză, ferroptoză și piroptoză) nu au fost necesare pentru a obține efectul citotoxic al DC661. Inhibarea catepsinelor sau chelarea fierului sau calciului nu a salvat citotoxicitatea indusă de DC661-. Inhibarea PPT1 a indus peroxidarea lizozomală a lipidelor (LLP), care a dus la permeabilizarea membranei lizozomale și la moartea celulelor care ar putea fi inversată de antioxidantul N-acetilcisteină (NAC), dar nu de alți antioxidanți de peroxidare a lipidelor. Transportorul de cisteină lizozomal MFSD12 a fost necesar pentru transportul intralizozomal al NAC și salvarea LLP. Inhibarea PPT1 a produs imunogenitate celulară intrinsecă cu expresia de suprafață a calreticulinei care a putut fi inversată doar cu NAC. Celulele tratate cu DC661-au amorsat celulele T naive și au crescut toxicitatea mediată de celulele T. Șoarecii vaccinați cu celule tratate cu DC661-au generat imunitate adaptivă și respingerea tumorii în tumorile „imunitare fierbinți”, dar nu și în tumorile „imune reci”. Aceste descoperiri demonstrează că LLP conduce la moartea celulelor lizozomale, o formă imunogenă unică de moarte celulară, indicând calea către combinații raționale de imunoterapie și inhibare lizozomală care pot fi testate în studiile clinice.

Beneficiile cistanche tubulosa-Antitumoral

Introducere

Cu activitate încurajatoare în studiile clinice care implică inhibitorul lizozomal hidroxiclorochină (HCQ) (1), identificarea palmitoil-protein tioesterazei 1 (PPT1) ca țintă moleculară a derivaților de clorochină (2) și lansarea de noi inhibitori PPT1 în clinică. (3, 4), este nevoie de a înțelege mecanismul prin care inhibitorii lizozomali induc moartea celulelor și efectul inhibării lizozomale asupra imunității tumorii. Mecanismul canonic al morții celulelor lizozomale descris pentru HCQ implică permeabilizarea membranei lizozomale (LMP), scurgerea catepsinelor și activarea apoptozei mediate de caspază (5, 6). Am arătat anterior că inhibitorul lizozomal DC661 pătrunde în celulele din micromediul tumoral acid și se localizează la lizozom mai eficient decât HCQ (2, 7). DC661 produce moarte celulară puternică în multe linii de celule canceroase (2). DC661 se leagă și inhibă PPT1, deacidifică lizozomul și inhibă autofagia. DC661 induce, de asemenea, LMP și crește nivelurile de caspază 3 scindată (2, 7). În ultimii ani, au fost definite noi mecanisme de moarte celulară care au consecințe imunogene și includ necroptoza, ferroptoza și piroptoza (8). S-a demonstrat că autofagia dependentă de lizozom degradează MHC clasa I (9), precum și componentele imunoproteazomului (10), sugerând că inhibarea autofagiei poate îmbunătăți procesarea antigenului. Cu toate acestea, efectele imunogene ale inhibării lizozomale și ale morții celulare care rezultă nu au fost pe deplin caracterizate. Pentru a aborda această lipsă de cunoștințe, am investigat efectele DC661 asupra mecanismelor canonice de moarte celulară pentru a determina dacă moartea celulelor lizozomale este forma sa de moarte celulară sau pur și simplu un precursor al unuia dintre celelalte mecanisme stabilite. Am descoperit că HCQ și DC661 au indus o creștere semnificativă doar a unui număr mic de proteine ​​în proteomul melanomului și cele mai multe dintre acestea au fost proteine ​​legate de autofagie și apoptoză. Inhibitorii morții celulare programate (apoptoză, necroptoză, ferroptoză și piroptoză) nu au atenuat efectele citotoxice după afectarea lizozomală de către DC661. Peroxidarea lipidică lizozomală (LLP) este un factor major al morții celulare induse de LMP asociată cu expresia calreticulinei (CALR) pe suprafața celulei. Această formă de moarte celulară poate fi inversată numai prin utilizarea antioxidantului N-acetilcisteină (NAC). Activitatea NAC a fost afectată de inhibarea importatorului de cisteină lizozomală MFSD12. LLP a provocat fenotipuri imunogene care promovează uciderea mediată de celulele T. Aceste descoperiri demonstrează că moartea celulelor lizozomale este o formă potențial unică de moarte a celulelor imunogene.

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

Rezultate

Inhibarea lizozomală induce modificări semnificative în proteom asociat cu autofagie și apoptoză. Pentru a stabili efectele citotoxice ale inhibitorilor lizozomali, am evaluat viabilitatea melanomului A375P, carcinomului de colon RKO și liniilor celulare de cancer pancreatic MIA PaCa-2 tratate cu inhibitorul vacuolar de H+-ATPază bafilomicina-A1 (1 0{0 nM); inhibitori PPT1 DC661 (3 μM) sau HCQ (10 μM sau 30 μM); palmitat mimetic fluorură de hexadecil sulfonil (HDSF; 60 μM); inhibitori de catepsină pepstatina A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/ml) sau PepA+E64; și disruptor de membrană lizozomală bromhidrat de ester metilic Leu-Leu (20 μM) timp de 48 de ore. Doar bafilomicina-A1 și DC661 au provocat o scădere semnificativă a viabilității celulare în liniile de celule canceroase (Figura 1A și Figura 1A suplimentară; material suplimentar disponibil online cu acest articol; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), DC661 producând o reducere mai profundă a viabilității celulare decât bafilomicina-A1. Pe baza acestor date și a proprietăților farmacologice asemănătoare medicamentelor ale derivaților de clorochină, ne-am concentrat studiul asupra derivaților de clorochină ca instrumente pentru a înțelege moartea celulelor lizozomale. O analiză globală imparțială a proteomului a fost aplicată celulelor de melanom A375P tratate cu DC661 (3 μM) sau HCQ mai puțin puternic (10 μM sau 30 μM) timp de 24 de ore. Dintre cele 4.264 de proteine ​​cuantificate de înaltă încredere, doar 87 și 55 de proteine ​​au fost semnificativ crescute cu DC661 (3 μM) și respectiv HCQ (30 μM); în plus, 14 și 15 proteine ​​au fost semnificativ scăzute cu DC661 (3 μM) și respectiv HCQ (30 μM), respectiv (schimbare absolută de ori mai mare de 2; q < 0,05) cu DC661 (3 μM) sau HCQ (30 μM), respectiv , în comparație cu controlul vehiculului. Doza mai mică de HCQ (10 μM) nu a arătat modificări semnificative ale proteinei în comparație cu controlul vehiculului. Primele 50 de proteine ​​care au crescut semnificativ în urma tratamentului cu DC661 au fost asociate în principal cu autofagie și apoptoză, iar modificări similare au fost observate pentru doza mai mare de HCQ (Figura 1B). Din aceste motive, am ales să ne concentrăm studiile suplimentare asupra DC661 mai puternic. Exemple de unele dintre cele mai mari modificări ale proteinelor asociate cu autofagie și apoptoză au fost proteina 1 de legare la tax1-(TAX1BP1; crescut de 15-ori); BCL2-proteina 3 care interacționează (BNIP3; crescut de 6-ori); vecinul proteinei 1 a genei BRCA1 (NBR1; crescut de 12-ori); sequestozom-1 (SQSTM1/p62; crescut de 5-ori); coactivatorul 4 al receptorului nuclear (NCOA4; crescut de 3-ori); și LC3B (MAP1LC3B; crescut de 3-ori). Apolipoproteina B-100 (APOB; crescută de 66-ori) a fost derivată din serul fetal de vițel și nu a fost studiată în continuare. Immunoblotting a confirmat că tratamentul cu DC661 sau concentrații mai mari de HCQ a produs creșteri marcate ale expresiei receptorilor de marfă autofagie NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 și NCOA4 într-o manieră dependentă de doză și timp (Figura suplimentară 1, B și C). CRISPR/Cas9 KO al PPT1 în celulele A375P a fenocopiat efectele DC661 asupra acestor proteine ​​în comparație cu omologii lor WT (Figura suplimentară 1D). Cu toate acestea, expresia receptorilor de marfă autofagie și creșterile relative induse de tratamentul cu DC661 au fost variabile între cancerul de colon, cancerul pancreatic și alte linii celulare de melanom în care DC661 demonstrează citotoxicitate (Figura suplimentară 1E). Acest lucru a sugerat că receptorii de marfă autofagie înșiși, deși au crescut la nivel de proteine, este puțin probabil să fie responsabili pentru moartea celulelor după tratamentul cu DC661. Pentru a confirma acest lucru, ne-am concentrat pe receptorii de marfă autofagie TAX1BP1 și BNIP3, deoarece au efecte proapoptotice cunoscute în celulele canceroase (Figura 1C). TAX1BP1 este un adaptor de marfă autofagie (11) și, de asemenea, reglează apoptoza indusă de inhibitorii sintezei proteinelor sau agenții care dăunează ADN-ului în celulele canceroase (12). Eliminarea TAX1BP1 de către siRNA (Figura 1D) nu a afectat citotoxicitatea indusă de DC661-în testele de viabilitate pe termen scurt (Figura 1E) și pe termen lung (Figura 1F). Aceste rezultate au demonstrat că TAX1BP1 nu joacă un rol esențial în citotoxicitatea mediată de DC661-. BNIP3 este o proteină proapoptotică care afectează bioenergetica mitocondrială și reglează mitofagia (13). Eliminarea eficientă a BNIP3 (Figura 1G) nu a afectat citotoxicitatea indusă de DC661-(Figurile 1, H și I). Aceste rezultate au arătat că efectele citotoxice ale DC661 sunt independente de expresia BNIP3. Apoi, am studiat efectele epuizării celulelor genelor autofagie canonice necesare pentru producerea autofagozomului asupra eficacității DC661 prin distrugerea unc-51 cum ar fi kinaza de activare a autofagiei 1 (ULK1) și gena 7 asociată autofagiei (ATG7). Eliminarea eficientă a ULK1 sau ATG7 (Figura suplimentară 2, A și B) a inhibat fluxul autofagic (Figura suplimentară 2C), dar nu a afectat citotoxicitatea indusă de DC{146} (Figura 1, J-M). Aceste rezultate au arătat că absența mașinilor esențiale de autofagie de bază nu abrogă efectele citotoxice ale DC661. Inhibarea lizozomală de către DC661 induce mai multe căi programate de moarte celulară. Punctul de vedere canonic este că moartea celulelor lizozomale se datorează apoptozei (5). Imunoblotting a arătat că tratamentul cu DC661 a dus la activarea caspazei-3, -7 și -9 și scindarea PARP{-1, confirmând că DC661 a activat apoptoza (Figura 2A). Inhibitorul de pan-caspază Z-VAD-FMK a prevenit activarea caspazei de către DC661, dar nu a inhibat acumularea de LC3B și p62, demonstrând că activarea apoptozei și blocarea autofagiei sunt separabile după inhibarea lizozomală (Figura 2B). Blocarea apoptozei cu ZVAD-FMK nu a sporit și nu a limitat citotoxicitatea DC661, sugerând că apoptoza este dispensabilă pentru moartea celulelor lizozomale (Figura 2, C și D). Efectele citotoxice ale DC661 au fost similare în celulele Bax/Bak dublu-KO de măduvă osoasă primară incapabile să sufere apoptoză și celulele WT (Figura 2E). Blocarea apoptozei nu a afectat citotoxicitatea indusă de DC{171}} în cancerul de colon și în celulele canceroase pancreatice (Figura suplimentară 2, D-F). Deoarece am constatat că apoptoza este dispensabilă pentru moartea celulară indusă de DC661-, am investigat dacă DC661 induce necroptoză, o altă formă de moarte celulară programată reglată de protein kinaza care interacționează cu receptorul (RIPK) și proteina asemănătoare domeniului kinazei de linie mixtă ( MLKL). Nivelurile formelor fosforilate și activate ale RIPK și MLKL au fost crescute după tratamentul cu DC661 de la 0,1-1 μM (Figura 2F). La 3 μM DC661 a existat o absență a RIPK1 fosforilat, dar MLKL fosforilat persistent, ceea ce sugerează că, la această concentrație mai mare, ar putea fi implicate forme suplimentare de moarte celulară. Pretratamentul cu inhibitori RIPK1 necrostatina-1 sau necrostatina-1 sau inhibitorul MLKL necrosulfonamidă a prevenit fosforilarea RIPK1 după tratamentul cu DC661 (1 μM) în celulele melanomului (Figura 2G), dar nu a reușit să salveze DC{{192 }} citotoxicitatea indusă în celulele melanomului (Figura 2H) sau a cancerului de colon sau a celulelor canceroase pancreatice (Figura suplimentară 2G). Aceste descoperiri sugerează că necroptoza este activată, dar nu poate fi eliminată pentru moartea celulară mediată de DC{195}}.

Figura 1. Inhibarea autofagiei lizozomale induce modificări semnificative în proteinele apoptozei și autofagiei. (A)

Lizozomii sunt unul dintre principalele locuri de depozitare a fierului. Metabolismul dereglat al fierului intracelular, cuplat cu capacitatea redusă de reducere, poate declanșa o moarte celulară nonapoptotică cunoscută sub numele de ferroptoză. Un semn distinctiv al feroptozei este reglarea în sus a prostaglandinei-endoperoxid sintetazei 2 (PTGS2), omologul 1 al regulatorului de transport al cationilor (CHAC1) și cisteinil-ARNt sintetazei (CARS) (14). Toți cei 3 markeri de feroptoză au fost reglați în mod transcripțional prin tratamentul cu DC661 (Figura 3A), sugerând că inhibarea lizozomală induce ferroptoza. DC661 a indus o schimbare de fluorescență în celulele A375P tratate cu C11-BODIPY, indicând peroxidarea lipidelor, caracteristică feroptozei. Această schimbare indusă de DC661-a fost inversată semnificativ în prezența inhibitorilor de ferroptoză ferostatină-1 sau roxstatina de buze{-1 administrați la o concentrație eficientă (Figura 3B și Figura 3A suplimentară), indicând în continuare că DC661 ferroptoza indusă. Cu toate acestea, inhibarea feroptozei nu a salvat citotoxicitatea asociată cu DC661 (Figura 3, C și D). Cotratamentul celulelor canceroase cu chelatorul de fier deferoxamină (DFO) și DC661 nu a salvat citotoxicitatea DC661 (Figura 3E). Tratamentul cu ferostatină-1, roxstatina buzelor-1 sau DFO nu a salvat inhibarea DC661 a viabilității pe termen scurt sau a creșterii clonogene pe termen lung în celulele canceroase de melanom, colon și pancreas (Figura suplimentară 3, B). –E și Figura suplimentară 4, A–D). Aceste date demonstrează că ferroptoza este activată, dar nu este posibilă pentru moartea celulară mediată de DC661-. O piroptoză este o formă de moarte celulară programată asociată cu un răspuns inflamator care implică activarea caspazelor care procesează gastrina (GSDM), permițând formarea porilor pe membrana plasmatică și eliberarea ulterioară a modelelor moleculare asociate leziunilor, cum ar fi mobilitatea ridicată. caseta de grup 1 (HMGB1). Tratamentul cu DC661 în mai multe linii celulare de melanom (A375P, A375, WM35 și WM793) a dus la activarea caspazei inițiatoare-8 și -9 și a caspazei călăului-7, tipice pentru piroptoză, și a produs scindarea GSDME de lungime completă, similară ca măsură cu cunoscutul inductor de piroptoză PLX4720 și PD0325901 (Figura suplimentară 5A). DC661 a produs o eliberare extracelulară mai puternică de HMGB1 decât cunoscutul inductor de piroptoză, BRAF și inhibarea MEK în 1% FBS (15), reflectând consecința funcțională a piroptozei activate. Apoi, am testat dacă inhibarea piroptozei de către GSDME KO ar ameliora efectele citotoxice ale DC661. Tratamentul cu DC661 a indus acumularea LC3II și SQSTM1/p62 și activarea caspazei, dar eliberarea HMGB1 a fost aproape complet abrogată în celulele umane GSDME-KO WM35, demonstrând că a fost atinsă consecința funcțională a inhibării piroptozei (Figura 3F). Cu toate acestea, tratamentul cu DC661 a produs citotoxicitate egală în YUMM1.7 WT, vector gol (EV) și celulele Gsdme KO1 și KO2 în condiții FBS de 10% și 1% (Figura 3G și Figura suplimentară 5B). Un rezultat comun al multiplelor forme de moarte celulară este eliberarea de LDH. DC661 a produs o creștere semnificativă a eliberării LDH și aceasta nu a putut fi inversată prin inhibarea apoptozei, necroptozei sau feroptozei (Figura suplimentară 5C). Aceste rezultate au arătat că DC661 induce mai multe moduri de moarte celulară, inclusiv apoptoza și piroptoza, precum și necroptoza și ferroptoza, dar niciunul dintre aceste moduri de moarte celulară nu este necesar pentru moartea celulară indusă de DC661-. Inhibarea catepsinei sau chelarea calciului nu previne moartea celulelor din permeabilizarea membranei lizozomale. După ce am demonstrat că activarea caspazei (care este necesară pentru apoptoză și piroptoză) este nelipsită pentru moartea celulară indusă de DC661-, am emis ipoteza că eliberarea de catepsină din lizozomi ar putea provoca moartea celulară dependentă de caspază. Inhibarea chimică (DC661) sau genetică (PPT1 siRNA [siPPT1]) a PPT1 a produs permeabilizarea membranei lizozomale (LMP), în timp ce HDSF, un inhibitor ireversibil mai puțin puternic al PPT1 care se epuizează rapid în cultura celulară, nu a putut induce LMP, așa cum sa măsurat. prin galectin-3-punctul pozitiv (Figura 4A). LMP are ca rezultat eliberarea catepsinelor și a altor conținuturi lizozomale în citoplasmă și se crede că este o caracteristică proximală cheie a morții celulare pe bază de lizozom. LMP indus de DC661 a fost asociat cu o creștere semnificativă a activității citoplasmatice a catepsinei-L, care a fost blocată semnificativ cu un inhibitor de cistein protează E64 (Figura 4B). Rapoartele anterioare au sugerat că eliberarea de catepsină din lizozomii fracturați promovează activarea caspazei, ducând la moartea celulelor apoptotice (16-18). Inhibarea completă a catepsinei nu a prevenit scindarea caspazei (Figura 4C) și nu a salvat citotoxicitatea indusă de DC661-în testele de viabilitate pe termen scurt și pe termen lung în melanom (Figura 4, D și E), cancer de colon și pancreas. celule canceroase (Figura suplimentară 6, A–C). Aceste rezultate contracarează punctul de vedere canonic al morții celulelor lizozomale, determinată de moartea celulară mediată de catepsină. Pe lângă eliberarea de catepsină din lizozomii cu scurgeri, eliberarea de calciu din lizozomi a fost implicată în disfuncția celulară atunci când PPT1 este afectat (19). Tratamentul cu DC661 a dus la o eliberare extinsă de calciu, care a fost abrogată prin pretratarea chelatorului permanent de calciu (Ca2+), BAPTA-AM. (Figura 4F). În special, BAPTA-AM nu a prevenit LMP indus de DC{105}(Figura 4G) sau scindarea caspazei (Figura suplimentară 6, D și E) și, cel mai important, nu a salvat citotoxicitatea indusă de DC{108}( Figura 4H). Aceste constatări au fost observate, de asemenea, atât în ​​liniile celulare RKO, cât și în MIA PaCa-2, în care nu au fost observate diferențe semnificative în valorile IC50 cu BAPTA-AM și DC661 (Figura suplimentară 6F), ceea ce sugerează că moartea celulară asociată cu LMP este nu depinde de calciu sau catepsine.

Figura 2. Apoptoza și necroptoza induse de DC661-. (A)

Figura 3. Feroptoză și piroptoză induse de DC661-. (A)

LLP conduce LMP. După ce am stabilit că inhibitorii căilor majore de moarte celulară (apoptoză, necroptoză, ferroptoză și piroptoză), catepsine (PepA și E64) și chelatori de ioni (BAPTA-AM [Ca2+] și DFO [Fe{{3}) }]) nu a prevenit moartea celulelor de către DC661 și găsind dovezi ale peroxidării lipidelor de către C-11-BODIPY, am efectuat o analiză globală a lipidomului la 2 și 4 ore după tratamentul cu DC661. DC661 a indus creșteri precoce și susținute de 3- până la 10-ori în fiecare clasă de lizofosfolipide (Figura 5A). În schimb, s-au observat modificări minime sau deloc în clasele de fosfolipide, inclusiv fosfatidilcolină, fosfatidiletanolamină, fosfatidilserina, fosfatidilinozitol, fosfatidilglicerol și acid fosfatidic (Figura suplimentară 7A). Speciile de lizofosfolipide pot fi generate de ROS, care oxidează lanțul de acizi grași saturati care este apoi scindat de fosfolipaze (20). Pentru a determina dacă antioxidanții ar putea preveni deteriorarea lipidelor mediată de ROS, am investigat citotoxicitatea indusă de DC661-în prezența N-acetilcisteinei (NAC) (21, 22) și a presupusi inhibitori ai peroxidării lipidelor Trolox (23) (23). ) și vitamina C (acid ascorbic) (24, 25). Spre deosebire de oricare dintre ceilalți agenți testați până acum, cotratamentul cu NAC a salvat citotoxicitatea asociată DC661-pe mai multe linii celulare (Figura 5B și Figura 7B suplimentară). Testele CFU pe termen lung au arătat că NAC, spre deosebire de toți inhibitorii morții celulare, chelatorii ionici și inhibitorii de catepsină testați aici, a prevenit efectele citotoxice ale DC661 în celulele A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 și MC38 ( Figura 5C și Figura suplimentară 7C). Interesant, Trolox și vitamina C nu au salvat citotoxicitatea DC661 în melanomul uman, cancerul colorectal, celulele canceroase pancreatice și melanomul murin și celulele cancerului colorectal (Figura 5D și Figura suplimentară 7, D-H). Această disparitate ne-a determinat să testăm dacă NAC, Trolox și vitamina C au afectat LMP. Rezultatele noastre au arătat că NAC a fost singurul antioxidant care a redus semnificativ LMP indus de DC661-(Figura 5E). Am emis ipoteza că LLP conduce producția de LMP de către DC661, care poate fi inversată de NAC, dar nu de Trolox și vitamina C. Pentru a studia procesul de LLP am folosit sonda fluorescentă FOAM-LPO (26), care se localizează în mod specific la lizozom și produce o schimbare spectrală de la 586 la 512 nm (roșu la verde) atunci când este expus la peroxizi lipidici. Am constatat că DC661 a indus LLP în comparație cu controlul (Figura 5F). NAC a redus peroxidarea lipidelor în lizozomii celulelor melanomului tratate cu DC661-, în timp ce Trolox și vitamina C nu au reușit să reducă LLP (Figura 5F). NAC, Trolox și vitamina C nu au avut un efect semnificativ asupra peroxidării lipidelor. Eliminarea PPT1 (Figura suplimentară 8A) sau tratamentul cu concentrații mari de HCQ (Figura suplimentară 8B) a indus, de asemenea, LMP care ar putea fi inversat de NAC, în timp ce inhibarea chimică a ULK1 nu a indus LMP (Figura suplimentară 8C). În mod important, distrugerea siPPT1 a inclus și LLP care ar putea fi inversat cu NAC (Figura suplimentară 8D) Aceste rezultate au arătat că inhibarea PPT1 induce LLP care poate fi salvat de NAC și este probabil cauza LMP indusă de inhibarea PPT1-. În plus, aceste constatări au sugerat că LLP este critic pentru moartea celulelor lizozomale.

Planta chinezească cistanche plantă-Antitumoral

Importul de cisteină în lizozomi de către MFSD12 atenuează moartea celulelor lizozomale. Dintre cei 3 inhibitori ai peroxidării lipidelor, numai NAC a prevenit LLP. Un raport recent a arătat că domeniul major al superfamiliei facilitatorului care conține 12 (MFSD12) este o componentă esențială a importatorului de cisteină pentru lizozomi și melanozomi (27). Am argumentat că NAC, sau metabolitul său cisteină, este transportat în lizozom prin MFSD12, unde cisteina este oxidată la disulfura sa, cisteină. Pentru a testa această ipoteză, am comparat capacitatea NAC de a salva citotoxicitatea DC661 în celulele siNT și siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Rezultatele noastre au arătat că NAC a salvat LMP indus de DC661-în celulele siNT, dar nu a salvat LMP în celulele siMFSD12 (Figura 6A). NAC a redus LLP al celulelor siNT-A375P tratate cu DC661-, dar nu și al celulelor siMFSD12. Celulele siMFSD12 tratate cu DMSO sau NAC au avut LLP bazal crescut (Figura 6B) în comparație cu celulele siNT. În timp ce NAC a salvat citotoxicitatea DC661 în celulele siNT, capacitatea NAC de a salva citotoxicitatea DC661 a fost complet abrogată în celulele siMSFD12 (Figura 6C). Acest lucru a arătat că knockdown-ul MFSD12 blochează efectele citoprotectoare ale NAC împotriva DC661. NAC este deacetilat de către acilază în citosol (28). Pentru a determina dacă tratamentul cu NAC produce o acumulare de cisteină sau cistină în lizozomi, am folosit tehnica de imunoprecipitare lizozomală (Lyso-IP) (29) pentru a purifica lizozomii din celulele A375P tratate cu DMSO și NAC (Figura 6D și Figura 9A suplimentară) și am efectuat metabolomica vizată pentru a cuantifica NAC și metaboliții înrudiți. După cum era de așteptat, NAC a fost detectat în lizat de celule întregi tratat cu NAC și fracțiile nelegate asociate. Nivelurile de L-cisteină au crescut substanțial în lizozomii tratați cu NAC. L-cistina a fost detectabilă numai în lizozomii tratați cu NAC. În mod surprinzător, nu am găsit o creștere semnificativă a glutationului (redus) în grupurile tratate cu NAC (Figura 6E); acest lucru a fost surprinzător, deoarece se crede în mod obișnuit că tratamentul cu NAC induce producția crescută de glutation, corectând echilibrul redox. Aceste rezultate sugerează că cisteina importată în lizozomi prin importatorul MFSD12 este critică pentru salvarea LLP, LMP și moartea celulelor lizozomale. LLP este imunogen. Unele forme de moarte celulară reglată indusă de DC661 (piroptoză, necroptoză, ferroptoză) au fost identificate ca imunogene. Anterior, moartea celulară imunogenă a fost descrisă pentru medicamentele de chimioterapie pe baza trăsăturilor caracteristice, care includ afișarea modelelor moleculare asociate cu deteriorarea, inclusiv expresia CALR la suprafața celulară și eliberarea proteinei HMGB1 și a adenozin trifosfat (ATP) (30). CALR acționează ca un semnal „mănâncă-mă” atunci când este expus la suprafețele celulare în timpul stresului celular. Eliberarea extracelulară a HMGB1 și ATP acționează ca un semnal „găsește-mă” recunoscut de celulele fagocitare. Am comparat două modele: celulele B16F10, care în modelele tumorale singeneice sunt aproape complet lipsite de limfocite care infiltrează tumora și celulele MC38, care în modelele tumorale singeneice au limfocite infiltrante tumorale. În primul rând, am demonstrat că tratamentul cu DC661 sau siPpt1 induce în mod semnificativ expresia CALR de suprafață care poate fi complet abrogată cu cotratamentul NAC în celulele MC38 (Figurile 7, A și B). Descoperiri similare au fost observate în celulele B16F10 (Figura 7C). Inhibitorii căilor majore de moarte celulară (apoptoză, necroptoză, ferroptoză și piroptoză) nu au reușit să prevină expresia de suprafață a CALR (Figura 7D). Pentru a determina dacă moartea celulelor imunogene indusă de DC661 se datorează reglării MHC clasa I, celulele B16F10 și MC38 au fost tratate cu DC661 (3 μM) sau DMSO timp de 24 de ore. Am descoperit că tratamentul cu DC661 nu a crescut expresia MHC clasa I și reglarea imunoproteazomului (Figura 7E și Figura suplimentară 9, B și C).

Figura 4. Inhibarea catepsinei sau chelarea calciului nu previne moartea celulară indusă de DC661-. (A)

Pentru a înțelege efectele inhibării autofagiei asupra amorsării celulelor T, am efectuat un experiment de amorsare și cocultură in vitro folosind splenocite C57BL6/J așa cum a fost descris anterior (31). Pentru amorsare, am expus splenocitele la celulele B16F10 sau MC38 tratate cu DC661- sau DMSO. Apoi, aceste splenocite amorsate au fost cultivate cu celule vii B16F10 sau MC38 și s-a măsurat citotoxicitatea (Figura 8A). Splenocitele amorsate cu celule B16F10 tratate cu DC661-au produs o creștere semnificativă a IFN-ului în comparație cu splenocitele expuse la celulele B16F10 tratate cu DMSO. Uciderea mediată de celule T amorsate a celulelor B16F10 în proliferare a fost semnificativ crescută în splenocitele amorsate cu DC661-în comparație cu splenocitele amorsate cu DMSO (Figura 8, B și C). Celulele MC38 tratate cu DC661 au produs și mai multă citotoxicitate cu IFN și celule T amorsate în comparație cu celulele B16F10 (Figura 8, D și E). Cotratamentul NAC cu DC661 a fost capabil să elimine complet eliberarea de IFN din splenocite și citotoxicitatea celulelor T amorsate (Figura 8, F și G). Eliminarea calreticulinei de către siCalr în celulele MC38 (Figura suplimentară 9D) a abrogat eficacitatea de amorsare a tratamentului cu DC661 și a redus semnificativ citotoxicitatea celulelor T amorsate (Figura 8, H și I). Luate împreună, aceste date susțin un rol mecanic al reglării CALR asociate cu LLP în promovarea imunității celulelor T antitumorale. Apoi, am extins aceste constatări in vitro la un studiu de vaccinare antitumorală in vivo pe modele de șoareci imunocompetenți și imunodeficienți. Pentru acest test, celulele B16F10 sau MC38 tratate cu DC661-in vitro au fost injectate sc pe flancul stâng pentru a proteja șoarecii imunocompetenți C57BL/6 sau NOD/SCID împotriva reprovocarii cu celule tumorale vii de același tip injectate. 7 zile mai târziu în flancul drept (Figura 9A). Celulele B16F10 tratate cu DC661-nu au reușit să prevină respingerea tumorii în ciuda testelor in vitro, sugerând că DC661 a indus moartea celulelor imunogene (Figura 9B și Figura 9E suplimentară). În schimb, inocularea unui flanc cu celule MC38 tratate cu DC661-a promovat respingerea completă a celulelor MC38 vii implantate pe flancul opus (Figura 9C și Figura 9F suplimentară). Pentru a determina dacă imunitatea adaptivă a fost critică pentru efectul vaccinului pe care DC661 părea să îl aibă cu tumorile MC38, am repetat experimentul pe șoareci NOD/SCID. În mod surprinzător, am descoperit că celulele MC38 tratate cu DC661-nu au indus respingerea tumorilor de reprovocare la șoarecii NOD/SCID imunodeficienți (Figura 9D și Figura 9G suplimentară), ceea ce indică faptul că a fost necesară imunitatea adaptivă pentru efectul vaccinului observat. Pentru a testa robustețea acestei descoperiri, am selectat o altă linie de celule de cancer imunogenă de șoarece bine-cunoscută, CT26, și am efectuat experimentul de vaccinare ca mai sus. După cum era de așteptat, implantarea celulelor CT26 tratate cu DC661-pe un flanc al șoarecelui a produs un efect asemănător vaccinului și a prevenit creșterea celulelor CT26 vii implantate pe celălalt flanc (Figura 9E și Figura 9H suplimentară). Descoperirile noastre au sugerat că LLP indus de DC661- este critic pentru moartea celulelor imunogene mediată de LMP, care este inversată prin importul de cisteină în lizozom de către transportorul lizozomal MFSD12 (Figura 9F).

Discuţie

Inhibarea lizozomală pare a fi o abordare terapeutică promițătoare în studiile preclinice, iar studiile clinice HCQ au produs rezultate încurajatoare, dar mixte (1, 32). PPT1 este ținta moleculară a HCQ, iar inhibitorii PPT1 mai puternici, cum ar fi DC661 (2) și GNS561 (3), induc moartea celulară mediată de LMP in vitro. Mecanismul precis al morții celulelor lizozomale și rolul său în imunogenitatea tumorii nu a fost pe deplin elucidat. Imunitatea antitumorală este sporită atunci când inhibarea autofagiei este combinată cu imunoterapia (9, 10, 31). Mecanismele propuse pentru imunogenitatea intrinsecă a celulelor în urma inhibării autofagiei includ MHC clasa I și reglarea în sus a imunoproteazomului, care susțin ambele procesare și prezentare îmbunătățită a antigenului. În plus, pierderea proteinelor autofagiei sau inhibarea autofagiei de către clorochină a crescut răspunsul celulelor T CD8+ prin creșterea nivelurilor de suprafață ale MHC clasa I în celulele dendritice (33). Am arătat anterior că inhibarea sistemică a PPT1 poate repolariza macrofagele de la un fenotip M2 la M1. Inhibitorii PPT1 pot crește nivelurile STING, ducând la eliberarea de IFN și la creșterea uciderii mediate de celulele T în modelele de melanom (31). Aici, am demonstrat că LLP în sine produce o formă imunogenă intrinsecă a celulelor tumorale de moarte celulară. Am descoperit că inhibarea lizozomală a indus foarte puține modificări ale proteinelor în celulele canceroase, iar proteinele cele mai semnificativ crescute au inclus receptorii de încărcare autofagie și regulatorii apoptozei. Abordarea noastră care vizează unele dintre aceste gene în diferite funcții a demonstrat că proteinele induse de medicamente nu au fost probabil principalii regulatori ai morții celulare. Inhibarea genetică a ULK1 sau ATG7, de asemenea, nu a salvat citotoxicitatea DC661. Am demonstrat că inhibarea lizozomală activează mai multe forme de moarte celulară programată, inclusiv apoptoza, necroptoza, ferroptoza și piroptoza, dar fiecare dintre acestea a fost dispensabilă pentru citotoxicitatea indusă de medicamente. De notat, mecanismele de moarte celulară programată se pot suprapune, iar codirecționarea mecanismelor multiple de moarte celulară ar putea oferi citoprotecție împotriva morții celulare după permeabilizarea membranei lizozomale. Lucrarea noastră a exclus mecanismele dependente de catepsină și calciu pentru moartea celulelor lizozomale și a evidențiat importanța LLP ca determinant critic al morții celulare. Am găsit dovezi ale LLP care a fost reversibilă de către un antioxidant care a fost transportat în lizozom, NAC și a fost critică pentru permeabilizarea membranei lizozomale și citotoxicitate. NAC a fost singurul agent capabil să atenueze sau să inverseze moartea celulară indusă de DC661-, iar această capacitate a fost dependentă de prezența transportorului de cisteină lizozomal MFSD12. Lipsa penetrării lizozomale este probabil motivul pentru care alți presupusi inhibitori ai peroxidării lipidelor, Trolox și vitamina C, nu au putut preveni citotoxicitatea DC661. NAC este transformat în cisteină, care este importată în lizozomi și se oxidează în forma sa disulfură, cistina. Cistina este exportată în citosol de un alt transportator lizozomal, cistinoza, unde este redusă la cisteină care remobilizează sursele interne de nutrienți, reactivează ținta complexului 1 de rapamicină și promovează autofagia (34). Acest ciclu de oxidare-reducere a cisteinei la cistină (lizozomi) și înapoi la cisteină (citosol) ar putea fi un posibil mecanism de salvare al NAC împotriva citotoxicității DC661 sau, mai general, leziuni lizozomale în alte contexte de boală în care NAC sa dovedit a fi util terapeutic (35) . NAC nu numai că a inversat LLP și LMP induse de DC661-, ci și o expresie de suprafață a markerului imunogen al morții celulare calreticulina. Expresia la suprafața celulară a proteinei CALR a fost necesară pentru citotoxicitatea îmbunătățită mediată de celulele T indusă de splenocitele amorsate cu DC661-, demonstrând că inhibarea lizozomală produce o formă specifică de imunogenitate intrinsecă a celulei.

În timp ce studiile anterioare au demonstrat că inhibarea lizozomală poate îmbunătăți activitatea antitumorală a inhibării punctului de control imun în tumorile de flanc stabilite (9, 31), studiul nostru este primul din cunoștințele noastre care demonstrează un efect asemănător vaccinului pentru tumorile MC38, dar nu pentru tumorile B16 în celule tumorale pretratate cu DC661 înainte de implantare. Acest lucru demonstrează că moartea celulelor lizozomale poate induce imunogenitatea intrinsecă a celulei, dar aceste modificări în sine nu sunt suficient de probabile pentru a inversa un micromediu tumoral „imun rece” într-un micromediu tumoral „imun fierbinte”. Studiile noastre anterioare în modelele de micromediu tumoral „imunitar rece” B16 și BRafCA PtenloxP Tyr: modelele de șoarece modificate genetic CreERT2 (31) au demonstrat că inhibarea lizozomală sistemică a produs efecte asupra macrofagelor asociate tumorilor și a celulelor supresoare derivate din celule mieloide care au fost suficiente pentru a îmbunătăți eficacitatea imunoterapiei. Este posibil ca imunogenitatea intrinsecă a celulelor să joace, de asemenea, un rol în aceste tumori reci imune care devin mai sensibile la ICD în urma inhibării lizozomale. Efectul asemănător vaccinului al inhibiției lizozomale observat într-un mediu controlat de laborator se poate traduce sau nu în clinică, dar ar putea explica de ce unii pacienți tratați cu dabrafenib, trametinib și HCQ în melanomul mutant BRAF tratat anterior au avut un astfel de profund și durabil. răspuns la acest regim (32). Sunt necesare studii suplimentare pentru a înțelege modul în care inhibarea PPT1 produce ROS lizozomal și peroxidarea lipidelor. Reglarea dependentă de PPT1-a V-ATPazei și acidificarea lizozomală nu este o explicație suficientă, deoarece bafilomicina inhibă acidificarea lizozomală, dar nu produce LMP (datele nu sunt prezentate). Implicațiile acestor descoperiri sugerează că inhibitorii lizozomali care sporesc imunogenitatea intrinsecă a celulelor tumorale pot fi combinați rațional cu terapii care îmbunătățesc activarea celulelor T sau infiltrarea în micromediul tumoral, producând potențial efecte sinergice.

Figura 5. N-acetil cisteina previne moartea celulară indusă de DC661-. (A)

Metode

Cultură de celule. A375P uman (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL{- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) și liniile de celule B16F10 (CRL-6475) de mouse au fost achiziționate de la ATCC. Liniile umane A375 (CRL{-1619, ATCC), WM35, WM793 și YUMM1.7 de șoarece (WT, Gsdme EV și Gsdme KO1 și KO2) au fost obținute intern. Celulele MC38 și CT26 de șoarece au fost furnizate de Andy Minn, Universitatea din Pennsylvania. Celulele primare ale măduvei osoase FL5.12 și IL-3-dependente Bax-/-Bak-/- (Bax/Bak DKO) au fost obținute de la Kathryn E. Wellen, Universitatea din Pennsylvania. Linia celulară umană Panc-1 (CRL-1469, ATCC) a fost furnizată de Ben Z. Stanger, Universitatea din Pennsylvania. Linia celulară YUMMER 1.7 de șoarece a fost obținută de la Xiaowei (George) Xu, Universitatea din Pennsylvania. Toate liniile celulare au fost testate pentru Mycoplasma semestrial de către facilitățile de bază ale Universității din Pennsylvania și au fost autentificate folosind amprentele repetate în tandem de către Wistar Institute Genomics. Liniile celulare A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 şi Bax/Bak DKO au fost cultivate în RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Liniile celulare A375, MIA PaCa-2, Panc{-1, B16F10 și MC38 au fost cultivate în DMEM (Invitrogen, 11995); și celulele YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV și Gsdme KO1 și KO2) (15) au fost cultivate în DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Mediile de cultură au fost suplimentate cu 10% ser fetal bovin (12306C, MilliporeSigma) și 1 x soluție antimicotică cu antibiotice (Gibco, 15140-122). Liniile de celule FL5.12 și Bax/Bak DKO au fost menținute în mediu RPMI complet suplimentat cu 50 μM -mercaptoetanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) și 0,35 ng/mL și 3,5 ng /mL IL-3, respectiv. Liniile celulare YUMMER1.7 și YUMM1.7 (WT, Gsdme EV și Gsdme KO) au fost menținute în mediu complet suplimentat cu 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Celulele WM35 și WM793 au fost cultivate în mediu MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), care conține 10% FBS în mediu Leibovitz L-15 1 x (Corning, 10-045-CV), 7,5% g/v bicarbonat de sodiu ( Corning, 25-035-CI), 1 x soluție antimicotică cu antibiotice (Gibco, 15140-122) și 5 ug/mL insulină (MilliporeSigma, I0516). Celulele au fost crescute la 37 de grade în prezența a 5% CO2. Produse chimice și reactivi. Produsele chimice achiziționate au inclus HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) și DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) a fost folosit pentru a colora celulele pentru calciu conform instrucțiunilor producătorului. O listă de anticorpi și inhibitori este furnizată în Tabelul suplimentar 1 și Tabelul suplimentar 2.

Figura 6. NAC inversează LLP într-un mod dependent de MFSD12-. (A–C)

Extracția și digestia proteinelor pentru cromatografie lichidă-analiza spectrometrică de masă în tandem pentru proteomică. {{0}},7 × 106 celule de melanom A375P au fost cultivate în vase de cultură de 6{0 mm. Celulele au fost tratate cu DMSO (martor), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) sau HCQ (3{{70}} μM) timp de 24 de ore la aproximativ 5{{ 112}}% confluență. Peletele de celule congelate au fost lizate cu 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, {0,15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, şi 1 ug/ml leupeptină. Lizatele clarificate (10 ug fiecare) au fost supuse electroforezei 0,5 cm într-un gel bis-tris urmat de fixare și colorare cu Coomassie coloidal. Fiecare bandă de gel de 0,5 cm a fost excizată, colorată, redusă cu tris (2-carboxietil) fosfină, alchilată cu iodoacetamidă și digerată cu tripsină așa cum s-a descris anterior (36). Digestele (1 ug) au fost analizate prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă în tandem (LC-MS/MS) pe un spectrometru de masă Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) în conformitate cu un nanoAQUITY UPLC (Waters). Separarea analitică a fost efectuată pe o coloană de 1,7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 (Waters, 186003546) folosind un gradient de 245-minut cu acid formic 0,1% în apă (faza mobilă A) și acetonitril (faza mobilă B), după cum urmează : 5%–30% B peste 225 de minute, 30%–80% B peste 5 minute, 15-minut de menținere la 80% B și revenirea la condițiile inițiale. Spectrele MS complete au fost obținute la o rezoluție de 70,000, cu un interval de scanare de 400–2,000 m/z, o țintă de control automat al câștigului de 3 × 106 ioni și un timp maxim de injectare de 50 de milisecunde. Spectrele MS2 dependente de date au fost obținute pentru primii 20 de ioni cei mai abundenți la o rezoluție de 17.500, cu o lățime de izolare de 1,5 m/z, țintă de control automat al câștigului de 5 × 104 ioni și timp maxim de injectare de 50 de milisecunde. Potrivirea peptidei a fost setată la preferată, iar ionii nealocați și încărcați individual au fost respinși (37). Datele brute MS au fost analizate folosind MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) cu o bază de date de secvențe umane Uniprot (accesată pe 10 octombrie 2019) și o bază de date comună cu contaminanți, inclusiv tripsina, keratine, proteine ​​bovine, și micoplasmă (38). Specificitatea peptidei triptice cu maximum 2 clivajuri omise, modificarea fixă ​​a cisteinei (carbamidometilare) și oxidarea variabilă a metioninei sau acetilarea N-terminală au fost utilizate în căutare (39). O limită de 1% FDR a fost utilizată pentru peptide și proteine. Potrivirea între curse a fost activată; proteinele au fost cuantificate folosind cuantificare fără etichete (40). Analiza statistică a fost efectuată folosind Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Proteinele trebuia să fie identificate de cel puțin 3 peptide unice și să aibă 3 valori valide (cuantificare diferită de zero) într-un grup de probă, iar contaminanții și proteinele inverse au fost filtrate din setul de date. Valorile lipsă au fost imputate dintr-o distribuție normală. Comparațiile în perechi între condiții au fost efectuate la nivel de proteine ​​folosind un test t Student cu coadă cu FDR bazat pe permutare cu randomizări s0=0.1 și 250. Modificările semnificative au fost definite ca FDR mai mic de 5% și o modificare absolută a ori mai mare de 1,5 sau 2,0, așa cum este specificat. Lyso-IP. Celulele A375P au fost infectate cu lentivirus pLJC5-Tmem{192-3xHA și selectate folosind puromicină 1 mg/ml (MilliporeSigma, P4512). Aproximativ 3 × 106 celule A375P marcate cu HA au fost tratate fie cu NAC 10 mM, fie cu vehicul de control cu ​​apă timp de 24 de ore în condițiile de cultură descrise anterior. După tratament, celulele au fost spălate în PBS, recoltate în 0,5 ml KPBS rece și omogenizate ușor folosind 20 de mișcări într-un omogenizator Dounce de 2 ml. Aproximativ 2,5% din omogenat a fost rezervat pentru analiza lizatului de celule întregi, iar restul a fost centrifugat la 3,000g timp de 2 minute la 4 grade pentru a îndepărta resturile de membrana celulară. Supernatantul omogenat a fost apoi transferat într-un tub curat de 1,5 ml și incubat cu 50 μL bile anti-HA (Pierce, 88836) sau bile anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) timp de 15 minute la 4 grade. Probele au fost apoi precipitate prin plasarea tuburilor pe DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) și agitate ușor timp de 2 minute la temperatura camerei. Supernatantul a fost rezervat pentru analiza fracției nelegate. IP a fost spălat de 3 ori cu KPBS conţinând 8 mM CaCI2. Lyso-IP a fost extras în 80% MeOH pentru analiza metabolomică. Extracția și analiza lipidelor folosind LC-MS/MS pentru lipidomul global. Celulele de melanom A375P au fost însămânțate în vase de 60 mm la 0,7 × 106 celule per farfurie. Când celulele au fost la aproximativ 50% confluență, au fost tratate cu DMSO (martor), DC661 (3 μM) sau HCQ (30 μM) timp de 24 de ore. Celulele au fost spălate de 2 ori cu HBSS, răzuite în metanol răcit cu gheața și transferate în tuburi de sticlă pentru extracția lipidelor cu cloroform/metanol/0,88% NaCI (2:1:1) care conține un standard intern de lipide EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Probele s-au agitat în vortex și apoi s-au sonicat pe baie de apă timp de 5 minute pe gheață. După centrifugare la 500 g timp de 15 minute la 40 de grade, faza inferioară a fost transferată într-un alt tub de sticlă. Faza superioară a fost reextrasă folosind o fază inferioară sintetică. După sonicare și centrifugare, faza inferioară a fost combinată cu prima fază inferioară de colectare. Probele au fost uscate sub azot, resuspendate în 10% cloroform/90% metanol și transferate în fiole de sticlă LTQ. Probele de lipide au fost analizate pe un spectrometru de masă Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X și un sistem Vanquish Horizon UHPLC. Separarea analitică a folosit o coloană Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) cu 50:50 acetonitril/apă și 88:10:2 izopropanol/acetonitril/apă, fiecare conținând 5 mM formiat de amoniu și 0,1% acid formic. Datele LC-MS/MS au fost achiziționate separat în polarități pozitive și negative cu următorii parametri ai instrumentului: MS1 scan 120,000 rezoluție; MS2 dependent de date pe primii 20 de ioni cei mai abundenți la 15,000 rezoluție; 0,4 m/z lățime de izolare; și o energie de coliziune normalizată în trepte de 20:30:40 (43).

Figura 7. N-acetil cisteina previne expresia de suprafață a calreticulinei indusă de DC661-. (ANUNȚ)

Lipidele au fost identificate și cuantificate folosind LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Speciile de lipide identificate au fost filtrate prin aductii așteptați și gradul de identificare în funcție de clasă. Zonele de vârf au fost normalizate la standardele EquiSPLASH pentru clasele acceptate și normalizate în continuare pe baza suprafeței totale pentru fiecare probă pentru a corecta variația numărului de celule. Analiza statistică a fost efectuată pe date transformate în log folosind Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extracția și analiza metaboliților folosind LC-MS/MS pentru metabalon. Metaboliții polari au fost extrași din celule întregi, fracții Lyso-IP nelegate și probe legate de Lyso-IP folosind 80% metanol și au fost stocați la –8{{30}} grade înainte de cromatografia lichidă – analiza spectrometriei de masă (LC-MS). Extractele au fost analizate prin LC-MS utilizând un spectrometru de masă Thermo Scientific Q-Exactive HF-X cu o sondă HESI II în linie cu un sistem Thermo Vanquish Horizon UHPLC. Separarea LC a fost efectuată folosind o coloană ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, dimensiunea particulei 5 μm, EMD Millipore) cu o coloană de protecție ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) menținută la 45 de grade cu un debit. de 0,2 ml/min. Cromatografia a fost efectuată în condiții acide pentru a reduce reactivitatea grupărilor tiol. Faza mobilă A a fost apă şi B a fost acetonitril, ambele conţinând acid formic 0,1%. Gradientul LC a fost 85% B timp de 2 minute, 85% B până la 20% B timp de 15 minute, 20% B până la 85% B timp de 0,1 minute și 85% B timp de 8,9 minute. Autosamplerul a fost ținut la 4 grade și 4 μL din fiecare probă au fost injectați pe analiză. Au fost utilizați următorii parametri MS: debitul gazului de înveliș, 40 AU; debit gaz auxiliar, 10 UA; debitul de gaz de măturare, 2 UA; Temperatura încălzitorului de gaz auxiliar, 350 de grade; tensiune de pulverizare, 3,75 kV pentru modul pozitiv și 3,5 kV pentru modul negativ; temperatura capilară, 375 grade; și nivelul RF pâlnie, 40%. Toate probele au fost analizate prin MS complet cu comutare de polaritate. Scanările MS complete au fost obținute de la 65 la 975 m/z la o rezoluție de 120,000 cu o țintă de control automat al câștigului de 1 × 106 ioni și un timp maxim de injectare de 100 de milisecunde. Datele brute au fost analizate folosind TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Metaboliții vizați au fost identificați prin masă precisă și timp de retenție în polaritatea lor preferată, pe baza standardelor analitice. Detectarea vârfurilor a folosit algoritmul ICIS cu o netezire de 1. Cuantificarea relativă a fost efectuată folosind o zonă de vârf integrată, iar aceste valori au fost corectate la cantitatea totală per probă (definită ca suprafața totală a vârfului). Editare PPT1-CRISPR/Cas9. Celulele A375P PPT1-non-țintă și KO au fost preparate așa cum s-a descris anterior (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) a fost un cadou de la Feng Zhang (plasmida Addgene, 48139). Oligo ARN ghid (IDT) au fost recoaciți, fosforilați și apoi ligați în plasmida pX459 digerată și defosforilată cu BbsI urmând protocoalele de laborator Zhang, disponibile prin Addgene. Plasmidele ligate au fost transformate în celule Stbl3 (Invitrogen). Secvențierea preparatelor plasmide a confirmat prezența secvențelor de ARN ghid dorite. Celulele A375P au fost transfectate folosind Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), urmată de selecția puromicinei. Testele Surveyor au confirmat editarea genei PPT1 de către CRISPR/Cas9, iar distrugerea PPT1 a fost confirmată prin Western blot cu anticorp PPT1 (Origene). Secvențele pentru ARN-ul oligo-ghid sunt după cum urmează: ARN ghid non-țintă înainte (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ARN ghid non-țintă invers (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ARN ghid PPT1 uman înainte 1 (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), ARN ghid PPT1 uman 1 invers), ghid ARN 1 uman PPT1 invers (AAAGGGPTAGTCCAGGAA) înainte (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) și PPT1 uman ghid ARN 3 invers (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Clonele crescute din celule unice utilizate în această lucrare includ următoarele: clona C8 este ghidul uman 1 și clona B5 este ghidul uman 3. Imunoblotting. Un milion de celule au fost placate într-un vas de 10 cm, iar tratamentele au fost date a doua zi; celulele au fost colectate prin răzuire. Lizatele de celule întregi au fost preparate folosind tampon de liză SDS. Concentrația de proteine ​​a fost măsurată utilizând un kit de analiză a proteinei Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug proteină au fost utilizate pentru SDS-PAGE și au fost transferate pe o membrană PVDF (Bio-Rad, 1620177). Membrana a fost blocată folosind 5% BSA sau 5% lapte degresat, conform condițiilor optimizate, și incubată cu anticorp primar peste noapte la 4 grade. Membranele PVDF au fost spălate cu 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorp secundar conjugat cu HRP specific pentru specie. Membranele au fost ulterior spălate și dezvoltate folosind substrat Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) și filme de autoradiografie (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Pentru studiile de piroptoză, lizatele de proteine ​​au fost separate prin SDS-PAGE și transferate pe membranele PVDF. După blocare în 5% BSA, membranele PVDF au fost incubate cu anticorpii primari indicați peste noapte la 4 grade, spălate în PBS/Tween și incubate cu anticorpi secundari cuplați cu peroxidază. Imunoreactivitatea a fost detectată folosind anticorpi secundari conjugați cu HRP (CalBioTech), un substrat de chemiluminiscență (Thermo Fisher Scientific) și un sistem de imagistică ChemicDoc MP (Bio-Rad). Pentru experimentele care implică supernatant, celulele au fost cultivate într-un mediu fără FBS pentru a evita distorsiunea SDS-PAGE. Supernatanții celulari au fost recoltați și centrifugați timp de 10 minute la 500 g la 4 grade pentru a îndepărta resturile celulare. Supernatanții rezultați au fost concentrați de 10x utilizând Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) prin centrifugare timp de 30 de minute la 4500 g la 4 grade. Concentratele au fost amestecate cu tampon de probă și analizate prin Western blot așa cum este descris mai sus. Colorarea cu gel de proteine ​​a fost efectuată folosind colorarea roșie Ponceau. Analiza activității LMP și catepsinei L. Plasmida pEGFP-hGal3 umană a fost un cadou de la Tamotsu Yoshimori (plasmida Addgene, 73080) și a fost folosită pentru crearea liniei A375P-Galectin-3. S-a achiziționat coloana vertebrală a vectorului plasmidic de control pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Plasmidele au fost transfectate (1 ug/mL) în celule A375P utilizând Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) conform protocolului producătorului; celulele transfectate au fost selectate stabil folosind G418 (Gibco, 10131035). Pentru LMP, au fost numărate un total de 25 de celule A375P-galectin-3 puncta-pozitive în mai multe câmpuri de imagine. Procentul de celule puncta-pozitive a fost calculat în fiecare câmp separat și a fost calculat un procent mediu pentru fiecare grup. Trusa de analiză Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) a fost utilizată conform protocolului producătorului. Celulele au fost fotografiate la un microscop inversat Zeiss Axio Observer 7. Intensitatea integrată brută Magic Red a fost calculată utilizând software-ul Fiji - ImageJ (NIH). Testul de viabilitate celulară MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol{-2-il]{-2, bromură de 5 difenil tetrazoliu). 2.000 de celule au fost placate în trei exemplare în fiecare godeu al unei plăci de 96-godeuri și au fost efectuate teste MTT de 3-zi folosind kitul de viabilitate celulară (Roche, 11465007001) conform protocolului producătorului. Pretratamentul cu inhibitor a fost dat timp de 1 oră, urmat de cotratamentul celulelor cu inhibitori cu sau fără DC661. Metoda de regresie neliniară (curve fit) a fost utilizată pentru a calcula IC50.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Test de formare a coloniilor. 2,000 celule per godeu au fost însămânțate într-o placă de 6-godeuri și au fost tratate a doua zi; celulele au fost ținute sub tratament pentru un total de 8 zile. Coloniile formate în fiecare godeu au fost spălate cu PBS, fixate cu metanol rece la –20 grade timp de 20 de minute și colorate cu soluție apoasă Crystal violet 0,5% (V5265; MilliporeSigma).

Test de excludere a colorantului albastru tripan. Amestecul de reacție pentru testul cu albastru tripan a fost preparat prin amestecarea a 1 parte de albastru tripan 0,4% (25- 900-CI, Corning) și 1 parte din probele de celule diluate. Amestecul a fost incubat timp de 1 minut, iar celulele au fost numărate pe Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Figura 8. Expresia de suprafață a calreticulinei indusă de DC661-primă celulele T împotriva celulelor tumorale. (A)

Figura 9. Inocularea celulelor tratate cu DC661-produce respingerea tumorii în contexte specifice. (A)

SPUMA-LPO. LLP a fost studiat folosind o sondă fluorescentă, FOAMLPO. FOAM-LPO a fost sintetizat așa cum s-a descris anterior (26). Celulele au fost cultivate pe o lamă cu 8 godeuri (ibid, 80807) și tratate cu inhibitori și cu sau fără DC661. Celulele au fost incubate cu mediu care conține FOAM-LPO (1 M) într-o atmosferă de 5% CO2 și 95% aer timp de 5 minute la 37 de grade. Celulele au fost spălate de două ori cu mediu și apoi celulele au fost observate la microscop (microscop inversat Zeiss Axio Observer 7) pentru a detecta schimbarea fluorescenței de la 586 la 512 nm ca răspuns la LLP. qRT-PCR și primeri. Celulele A375P (3 × 105) au fost cultivate în vase de 60 mm și au fost tratate cu DMSO sau DC661 (3 μM) timp de 24 de ore. ARN total a fost izolat cu un kit de izolare a ARN (QIAGEN, 74134) conform protocolului producătorului. ADNc a fost sintetizat folosind un kit iScript Reverse Transcriptase cu 500 ng de ARN purificat conform protocolului producătorului (Thermo Scientific, K1642). Reacția qPCR a fost configurată folosind SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) care conține 1 μL cADN. Toate măsurătorile au fost efectuate în trei exemplare, iar BACTIN a fost folosit ca standard intern pentru calculele ΔCT. Analiza expresiei genelor a fost efectuată folosind următorii primeri: PTGS2/COX-2 înainte (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 inversă (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS înainte (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS inversă (GACCAGTGATGTCAACAG) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 invers (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN înainte (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) și BACTIN invers (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

transfecția siARN. Studiile de deblocare genetică pentru ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 și MFSD12 umane au fost efectuate în linii celulare A375P. Studiile de inhibare genetică pentru Ppt1 și Calreticulină de șoarece au fost efectuate în celule MC38. siARN non-țintă (sc{{10}}), ULK1 uman (sc{-44182), ATG7 (sc{-41447), TAX1BP1/T6BP (sc{-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc{-97888), mouse Ppt1/Cln1 (sc{-142398) și Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA-urile au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology. Aceste siRNA-uri constau din grupuri de 3-5 siRNA-uri specifice țintei. Citometrie în flux. Inducerea ferroptozei a fost măsurată utilizând C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Celulele A375P au fost însămânțate într-o placă de 6-godeuri și tratate cu DMSO, ferostatină{{40}} (10 μM), roxstatină lip-1 (2 μM), elastina (5 μM). ), DC661 (3 μM) sau o combinație timp de 24 de ore. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 300 g timp de 5 minute. Celulele au fost resuspendate în 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) care conține 1 μM C{11-BODIPY și incubate la 37 de grade timp de 15 minute. Celulele au fost granulate și resuspendate în 500 μL 1X HBSS, iar intensitatea fluorescenței a fost măsurată pe un citometru BD LSRII utilizând 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Cuantificarea expresiei la suprafața celulară a calreticulinei pentru moartea celulelor imunogene a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (45) prin citometrie în flux. Celulele B16F10 sau MC38 au fost cultivate și tratate cu NAC (10 mM) sau DC661 (3 μM) timp de 24 de ore. Celulele MC38 au fost tratate cu siPpt1 sau siNT timp de 48 de ore în prezența sau absența NAC 10 mM timp de 24 de ore. Celulele au fost colorate cu anticorp CALR (Cell Signaling Technology, 12238), al doilea anticorp de capră anti-iepure Alexa Fluor 647 (Invitrogen) și iodură de propidiu (PI) (Biolegend, 421301). Probele colorate au fost obținute pe un citometru de flux BD LSRII folosind 710/50 Blue și 670/30 Red pentru a capta fluorescența PI și, respectiv, CALR (facilitatea Flow Core de la Universitatea din Pennsylvania), iar analiza a fost limitată la celulele CALR-pozitive și PI-negative. pentru a evita evenimentele fals pozitive. Amorsarea celulelor T și citotoxicitatea procentuală. Celulele tumorale B16 sau MC38 (5 × 104) au fost cultivate și tratate cu NAC (10 mM) sau DC661 (1 μM sau 3 μM), respectiv, timp de 24 de ore. Pentru inhibarea genetică Calr, celulele MC38 au fost tratate cu ARNsi Calr sau ARNsi non-țintă (siNT) timp de 48 de ore, urmate de tratament fie cu DMSO, fie cu 3 μM DC661 timp de 24 de ore. Splenocitele au fost apoi cultivate cu DC661 cu sau fără celule B16 sau MC38 în prezența IL-2 (5 UI/mL) și cocultivate timp de 72 de ore. Amorsarea a fost confirmată prin IFN-ELISA (Biolegend, 430815) a supernatantului. Splenocitele amorsate au fost apoi cocultivate cu celule B16 sau MC38 proaspăt cultivate cu raporturi țintă-efector (B16 sau MC38 la splenocite) de 1:20 și 1:50 pentru celulele B16 și, respectiv, MC38. Eliberarea LDH asociată cu moartea celulelor B16 sau MC38 și apoi citotoxicitatea procentuală a fost măsurată conform protocolului producătorului (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Teste de vaccinare antitumorală și studii de chimioterapie cu modele de cancer consacrate. Soareci femele WT C57BL/6 în vârstă de șase până la opt săptămâni, șoareci NOD/SCID și BALB/c au fost obținuți de la Laboratorul Jackson. Pentru experimentele de vaccinare antitumorală, celulele WT B16F10, MC38 și CT26 au fost tratate cu DC661 (3 μM) timp de 36 de ore în baloane de 175 cm2. Apoi, supernatanții și celulele detașate au fost colectate într-un tub Falcon de 50 ml. Celulele au fost centrifugate și spălate cu PBS răcit cu gheață. Pentru vaccinare, s-au injectat 150 μL suspensie celulară sc în flancul stâng al șoarecilor C57BL/6 imunocompetenți, șoarecilor NOD/SCID imunodeficienți (1,8 × 104 celule B16F10, 1,5 × 106 celule MC38 per șoarece) sau mice singeneic BAL3B/. × 106 celule CT26 per șoarece). Celulele congelate-dezghețate resuspendate în PBS au fost injectate ca martor negativ. O săptămână mai târziu, celule canceroase vii de aceleași tipuri (3 × 104 celule B16F10, 2 × 105 celule MC38 sau 5 × 105 celule CT26 per șoarece) cu un volum egal de Matrigel (Corning, 354248) au fost injectate în flancul drept. de șoareci vaccinați. Tumorile au fost măsurate folosind șublere electronice, iar volumul a fost calculat ca L × W2 × 0,5. Creșterea tumorii a fost monitorizată în mod regulat în următoarele zile, iar absența tumorilor a fost considerată ca un indiciu al vaccinării antitumorale eficiente. Studiile de vaccinare DC661-MC38 au fost repetate la șoareci NOD/SCID. Statistici. Semnificația statistică a fost determinată prin utilizarea testului t neîmperecheat, 2-Student, la compararea a două grupuri. 1-Modul de test ANOVA a fost utilizat când au fost comparate mai mult de 2 grupuri. O ipoteză nulă a fost respinsă în mod semnificativ dacă valoarea P a fost mai mică de 0,05. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Aprobarea studiului. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Pennsylvania.

Planta chinezească cistanche plantă-Antitumoral

Referințe

1. Zeh HJ, şi colab. Un studiu preoperator de fază II randomizat al inhibării autofagiei cu hidroxiclorochină în doză mare și gemcitabină/ Nab-paclitaxel la pacienții cu cancer pancreatic. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, et al. PPT1 promovează creșterea tumorii și este ținta moleculară a derivaților de clorochină în cancer. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, şi colab. GNS561, un nou inhibitor de autofagie activ împotriva celulelor stem canceroase din carcinomul hepatocelular și metastazele hepatice din cancerul colorectal. J Cancer. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, şi colab. GNS561, un inhibitor PPT1 în stadiu clinic, este eficient împotriva carcinomului hepatocelular prin modularea funcțiilor lizozomale. Autofagie. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, şi colab. Permeabilizarea membranei lizozomale și eliberarea de catepsină este un eveniment de amplificare a apoptozei dependent de Bax/ Bak în fibroblaste și monocite. Moartea celulară diferă. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilizarea membranei lizozomale în moartea celulelor. Oncogene. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, et al. O abordare unificată a direcționării rolurilor de semnalizare a lizozomului și de degradare a creșterii. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, şi colab. Ferroptoza, necroptoza și piroptoza în imunitatea anticanceroasă. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et al. Autofagia promovează evaziunea imună a cancerului pancreatic prin degradarea MHCI. Natură. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, şi colab. Inhibarea ULK1 depășește prezentarea compromisă a antigenului și restabilește imunitatea antitumorală în cancerul pulmonar mutant LKB1. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. Ubiquitin kinaza PINK1 recrutează receptori de autofagie pentru a induce mitofagia. Natură. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, et al. TAX1BP1 restrânge apoptoza indusă de virus facilitând degradarea mediată de mâncărime a adaptorului mitocondrial MAVS. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, et al. Bnip3 afectează bioenergetica mitocondrială și stimulează turnover-ul mitocondrial. Moartea celulară diferă. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et al. Baza mecanică a feroptozei afectate în celulele care exprimă varianta S47 african-centrică a p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. Inhibitorii mutanți de BRAF și MEK reglează micromediul imunitar tumoral prin piroptoză. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilizarea membranei lizozomale în moartea celulelor: noi dovezi și implicații pentru sănătate și boală. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et al. Autofagia indusă de quinacrina în cancerul ovarian declanșează permeabilizarea membranei lizozomale/mitocondriale mediată de catepsină L și moartea celulelor. Cancer (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC, et al. Apoptoza dependentă de catepsină declanșată de activarea supraoptimă a limfocitelor T: un posibil mecanism de toleranță la doze mari. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, et al. Deficiența Ppt1-dereglează homeostazia lizozomală de Ca++, contribuind la patogeneză într-un model de șoarece al bolii CLN1. J Moștenire Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, şi colab. Biomarkeri lipidici derivați de fosfolipaze și specii reactive de oxigen la oameni și animale sănătoși și bolnavi - un accent pe lizofosfatidilcolină. Front Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, şi colab. Eficacitatea N-acetilcisteinei în suprimarea fenotipică a modelelor de șoarece ale bolii Niemann-Pick, tip C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, şi colab. N-acetilcisteina previne stresul oxidativ indus de olanzapină în neuronii hipotalamici mHypoA-59. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et al. ASS1 și ASL suprimă creșterea în carcinomul renal cu celule clare prin metabolizarea alterată a azotului. Cancer Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, și colab. Comparație a efectului protector al acidului ascorbic asupra interacțiunilor sistemelor redox și endocannabinoid in vitro a fibroblastelor de piele umană cultivate expuse la radiații UV și peroxid de hidrogen. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et al. Exploatarea vulnerabilităților celulelor canceroase pentru a dezvolta o terapie combinată pentru tumorile cauzate de ras. Celula canceroasă. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, și colab. Monitorizarea peroxidării lipidelor în celulele de spumă prin lizozom țintă și sondă ratiometrică. Anal Chim. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et al. Analiza bazată pe bioinformatică dezvăluie MFSD12 crescut ca un promotor cheie al proliferării celulare și o potențială țintă terapeutică în melanom. Oncogene. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et al. N-acetilcisteina ca agent de rupere antioxidant și disulfură: motivele pentru care. Radic liber Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Metabolomica lizozomală dezvăluie reglarea dependentă de V-ATPază și mTOR a efluxului de aminoacizi din lizozomi. Ştiinţă. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, şi colab. Moartea celulelor imunogene în terapia cancerului: inductori prezenți și emergenti. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. Inhibarea PPT1 mărește activitatea antitumorală a anticorpului anti-PD-1 în melanom. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, şi colab. BAMM (BRAF autophagy and MEK inhibition in melanom): un studiu de fază I/II cu dabrafenib, trametinib și hidroxiclorochină în melanomul mutant BRAFV600-avansat. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Proteinele de macroautofagie controlează nivelurile MHC clasa I pe celulele dendritice și modelează răspunsurile celulelor T CD8(+) antivirale. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. Mobilizarea cisteinei lizozomale modelează răspunsul TORC1 și creșterea țesuturilor la post. Ştiinţă. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetilcisteină: o revizuire a utilității clinice (un medicament vechi cu trucuri noi). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA, et al. Descoperirea sistematică a biomarkerilor serici de sarcină ectopică folosind 3-profilarea proteinei D cuplată cu cuantificare fără etichete. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Efectul principal asupra proteomului carcinomului cu celule clare ovarian cu mutație ARID1A este reglarea în jos a căii mevalonatului la nivel post-transcripțional. Proteomica celulelor Mol. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant permite rate ridicate de identificare a peptidelor, precizie individualizată a masei în intervalul ppb și cuantificarea proteinelor la nivel de proteom. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, şi colab. Andromeda: un motor de căutare de peptide integrat în mediul MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, şi colab. Cuantificare precisă fără etichete la nivelul întregului proteom prin normalizare întârziată și extracție maximă a raportului de peptide, denumită MaxLFQ. Proteomica celulelor Mol. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, și colab. Platforma de calcul Perseus pentru analiza cuprinzătoare a datelor (prote)omice. Metode Nat. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: o platformă bioinformatică pentru analiza integrativă a datelor proteomice în cercetarea cancerului. Metode Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, et al. Modificările în metabolismul lipidelor fibroblastelor îmbătrânite induc rezistența celulelor melanomului dependentă de vârstă la terapia țintită prin intermediul transportorului de acizi grași FATP2. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et al. Ingineria genomului folosind sistemul CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. Cuantificarea expunerii la calreticulină asociată cu moartea celulelor imunogene. Metode Enzimol. 2020;632:1–13.