Activarea macrofagelor prin zaharide cu greutate moleculară mică din Cistanche Deserticola

Persoană de contact: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 e-mail:audrey.hu@wecistanche.com

[Abstrac]

Pentru a investiga efectul de activare imună și mecanismul zaharidelor cu greutate moleculară mică dinCistanche deserticola(LMSC) pe macrofage peritoneale mouse-ului, RAW264. 7 celule. The RAW264. 7 celule au fost împărțite în grupul de control normal, grupul de control pozitiv LPS și grupurile de tratament LMSC. The RAW264. 7 celule au fost tratate cu diferite concentrații de LMSC de la 3. 91 la 62. 5 g· L - 1. Testul roșu neutru a fost folosit pentru a detecta activitatea fagocitară a macrofagelor. NICI o versiune a fost detectată prin utilizarea no kit, și macrofage activare asociate niveluri de expresie proteică (TNF-α, IL-6, IKKβ, p-IKKβ, IκBα, p-IκBα, NF-κB, și p-NF-κB) au fost detectate de western blot. Rezultatele au arătat că LMSC a avut un efect de activare asupra macrofagelor; poate crește semnificativ lansarea NO în RAW264. 7 celule și de a promova expresia citokinelor TNF-α și IL-6. În plus, LMSC a crescut semnificativ fosforilarea IKKβ, IκBα și NF-κB p65. În plus, manitolul este unul dintre principalii constituenți din LMSC a îmbunătățit semnificativ activitatea fagocitară a macrofagelor. Aceste rezultate au arătat că LMSC ar putea activa macrofagele prin reglarea căii de semnalizare NF-κB, iar manitolul poate fi una dintre principalele componente active din LMSC.

[Cuvinte cheie] Zaharide cu greutate moleculară mică; Cistanche deserticola; activarea imună; macrofage; factor inflamator; NF-κB

Cistanche deserticola Y. C. Maeste o plantă aparținând genuluiCistanche deserticolaY. C. Ma. Tulpina sa cărnoasă poate fi folosită ca medicament. Are functiile de a hrani rinichi yang, de a hrani esenta si sangele si de a hidrata intestinele. Este cunoscut sub numele de "ginseng desert". Componentele chimice ale Cistanche includ glicozide feniletanoide, glicozide iridoide, zaharuri, lignani, și multe alte tipuri. Studiile farmacologice moderne au descoperit că Cistanche are multe activități biologice, cum ar fi neuroprotecția, anti-tumorale, reglarea sistemului imunitar, antiinflamator și antioxidant [1]. Studiile au arătat că decoctul de Cistanche și polizaharide poate îmbunătăți semnificativ capacitatea fagocitară și funcția de secreție a macrofagelor [2-3]. Cu toate acestea, nu există nici un raport cu privire la activitatea de cercetare a carbohidratilor sai cu greutate moleculară mică. Prin urmare, acest studiu a folosit sistemul de cultură in vitro al RAW264. 7 macrofage peritoneale de șoarece pentru a explora activitatea imunomodulatoare și mecanismele conexe ale cistanche glucidelor cu greutate moleculară mică. Această cercetare poate oferi mai multe dovezi experimentale pentru o înțelegere cuprinzătoare aEfectul imunomodulator al Cistancheîn viitor, astfel încât să se ghideze în continuare aplicarea sa clinică.

Cistanche deserticola au multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

1. Materiale

RAW264. 7 celule au fost achiziționate de la Centrul celular al Academiei Chineze de Științe Medicale; serul fetal bovin (FBS) a fost achiziționat de la PAN Biotech, Germania; antibiotice și mediu DMEM au fost achiziționate de la Zhongke Machen Technology Co, Ltd. Lipopolizaharida de la Escherichia coli O55:B5 (LPS) au fost achiziționate de la Sigma Company, SUA. Un kit de oxid nitric (NO) a fost achiziționat de la Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering. Kitul de chemiluminescență ECL a fost achiziționat de la Thermo Fisher, SUA; anticorpul a fost achiziționat de la Cell Signaling Technology, SUA; Glicozidele totale cistanche cistanche, zaharurile cistanche cu greutate moleculară mică și polizaharidele cistanche au fost auto-fabricate de grupul nostru de cercetare. Fracțiunea de masă a glicozidelor totale ale cistanchei a fost de 78,76%. Fracțiunea de masă a zaharurilor cu greutate moleculară mică deCistanche deserticolaare 58 de ani. 00% și fracțiunea de masă aCistanche deserticolapolizaharidele sunt 65. 24%. Tanon-5200Multi gel imagistica split sistem a fost achiziționat de la Shanghai Tianneng Technology Co, Ltd.; Cititorul de microplate Sunrise-Basic a fost achiziționat de la compania TECAN.

2. Metodă

2. 1 Metoda roșie neutră pentru măsurarea activității fagocitare a macrofagelor

Luați macrofagele peritoneale ale mouse-ului în faza de creștere logaritmică, după tripsinizare, numărați celulele, ajustați numărul de celule la 5 × 104 celule/ml și inoculați-le într-o placă de cultură celulară de 96 de puțuri, 100 μL/godeu, la 37 °C Cultivată în condiții de CO2 de 5%, după ce celulele aderă la perete, aruncați supernatantul de cultură, adăugați mediu DMEM (10% FBS + 1% P / S), LPS (1 mg· L - 1) și cistanche cistanche respectiv Glicozide totale,Cistanchepolizaharide totale și cistanche cistanche zaharuri cu greutate moleculară mică (3,91 ~ 62,5 g· L -1, respectiv, filtrat cu o membrană de filtrare înainte de administrare) au fost cultivate. După ce se cultivă timp de 48 de ore, se adaugă 100 μL de soluție salină fiziologică roșie neutră 0,075% în fiecare godeu, se continuă cultivarea timp de 4 ore, se aspira supernatantul, se spală de 3 ori cu PBS, se adaugă lizat celular (acid acetic glacial-etanol 1:1) 100 μL, se pune la 4 °C timp de 2 ore și se măsoară absorbanța (A540 nm) după ce celulele sunt lizate.

2. 2 Detectarea cantității de eliberare FĂRĂ în supernatantul celular

Se inoculează RAW264. 7 celule dintr-o placă cu 48 de godeuri (1 × 105 celule/ml, 500 μL/godeu), aspira mediul de cultură celulară după incubarea peste noapte, se adaugă mediu DMEM (10% FBS + 1% P /S), 500 μL fiecare de LPS (1 mg· L -1) și cistanche cistanche glicozide totale, polizaharide totale și zaharuri cu greutate moleculară mică (3,91 ~ 62,5 g· L -1, respectiv). După 24 de ore de cultură de inducție, supernatantul a fost colectat. Se determină concentrația de NO în supernatantul celular al fiecărui grup cu kitul NO, urmați instrucțiunile și, în cele din urmă, detectați absorbanța (A570 nm) cu un cititor de microplăci

2. 3. Western blot

Se inoculează RAW264. 7 celule într-o placă de 6 godeuri, aspirați mediul de cultură celulară după incubarea peste noapte, adăugați mediu DMEM (10% FBS + 1% P / S), LPS (1 mg· L - 1) șiCistanchepolizaharide totale și zaharuri cu greutate moleculară mică (3,91 ~ 62,5 g· L -1) au fost fiecare 2 ml, iar supernatantul a fost aruncat după 24 de ore de cultură de inducție. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și aruncate. După tripsinizare, celulele sunt pipetate în jos. Se centrifughează, se îndepărtează supernatantul, se adaugă 100 μL NP40 Lysis Buffer și se lizează pe gheață timp de 40 de minute. După centrifugare, supernatantul a fost luat, iar concentrația proteinelor a fost determinată prin metoda BCA, iar concentrația proteică a fiecărui histon a fost ajustată uniform. Luați aceeași cantitate de probe de proteine și separați-le pe 12% SDS-PAGE sub presiune constantă. Apoi utilizați rezervorul de electroforeză de transfer Bio-Rad pentru a transfera membrana cu un curent constant de 350 mA timp de 1 oră și transferați proteina în membrana PVDF (pretratarea membranei PVDF: înmuiați în metanol și echilibrați cu tamponul de transfer). După blocarea cu 5% lapte degresat (configurat cu TBST care conține 0,1% Tween-20) timp de 1 h la temperatura camerei, membrana a fost spălată de 3 ori cu TBST, iar membrana a fost incubată în diluantul de anticorpi primari proteici la 4 ° C peste noapte. Membrana a fost spălată de 3 ori cu TBST în fiecare zi, iar diluantul corespunzător a fost adăugat pentru a se incuba timp de 1 h. Membrana a fost spălată de 3 ori cu TBST, iar benzile au fost dezvoltate cu un dezvoltator de chemiluminiscență ECL.

2. 4 analiza datelor

Datele sunt exprimate ca x ± s, iar semnificația diferenței este testată folosind software-ul statistic GraphPad Prism 6 pentru analiza unidirecțională a varianței. Ia P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Rezultate

3. 1. Efectele cistanche cistanche zaharuri cu greutate moleculară mică, glicozide totale, și polizaharide totale asupra activității fagocitare a RAW264. 7 celule

Cercetările privind componentele chimice ale Cistanche arată căCistancheconține în principalglicozide feniletanoide, glicozide iridoide și carbohidrați. În acest experiment, sunt selectate glicozidele totale ale cistanchei (inclusiv glicozidele alcoolului fenetil și glicozidele iridoide), zaharurile cu conținut molecular scăzut și zaharurile. Cele trei situri active ale polizaharidelor totale au fost investigate pentru efectele lor asupra activării RAW264. 7 celule. Atât polizaharida cistanche cistanche, cât și zahărul cistanche cu greutate moleculară mică pot crește semnificativ activitatea fagocitară a RAW264. 7 celule, dar activitatea fagocitară a grupului total de administrare a glicozidelor nu se modifică semnificativ. În plus, medicamentul de control pozitiv LPS a îmbunătățit, de asemenea, în mod semnificativ activitatea fagocitară a RAW264. 7 celule, așa cum se arată în figura 1. Rezultatele de mai sus sugerează că zaharurile și polizaharidele cu greutate moleculară mică din Cistanche pot avea ca efect activarea RAW264. 7 celule.

3. 2. Efectul glicozidelor totale Cistanche, al zaharurilor moleculare scăzute și al polizaharidelor totale asupra conținutului de oxid nitric (NO) în supernatantul celular

Pentru a investiga în continuare efectul de activare a celor trei site-uri active ale Cistanche pe RAW264. 7 celule, a fost determinat conținutul de NU în supernatanții celulari stimulați de diferite medicamente. Rezultatele au arătat că lansarea NO în grupul LPS a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul de control necompletat (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchenu a avut nici un efect semnificativ. Rezultatele de mai sus indică faptul că atât polizaharidele, cât și zaharurile cu greutate moleculară mică din Cistanche pot promova eliberarea de NO din RAW264. 7 celule. Printre acestea, efectul zaharurilor cu greutate moleculară mică din Cistanche este deosebit de semnificativ, după cum se arată în figura 2.

3. 3. Efectul cistanche cistanche zahăr cu greutate moleculară mică asupra expresiei TNF-α și IL-6 proteine în RAW264. 7 celule

TNF-α este un mediator inflamator important care apare în procesul de activare a RAW264. 7 celule, care pot promova sinteza și eliberarea altor citokine (cum ar fi IL-6). Rezultatele au arătat că expresia TNF-α și IL-6 a fost crescută semnificativ după ce a fost stimulat zahărul cu greutate moleculară mică din Cistanche cistanche, sugerând că zahărul cu greutate moleculară mică din Cistanche poate promova expresia TNF-α și IL-6 în RAW264. 7 celule, activând astfel imunitatea celulară Fagocitoza, a se vedea figura 3.

3. 4. Efectul de reglementare al zahărului cistanche cistanche cu greutate moleculară mică asupra căii de semnalizare IKKβ /IκBα/NF-κB

Pentru a explora mecanismul potențial al cistanche cistanche zaharuri cu greutate moleculară mică în activarea RAW264. 7 celule, autorii au investigat efectele sale de reglementare asupra căii clasice de semnalizare IKKβ/IκBα/NF-κB. Zahărul cistanche cistanche cu greutate moleculară mică poate crește semnificativ fosforilarea NF-κB și fosforilarea proteinelor sale cheie de semnal din amonte IKKβ și IκBα și poate reduce expresia proteinei totale IκBα, indicând faptul că are un efect de activare asupra căii de semnalizare IKKβ/IκBα/NF-κB. Medicamentul de control pozitiv LPS are, de asemenea, un efect de reglementare similar. Pe scurt, zaharurile cu greutate moleculară mică din Cistanche pot activa calea de semnalizare IKKβ/IκBα/NF-κB, provocând astfel sinteza și eliberarea citokinelor, cum ar fi TNF-α și IL-6, provocând în cele din urmă activarea imună a RAW264. 7 celule, a se vedea figura 4.

3. 5. Screening-ul ingredientelor active cu efect de activare a macrofagelor în zaharurile cistanche cu greutate moleculară mică

Laboratorul nostru a analizat zaharurile cu conținut scăzut de moleculară conținute înCistancheîn stadiul incipient și a constatat că acesta conține în principal manitol (16,53%), zaharoză (8,34%), fructoză (25,38%), și glucoză (7,75%), și alte ingrediente. Așa că autorul a folosit metoda roșie neutră pentru a filtra efectul de activare a componentelor de mai sus asupra macrofagelor. Manitolul poate crește semnificativ activitatea fagocitare a macrofagelor într-o manieră dependentă de doză, în timp ce efectele altor componente nu sunt semnificative. Acest lucru sugerează că manitolul poate fi una dintre componentele active cheie ale zaharurilor cu greutate moleculară mică din Cistanche cistanche pentru a activa macrofagele, așa cum se arată în figura 5.

4. Discuții

Cistanche cistanche, o plantă parazitară din familia Lydanaceae, a fost raportată ca având efecte imunomodulatoare, deci ar trebui să conțină substanțe imunomodulatoare. În acest experiment, autorul a analizat activitatea fagocitară a macrofagelor peritoneale de șoarece pe diferite părți purificate aleCistancheși a constatat că zaharurile cu greutate moleculară mică și polizaharidele din Cistanche au ca efect activarea macrofagelor, dar glicozidele totale ale Cistanche nu sunt evidente. În același timp, autorul a constatat că zaharurile cu greutate moleculară mică pot activa macrofagele la concentrații mai mici, astfel încât autorii au alesCistanchezaharuri cu greutate moleculară mică ca punct central al cercetărilor ulterioare.

Examinând efectul zahărului cistanche cu greutate moleculară mică asupra expresiei citokinelor TNF-α și IL-6, autorii au descoperit că zahărul cistanche cu greutate moleculară mică a crescut semnificativ expresia TNF-α și IL-6, ceea ce a demonstrat în continuare că zahărul cistanche cu greutate moleculară mică are un efect asupra șoarecilor. Macrofagele peritoneale au un efect de activare. Așa că autorul a explorat în continuare potențialul său mecanism de acțiune. Au de cercetare

Se arată că lipopolizaharida bacteriană (LPS) poate induce activarea macrofagelor mouse-ului și a celulelor gliale ale mouse-ului prin căi de semnal, cum ar fi JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK și MAPK [4-8]. Calea NF-κB este recunoscută ca o cale clasică, astfel încât proteinele de semnal de pe această cale au fost testate în acest experiment. Rezultatele au arătat că zaharurile cu greutate moleculară mică din Cistanche pot crește semnificativ fosforilarea NF-κB și fosforilarea proteinelor cheie de semnalizare din amonte IKKβ și IκBα, sugerând că zaharurile cu greutate moleculară mică aleCistanchepoate activa giganții peritoneali ai mouse-ului prin calea de semnalizare IKKβ/IκBα/NF-κB. Celulele phage eliberează citokine inflamatorii și apoi joacă un rol în activarea imunității celulare.

În stadiul incipient al laboratorului, compoziția chimică a extractului de zahăr cu greutate moleculară mică deCistanche deserticolaa fost analizat sistematic. Se constată că zaharurile cu greutate moleculară mică conțin în principal monomeri, cum ar fi manitolul, zaharoza, fructoza și glucoza. Cercetări suplimentare au descoperit că manitolul poate îmbunătăți semnificativ activitatea fagocitară a macrofagelor. Prin urmare, se speculează că manitolul poate fi o componentă cheie a zaharurilor cu greutate moleculară mică care activează o funcție imunitară celulară.

Pe scurt, acest studiu a folosit macrofagele în sistemul de cultură vitro și a constatat că zaharurile cu greutate moleculară mică aleCistancheau un efect semnificativ de activare asupra macrofagelor și pot activa macrofagele peritoneale ale mouse-ului prin calea de semnalizare NF-κB și apoi pot juca un rol. Manitolul din zaharurile cu greutate moleculară mică poate juca un rol important în activarea activității fagocitare a macrofagelor.

Referinţe

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Tehnici de cultivare a deșertului Cistanche și a gazdei sale Tamarix [M]. Beijing: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. O prezentare generală a efectelor farmacologice aleCistanche deserticolapolizaharidă [J]. Alimente și droguri, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Activarea macrofagelor polizaharidei cistanche [J]. Buletin farmacologic chinez, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Activitatea biologică și mecanismul lipopolizaharidei bacteriene [J]. medical Science Review, 2010, 16 (2): 166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS prin calea p38 /MAPK și activarea NF-κB induce expresia HIF-1α în RAW264. 7 celule [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. JAK2/STAT3 calea de semnalizare este implicat în lipo poli induse de zahăr activarea microglia[J]. Journal of the Third Military Medical University, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Glicozidele Mulbascum inhibă inflamația indusă de lipopolizaharidă a microgliei BV-2 și mecanismul său [J]. Jurnalul Chinez de Medicină Tradițională Chineză, 2016, 41(13): 2506.