Efectele anti-îmbătrânire mediate ale extractului de Cistanche

cultura CE

Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane au fost obținute de la American Type Culture Collection (Manassas VA, SUA). Celulele au fost cultivate la 37°C cu 5% mediu de creștere endotelial de CO2-2 (EGM{-2; Lonza, Walkerville, MD, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS). EC au fost cultivate timp de 48 de ore la 37°C cu 5% CO, în mediu EGM-2 (martor) sau HG 30 mM, cu sau fără adăugarea de diferite concentrații de Cistanche (1040 ug/mL).

Test de viabilitate celulară

Celulele au fost cultivate la 37°C timp de 72 de ore într-un mediu EGM-2 suplimentat cu 2% FBS și diferite concentrații de Cistanche și au fost tratate cu soluție MTT timp de 4 ore. Depunerile de formazan rezultate au fost dizolvate cu dimetilsulfoxid, unde absorbanța a fost măsurată la 570 nm folosind un cititor de microplăci VersaMax ELISA (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, SUA).

Test de migrare a plăgii zgârieturi

Celulele au fost rănite și apoi mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu proaspăt care conținea diferite concentrații de Cistanche. Celulele au fost menținute timp de 24 până la 48 de ore. La migrarea completă, celulele au fost fotografiate folosind un microscop (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Japonia). Celulele migrate au fost numărate folosind un microscop optic la mărire de 200x și cuantificate manual

Colorare SA-P-gal

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 de celule numărate folosind trei câmpuri independente.

Analiza Western blot

Celulele au fost recoltate și lizate în soluție de extracție a proteinelor (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Coreea) care conține inhibitori de protează și fosfatază (10 min la 4°C). Concentrațiile totale de proteine ​​din supernatanți au fost măsurate utilizând teste Bradford. După încălzire la 95 de grade timp de 5 minute, probele de proteine ​​(30 ug) au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 8~12 procente. Proteinele au fost apoi transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden (MilliporeBedford, MA, SUA) la 100 V timp de 60 de minute. Membranele au fost incubate în soluție salină tamponată cu Tris (TBS) 5% albumină serică bovină (BSA) suplimentată cu 0,05% TBS cu Tween-20 (TBST) (30 de minute la temperatura camerei), apoi incubate în 5% BSA în TBST suplimentat cu anticorpi primari (1:200 la l,000) (peste noapte la 4°C). Apoi, membranele au fost inoculate fie cu anticorpi anti-iepure sau anti-șoarece de capră conjugați cu HRP (1:5,000) pentru h, iar benzile de proteine ​​au fost detectate utilizând un kit de detecție cu chemiluminiscență îmbunătățită (Intron Biotechnology, Inc. ) și un LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Japonia). Analiza semi-cantitativă a rezultatelor densitometriei a fost efectuată folosind Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD SUA).

Măsurarea producției de NO Concentrațiile de NO au fost determinate prin detectarea concentrației de nitriți folosind truse de testare pentru NO, conform instrucțiunilor producătorului. Densitățile optice au fost determinate la 560 nm folosind un cititor de microplăci, iar concentrațiile au fost calculate folosind o curbă de calibrare

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie plus deviația standard (SD). Semnificația statistică a fost determinată prin analiza unidirecțională a varianței (ANOVA). Comparațiile post-hoc între grupuri au fost efectuate folosind teste de comparații multiple Bonferroni. Toate calculele au fost efectuate folosind SPSS în Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) și valorile P<0.05 were considered statistically significant.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Citotoxicitatea Cistanche

Pentru a determina citotoxicitatea Cistanche pe EC, celulele au fost incubate cu diferite concentrații de Cistanche (0 până la 100ug/ml) timp de 72 de ore. Cistanche a prezentat citotoxicitate semnificativă (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml în toate punctele de tratament (Fig. 1). Prin urmare, concentrațiile de Cistanche de<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Calea protein kinazei activate de mitogen (MAPK) reglează procesele cheie implicate în dezvoltarea EC vasculară, cum ar fi proliferarea celulară, invazia, metastaza și supraviețuirea și angiogeneza (Pišlar et al., 2015). MAPK implică ERK, kinaza N-terminală c-Jun și p38 (Kim și Choi, 2010). ERK și p38 sunt proteine ​​de semnalizare importante implicate în vindecarea rănilor, în timp ce ERK joacă un rol important în controlul migrației, proliferării, diferențierii și supraviețuirii celulelor (Roskoski, 2012). Într-un studiu recent, s-a sugerat că calea de semnalizare p38 MAPK este implicată în vindecarea rănilor (Loughlin și Artlett, 2011; Kim et al., 2019; Wang et al., 2019). În studiul de față, am examinat expresia proteinei ERK și p38 pentru a identifica căile de semnalizare implicate în migrarea EC reglată de Cistanche. Tratamentul cu Cistanche (40 g/mL) a crescut migrarea CE de 1,5-ori față de martor (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-ori mai sus decât controlul (pag<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Fig. 1.Efecte aleCistanche(Cistanche) privind viabilitatea celulară. Celulele au fost tratate cu Cistanche (0 până la 100g/mL) timp de 72 ore. Viabilitatea celuleia fost calculat ca procent de celule viabile cultivate înabsenţa Cistanchei. Rezultatele arată media±SD. *P<0.05.