roLimba
Acasă / Cunoştinţe / Conţinut

Cunoştinţe

Meta-analiza rezultatelor cuantificării NAD(P)(H) arată variabilitatea în țesuturile de mamifere Ⅱ

Jun 01, 2023

Efectul colectării de țesut premortem versus post-mortem asupra nivelurilor NAD(P)(H).

Am prezis că ar putea exista o diferență observabilă în starea redox NAD(P)(H) care depinde de procedurile de recoltare a țesuturilor. Pentru a răspunde la această întrebare, am examinat efectul procedurilor de colectare a țesuturilor pre- versus post-mortem asupra stării redox NAD(P)(H). Pentru această analiză, am comparat valorile din țesuturile hepatice de șobolan, având în vedere numărul mai mare de studii care definesc protocolul de sacrificiu al acestora. Când au fost dezvăluite, toate studiile revizuite au declarat că probele de țesut au fost păstrate la rece și extrase imediat pe gheață sau congelate la -80 de grade înainte de măsurătorile NAD(P)(H). Această analiză a determinat că nu a existat nicio diferență semnificativă în concentrațiile NAD plus în ficatul de șobolan (Fig. 6a) între țesuturile extrase înainte sau după eutanasie. Cu toate acestea, nivelurile raportate de NADH în ficatul de șobolan sunt semnificativ mai mari în probele post-mortem (Fig. 6b). Nu s-au observat diferențe în nivelurile totale de NAD(H) (Fig. 6c), dar raportul NAD plus /NADH a fost mai mic în țesuturile colectate după eutanasie (Fig. 6d), ceea ce este în concordanță cu variația observată în nivelurile NADH. NADP plus, NADPH și raportul NADP plus /NADPH rezultate în ficatul de șobolan grupat în funcție de momentul recoltării țesuturilor sunt prezentate în Fig. 9 suplimentară; cu toate acestea, numărul insuficient de probe post-mortem nu ne permite să interpretăm efectul momentului de recoltare a țesuturilor asupra nivelurilor NADP(H). În ficatul de șoarece, nu a existat nicio diferență între nivelurile de NAD plus pre- și post-mortem, cu toate acestea, numărul de studii de raportare a fost limitativ (Fig. 6e). NuNELU,NADP plus, sauNADPHdate post-mortem înficat de șoareceera disponibil pentru comparație.

Flavonoid (2)

Faceți clic aici pentru a obține Hebrs Cistanche


Discuţie

Multe studii recente au demonstrat că reglarea NAD(P)(H) este esențială pentru homeostazia celulară și starea redox. Datele obținute de la rozătoare au condus la studii care examinează nivelurile NAD plus din sângele uman, ca un indicator mai puțin invaziv al nivelurilor NAD plus la nivelul întregului corp. Studii clinice recente au demonstrat că nivelurile NAD plus au fost reduse în stările de boală23,47 și crescute în urma strategiilor de stimulare a NAD plus23,44,48,49. Am efectuat o meta-analiză a tuturor studiilor publicate între 1946 și 20 iunie 2021, care conțineau date cantitative pentru nivelurile de NAD(P)(H) la speciile de mamifere, cu un accent special pe șoareci, șobolani și oameni, deoarece acestea reprezintă cele mai multe specii studiate în domeniul biomedical. Această analiză a fost efectuată parțial pentru a determina nivelul mediu standard al concentrațiilor de NAD(P)(H) în țesuturile normale de mamifere, având în vedere variația binecunoscută a acestor măsuri în cadrul studiilor. Sperăm că aceste date pot fi utilizate pentru a stimula protocoalele standardizate în domeniul NAD plus cercetare și pentru a promova utilizarea nivelurilor NAD(P)(H) și a rapoartelor redox ca biomarkeri de încredere pentru boală și regimuri de tratament.

În ciuda variabilității considerabile a măsurilor în țesuturile rozătoarelor, această meta-analiză a afișat niveluri medii similare NAD plus în țesuturi, cu unele excepții. Interesant, mușchiul scheletic de șoarece a prezentat niveluri mediane mai mici de NAD plus (Fig. 2a) decât alte țesuturi puternic metabolice (adică ficatul, rinichii, inima și creierul). Acest lucru poate indica stări redox diferite ale NAD(H) în mușchiul scheletic sau poate indica probleme mai mari cu extracția metaboliților din țesuturile fibroase. Cu toate acestea, aceste observații nu au putut fi verificate la oameni din cauza lipsei de țesuturi prelevate dincolo de sânge și mușchi.

Flavonoid-1

Există mulți factori potențiali care ar putea afecta acuratețea măsurătorilor fiziologice NAD(P)(H) în probele de țesut. Când au fost raportate, toate studiile au descris țesuturile ca fiind recoltate și scufundate direct în azot lichid sau păstrate pe gheață înainte de congelare sau procesare pentru a păstra fracțiile sensibile la căldură (NAD plus și NADP plus). Efectul pH-ului asupra diferitelor fracții NAD(P)(H), cum ar fi natura acid-labilă a formelor reduse de NAD(P)H, a condus la utilizarea solvenților de extracție cu pH neutru de către majoritatea studiilor. . Cu toate acestea, având în vedere interconversia rapidă a metaboliților redusi și oxidați și efectul anoxiei asupra NAD(H)50–53, este de asemenea important să se asigure extracția rapidă a metaboliților tisulari și procedurile adecvate pentru stingerea NAD(P)(H) celular. )-redox/enzime de consum, cum ar fi prin deproteinizare. În acest sens, analiza noastră a colectării de țesuturi pre- versus post-mortem indică faptul că analiza post-mortem favorizează reducerea NAD plus. Reducerea NAD plus tisulară a fost descrisă anterior in vivo în creier, inimă și ficat la șobolani expuși la o atmosferă hipoxică extinsă de 2,5-h54, un mediu care poate fi parțial recapitulat de perioade lungi de post- sacrificați colectarea de țesuturi înainte de congelarea rapidă. Acest lucru poate indica faptul că extragerea țesuturilor în timp ce sunt sub anestezie sau prioritizarea recoltării imediate a țesuturilor destinate a fi utilizate pentru analiza metaboliților după sacrificiu, ar trebui să aibă loc pentru a obține măsurători reprezentative NAD(P)(H).

Există, de asemenea, potențialul pentru diferite metode de cuantificare, fiecare având limitări diferite, de a contribui la variabilitatea globală intra-studiu a măsurătorilor NAD(P)(H). În ultimele două decenii, cele mai frecvent utilizate metode au fost testele de ciclizare a enzimelor, LC-MS și HPLC. Fiecare dintre aceste metode este afectată de tehnicile de extracție a metaboliților, de parametrii de cuantificare și de implementarea unor controale de calitate adecvate. Folosind LC-MS, Lu și colab. au arătat că interconversia dintre formele reduse și oxidate ale metaboliților NAD(P)(H) are loc la viteze diferite în diferite soluții tampon de extracție sau solvenți cu acetonitril:metanol: apă cu 0.1 M amestec de acid formic care dă cea mai mare recuperare cu cele mai puține interconversii31. Cu toate acestea, atunci când se utilizează LC-MS, această interconversie poate fi monitorizată între mostrele individuale ale unui studiu prin adăugarea unor controale interne, cum ar fi izotopii NAD(P)(H), ceea ce reprezintă un avantaj al tehnicii LC-MS față de cea a HPLC și a enzimei. teste ciclice31,33,55. Cu toate acestea, chiar și cu tehnici LC-MS bine controlate, diverși factori pot interfera cu semnalul măsurat, inclusiv efectele matricei și variațiile eficienței ionizării. De exemplu, unele studii folosesc extracte de drojdie marcate cu 13C ca standarde interne în metabolomica bazată pe LC-MS. Cu toate acestea, adăugarea matricei de metaboliți a probei extrase cu o matrice de metaboliți a extractului de drojdie marcată cu 13C poate avea diverse consecințe, cum ar fi suprimarea ionilor, care reduce semnalul metaboliților marcați și/sau nemarcați și poate duce la erori în cuantificarea absolută, dacă nu detectate printr-o evaluare minuțioasă a calității56. De asemenea, deși tehnicile LC-MS permit teoretic măsurarea mai multor metaboliți NAD (P) (H) într-un experiment, există încă limitări, deoarece diluțiile optime trebuie efectuate dacă metaboliții de interes au diferențe mari în concentrații. Astfel, în ciuda avantajelor lor față de testele mai simple de ciclizare a enzimelor, complexitatea metodelor LC-MS impune necesitatea unei optimizări aprofundate. Recent, au fost dezvoltate noi metode analitice, cum ar fi NAD plus biosenzori și spectrometrie de masă bazată pe imagistică, dar există încă date cantitative insuficiente generate de aceste tehnici pentru a le include într-o meta-analiză. Deși, un studiu inclus în meta-analiza noastră a folosit un biosenzor bioluminiscent pe hârtie pentru a măsura nivelurile de NAD plus în ficatul de șoarece și alte tipuri de probe57. Acest studiu a fost inclus în grupul de teste bioluminiscente datorită metodei similare de detectare (Fig. 1a).


Flavonoid

În scopul acestei analize, au fost excluse datele din 677 de studii. Aceasta a inclus studii care au furnizat rezultate relative NAD(P)(H) (51 la sută) mai degrabă decât cantitative, precum și studii în care se concentrează NAD(P)(H)nu a fost normalizat lagreutatea țesuturilor, continutul de proteine, sauvolumul sangelui(13 la sută). 36% dintre studiile excluse au fost efectuate pe specimene neadecvate (de exemplu, subiecți non-mamifere, culturi de celule sau țesuturi). Dincolo de studiile excluse, limitările majore ale acestei meta-analize includ variația sau lipsa informațiilor raportate legate de procedurile pre-analitice (extracția pre- sau post-mortem sau informațiile tampon de extracție) și/sau metodele analitice, împreună cu cu vârsta, sexul, fundalul genetic, dieta și statutul de hrănire la sacrificiu pentru rozătoare.
Deși meta-analiza noastră evidențiază variabilitatea între studii și necesitatea de a standardiza măsurătorile cantitative NAD(P) (H), analiza noastră nu evaluează sau dezbatevaliditatea rezultatelor comparativeîn cadrul unui studiu individual. Având în vedere implicațiile multiplelor metaboliți NAD(P)(H) care servesc ca biomarkeri aisănătatea la om, standardizarea sau optimizarea studiului aprofundat al pre-analitice șiproceduri analiticeva permitecomparații mai bune ale rezultatelor între studii. Acest lucru devine și mai important cu o creșterenumărul de studii clinice care testează efectul medicamentelor sau suplimentelor utilizate pentru a modifica nivelurile tisulare de NAD(P)(H) laîmbunătățirea sănătății la oameni.

Flavonoid (11)

Metode

Căutare de literatură. „Epub înainte de tipărire”, „În curs de procesare și alte citate neindexate”, „Versiuni”, „PubMed-Not-MEDLINE”, „Actualizare zilnică”, „Actualizare săptămânală pentru segmentul frontal”, „Fură înapoi din 1946 pentru a începe de frontau fost căutate citări de segment" între 1946 și 20 iunie 2021, în baza de date MEDLINE ALL (Ovid) șirevizuit pentru articole care conțin date cantitative ale nivelurilor metaboliților NAD(P)(H) în țesuturile mamiferelor, după cum aratăcăptuşite în Anexa S1. Strategia de interogare de căutare a dat 3377 de articole. O căutare suplimentară concentrată pe sânge a fostrealizat folosind aceeași bază de date și a dat 1513 articole (Anexa S2).
Metodologia de screening. Rezumate și titluri care raportează cuantificarea metaboliților NAD (P) (H) în țesuturile și sângele mamiferelor au fost supuse unui screening integral. Toate recenziile abstracte au fost verificate cu o a doua revizuireiar eventualele conflicte au fost rezolvate. În urma selectării rezumatelor, 643 de publicații au fost selectate pentru revizuire integrală pentrucăutarea concentrată pe țesut și 272 pentru căutarea concentrată pe sânge (Fig. 10 suplimentară). Studii care numai predatele referitoare la metaboliți NAD(P)(H) trimise au fost excluse în timpul screening-ului full-text, cu excepțiastudii care raportează NADla care se adaugaraporturi /NADH. Rezultate derivate strict din țesuturi, celule, organite izolate menținuteîn medii sau din sânge eluent din perfuzie au fost excluse. Această revizuire a textului integral a dus la excluderea lui 667(457 plus 210) articole din cauza în principal lipsei datelor despre metaboliți NAD (50,5 la sută), date derivate din neadecvatespecimene (36,3 la sută), sau date prezentate ca unități relative/arbitrare (13,2 la sută). În cele din urmă, au fost incluse 241 de articolemeta-analiza calitativă și 205 în meta-analiză cantitativă (Fig. 10 suplimentară). Deși noastrecăutarea inițială a inclus studii publicate din 1946 până în 20 iunie 2021. După cum sa menționat mai sus, cel mai vechi studiu cudatele cantitative NAD(P)(H) care au îndeplinit criteriile noastre de acceptare au fost publicate în 1961


Extragerea datelor.

Datele numerice pentru metaboliții NAD(P)(H) au fost fie obținute direct din articole, fie extrase din figurile articolului folosind un software semi-automat de extracție a datelor (WebPlotDigitizer58). În plus, acolo unde este cazul, au fost înregistrate punctele de timp de prelevare a țesuturilor în raport cu metodele de sacrificiu și/sau de prelevare de țesut/sânge (adică metoda de anestezie și/sau eutanasiere, manipularea țesuturilor și temperatura de depozitare). Pentru modelele animale, au fost înregistrate speciile, caracteristicile (de exemplu tulpina, genotipul, vârsta și greutatea) și condițiile de mediu (de exemplu, ciclul de somn, tipul de dietă, frecvența de hrănire și starea de hrănire în raport cu prelevarea de țesuturi). În plus, pentru toate studiile, tratamentele (de exemplu, tratamente farmacologice, intervenții chirurgicale, iradiere, inducerea tumorii și alte proceduri aplicate subiecților de studiu) și toate informațiile grupului de studiu (de exemplu, grupurile de tratament sau de boală și controalele corespunzătoare) au fost extrase. În cele din urmă, metoda metodei de cuantificare a NAD(P)(H) (de exemplu, teste enzimatice, bazate pe spectrometrie de masă, HPLC, RMN, bioluminiscență) și specificul publicării (adică titlul publicației, codul de referință [DOI, Medline UI, PMID] sau hyperlink). și anul publicării) au fost notate (Material suplimentar 2).



Analiza datelor. Înainte de analiză, toate concentrațiile au fost convertite în nmol/g de țesut sau nmol/g de proteine ​​pentru probele de țesut sau nmol/ml pentru fracțiile de sânge. Datorită numărului scăzut de rezultate normalizate la conținutul de proteine, arătăm doar rezultate normalizate la greutatea țesuturilor și volumul sanguin. Analiza statistică a fost efectuată cu GraphPad Prism versiunea 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, California, SUA,Disponibilitatea datelorToate datele extrase și analizate în timpul acestui studiu sunt incluse în acest articol publicat și suplimentarfișiere de informații.Primit: 29 aprilie 2022; Acceptat: 7 februarie 2023



Referințe

1. Menzies, KJ, Zhang, H., Katsyuba, E. & Auwerx, J. Protein acetylation in metabolism—Metabolites and cofactors. Nat. Rev. Endocrinol. 12, 43 (2016).
2. Chambon, P., Weill, JD, Doly, J., Strosser, MT & Mandel, P. Despre formarea unui nou compus adenilic prin extracte enzimatice ale nucleelor ​​hepatice. Biochim. Biophys. Res. comun. 25, 638–643 (1966).
3. Hassa, PO, Haenni, SS, Elser, M. & Hottiger, MO Reacții nucleare de ADP-ribozilare în celulele de mamifere: Unde suntem astăzi și unde mergem? Microbiol. Mol. Biol. R 70, 789–829 (2006).
4. Takasawa, S., Nata, K., Yonekura, H. & Okamoto, H. ADP-riboză ciclică în secreția de insulină din celulele beta pancreatice. Science 259, 370–373 (1993).
5. Wolf, IMA și colab. Pionierii activării celulelor T: semnalele inițiale localizate de Ca2 plus mediate de NAADP și receptorul de rianodină de tip 1. Sci. Semnal. 8, ra102 (2015).
6. Malavasi, F. et al. Evoluția și funcția familiei de gene ADP Ribosyl cyclase/CD38 în fiziologie și patologie. Physiol. Apoc. 88, 841–886 (2008).
7. Gasser, A., Bruhn, S. & Guse, AH. Funcția de mesager al doilea al fosfatului de adenin dinucleotidă a acidului nicotinic, evidențiată printr-un test de ciclizare enzimatică îmbunătățită*. J. Biol. Chim. 281, 16906–16913 (2006).
8. Kulkarni, CA & Brookes, PS Compartimentarea celulară și funcțiile redox/non redox ale NAD plus. Antioxid. Semnal redox.31, 623–642 (2019).
9. Xiao, W., Wang, R.-S., Handy, DE & Loscalzo, J. Cupluri redox NAD(H) și NADP(H) și metabolismul energetic celular. Antioxid. Semnal redox. 28, 251–272 (2018).

10. Love, NR et al. NAD kinaza controlează biosinteza NADP animală și este modulată prin mecanisme dependente de calmodulină divergente din punct de vedere evolutiv. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 1386–1391 (2015).

Cere mai mult:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950









S-ar putea sa-ti placa si