Metformin îmbunătățește stemness-ul celulelor stem umane derivate din adipos prin downmodulation

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Țesutul adipos joacă un rol important în reglarea homeostaziei metabolice prin stocarea excesului de grăsime și protejarea altor organe de lipotoxicitate. Îmbătrânirea este asociată cu redistribuirea centrală a grăsimilor, culminând cu o scădere a concentrației subcutanate insulino-sensibile și o creștere a depozitelor adipoase viscerale rezistente la insulină. Celulele stem derivate din adipos (ASC) joacă un rol important în regenerarea țesutului adipos. ASC-urile îmbătrânite prezintă o scădere a tulpinii și a potențialului regenerativ din cauza acumulării de stres oxidativ și a leziunilor celulare legate de disfuncția mitocondrială. Metformina este un medicament anti-diabetic bine stabilit, care a demonstrat efecte anti-îmbătrânire în diferite organisme și modele animale. În acest studiu, am analizat efectul tratamentului cu metformină asupra tulpinii ASC-urilor umane în culturi celulare și modele de cultură de țesut adipos întreg. Rezultatele noastre demonstrează că metformina îmbunătățește stemness-urile ASC, reducând rata de proliferare și diferențierea adipocitelor. Investigand posibilul mecanism de bază, am observat o scădere a activității mTOR și ERK în ASC tratate cu metformină. În plus, am observat o creștere a activității autofagiei la tratamentul cu metformină. Concluzionăm că tratamentul cu metformin îmbunătățește stemness-ul ASC prin reducerea mTOR și ERKsemnalizarea și îmbunătățirea autofagiei. Evaluările viitoare in vivo pe modele animale și oameni vor deschide calea pentru adaptarea clinică a acestui medicament bine stabilit pentru revigorarea celulelor stem îmbătrânite.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Cuvinte cheie:celule stem adipoase; țesut adipos; tulpina; diferenţiere; proliferare; metformin;mTOR; ERK; autofagie

1. Introducere

Țesutul adipos este un organ dinamic care contribuie cu un rol homeostatic important în reglarea echilibrului nutrițional, a sensibilității la insulină și a modulării imune. Țesutul adipos îndeplinește acest rol prin stocarea și oxidarea excesului de acizi grași, prevenind astfel steatoza și lipotoxicitatea în alte organe [1]. Rezistența la insulină asociată cu vârsta este cea mai răspândită boală metabolică. Aproximativ 25% din populația americană de peste 65 de ani suferă de diabet, ceea ce duce la rate mai mari ale mortalității, o stare funcțională redusă, un risc crescut de spitalizare și o povară excesivă pentru economia sănătății [2]. Deși asocierea dintre diabet și obezitate a fost recunoscută de mult timp, legătura dintre îmbătrânire și diabetul de tip 2 rămâne evazivă [3]. Prima observație referitoare la scăderea toleranței la glucoză la îmbătrânire a fost făcută în 1921 [4]. Mai multe studii au identificat de atunci o sensibilitate redusă la insulină ca fiind cauza principală a deteriorării metabolismului glucozei cauzată de vârstă [5,6]. Pe baza localizării anatomice, țesutul adipos poate fi subdivizat în linii mari în două depozite: depozite adipoase subcutanate și viscerale. Locația și funcția depozitului de țesut adipos sunt importante în ceea ce privește sensibilitatea la insulină; de exemplu, depozitul visceral este mai rezistent, în timp ce depozitul subcutanat este mai sensibil la insulină [7]. O pierdere graduală legată de vârstă a volumului țesutului adipos subcutanat are ca rezultat reducerea absorbției de glucoză și lipide, ceea ce duce la excesul de lipide și depunerea ectopică de lipide în mușchi și ficat, contribuind la dezvoltarea rezistenței la insulină [8].

Țesutul adipos este compus din diferite tipuri de celule. Digestia enzimatică a țesutului adipos cu colagenază produce două fracții principale: fracția adipocitară și fracția vasculară stromală (SVF)[9]. SVF cuprinde celule stem derivate din adipos (ASC), limfocite, celule endoteliale, pericite și fibroblaste [10]. ASC-urile sunt definite imun-fenotipic ca celule CD34 plus CD90 plus CD29 plus CD45-CD31 de origine mezenchimală, prezentând capacități de diferențiere tri-linie în os, cartilaj sau grăsime [11,12]. În țesuturile adipoase albe, aceste celule rezidă în principal în stroma vasculară din jurul vaselor de sânge mici și pot prolifera și se diferențiază în adipocite[11]. Celulele stem derivate din adipos (ASC) joacă un rol important în regenerarea țesutului adipos prin proliferare, auto-reînnoire și diferențiere. Îmbătrânirea este asociată cu pierderea acestor proprietăți de stemness în ASC [13,14]. Se crede că o scădere legată de vârstă a dimensiunii depozitului de grăsime subcutanată se datorează replicării și diferențierii modificate a ASC[15-17]. Findeisen și colab. sugerează acumularea de stres oxidativ în țesutul adipos în timpul îmbătrânirii, care are un impact negativ asupra capacității de diferențiere; [15] cu toate acestea, mecanismul (mecanismele) exacte care stau la baza pierderii tulpinii în ASC nu este înțeles. Studii recente au arătat că autofagia redusă, ținta mecanicistă mai mare a căii rapamicinei (mTOR) și acumularea de specii reactive de oxigen (ROS) sunt legate de pierderea tulpinii în ASC și de inducția prematură a senescenței în ASC [18-20].

Cistanche poate anti-imbatranire

Metformina este un medicament antidiabetic utilizat în mod obișnuit pentru a scădea glicemia și pentru a îmbunătăți sensibilitatea la insulină. Poate fi folosit pentru a trata o varietate de tulburări metabolice legate de îmbătrânire, cum ar fi bolile cardiovasculare, cancerele și declinul cognitiv [21,22]. Efectele de creștere a longevității ale metforminei au fost demonstrate la viermi, șoareci și șobolani prin restricție alimentară, care imită efectul de stimulare a activității protein kinazei activate de adenozin monofosfat (AMPK) [23]. Diverse studii au arătat că metformina inhibă ținta rapamicinei la mamifere (mTOR)[24,25]. Căile de semnalizare AMPK-mTOR reglează în mod specific caracteristicile homeostazelor celulare, cum ar fi autofagia, proliferarea, metabolismul energetic și sinteza proteinelor [26]. S-a demonstrat că metforminul inhibă proliferarea, diferențierea și inflamația, reducând stresul oxidativ și potențialul mitocondrial și îmbunătățind stemness general în diferite tipuri de celule stem adulte [27,28]. Efectul metforminei asupra metabolismului și stării tulpinilor ASC in vitro și in vivo nu este clar.

În acest studiu, am folosit cultura 2D a ASC-urilor umane și tehnicile întregii culturi de țesut adipos uman pentru a simula organizarea celulară in vivo și micromediul tisular. Folosind aceste modele experimentale, am studiat efectul tratamentului cu metformin asupra diferențierii, proliferării și stemness-urilor ASC și am investigat mecanismele moleculare implicate în aceste procese celulare.

2. Materiale și metode

2.1.Specificațiile donatorului

Țesutul adipos a fost colectat de la cinci donatoare nediabetice de sex feminin cu vârsta cuprinsă între 39 ± 13 și intervalul IMC de 27 ± 4, supuse unor proceduri de chirurgie plastică electivă la Centrul Medical al Universității din Pittsburgh (UPMC). Procedura de colectare a țesuturilor a fost aprobată de Consiliul de revizuire instituțional al Universității din Pittsburgh (IRB nr.0511186).

2.2. Izolarea și cultivarea ASC-urilor umane

Celulele precursoare adipoase au fost izolate după cum urmează[19,29]. Biopsiile de țesut adipos după procedurile chirurgicale au fost transferate în laborator într-un recipient steril sigilat. Țesutul a fost clătit cu soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), urmată de îndepărtarea materialului fibros și a vaselor de sânge prin disecție. Țesutul a fost tăiat în bucăți (1-2 mg) și digerat în tampon de digestie (HBSS care conține 200 U/mL colagenaze (CLS Tip II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI) , SUA) și 2 procente fără BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA)) sub agitare timp de 60 de minute la 37 de grade; 1 mg țesut adipos/3 ml tampon de digestie. Țesutul dispersat a fost centrifugat timp de 10 minute la 200 xg la temperatura camerei. Adipocitele plutitoare au fost aspirate, iar celulele granulate ale fracțiunii vasculare stromale (SVF) au fost suspendate în tampon de liză a eritrocitelor (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) și incubate timp de 10 minute la temperatura camerei. Pentru a îndepărta resturile de țesut, suspensia celulară a fost filtrată printr-o plasă de nailon (dimensiunea porilor 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). După o altă etapă de centrifugare (10 minute la 200 × g) SVF peletizat a fost suspendat în mediu ASC (mediu Eagle modificat de la Dulbecco (DMEM)/mediu F-12 (1:1) cu HEPES și L-glutamină (Thermo Fisher). Scientific, Waltham, MA, SUA), suplimentat cu biotină 33 μM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), 17 μM pantotenat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), 10ng/mL EGF,1 ng/mL bFGF, 500 ng/mL insulină, 2,5% ser fetal bovin și 12,5 μM/mL gentamicină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și însămânțate la o densitate de 50,000 celule /cm2 în baloane T175.

După ce s-au atins 70 procente de confluență, celulele au fost spălate cu PBS și tripsinizate folosind 0,05 procente de soluție de tripsină-EDTA 1x (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Tripsina a fost inactivată prin adăugarea de mediu ASC plus 10% FBS și îndepărtată prin centrifugare la 300 x g timp de 5 minute înainte ca celulele să fie însămânțate la o densitate de 5000 celule/cm². ASC-urile au fost din nou crescute până la 70% confluență înainte de divizare. ASC-urile din pasaje 3-4 au fost utilizate în acest studiu. Celulele au fost tratate cu diferite concentrații de metformină (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, SUA), rapamicină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) sau inhibitor U0126 conform schemei experimentale.

2.3. Diferențierea adipogenă

Pentru inducerea adipogenezei, ASC-urile au fost însămânțate la o densitate de 50,000 celule/cm² în plăci de cultură celulară de 6-godeuri. Adipogeneza a fost indusă folosind un mediu de diferențiere, compus din 0,2 uM insulină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA),0,5 mM 1-metil{{9 }}izobutilxantină (IBMX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), 0,25 μM dexametazonă (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și 10 ug/mL transferină (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) în ASCmedium. După 3 zile de diferențiere, mediul a fost schimbat și celulele au fost cultivate în mediu de diferențiere fără IBMX timp de 14 zile.

2.4.Cultura de țesut adipos

Cultura de țesut adipos a fost efectuată în 6-plăci de cultură celulară de godeuri, cu unele modificări, după cum a fost publicat de Harms și colab. [30]. Întregul țesut adipos a fost tăiat în bucăți mai mici de 3-5 mm și cultivat în mediu de cultură celulară de 5 ml. Filtre de celule cu o dimensiune a porilor de 70 μM au fost păstrate peste fragmentele de țesut pentru a menține țesutul scufundat în mediu. Fragmentele de țesut au fost digerate cu colagenază, așa cum s-a explicat mai sus pentru procedura de izolare a ASCs, iar SVF a fost analizat pentru expresia genelor stemness asociate cu ASC.

2.5. Ulei Roșu O Colorare

Pentru vizualizarea picăturilor de lipide, celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 1 oră și colorate cu 0,3% Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) în izopropanol/apă ( 60:40) timp de 1 oră. Spălarea finală a fost efectuată de două ori cu apă distilată. Pentru cuantificarea Oil Red O absorbită, pata a fost eluată cu izopropanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), iar densitatea optică a fost măsurată la 518 nm.

2.6. Colorarea corporală

În ziua 14 după inducția adipogenezei, celulele au fost colorate cu Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, SUA) și Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) timp de 30 de minute la 37 de grade. Imaginile au fost achiziționate folosind microscopul fluorescent și analizate cu software-ul ImageJ.

2.7. FlouCitometrie

ASC-urile din pasajul trei au fost utilizate pentru analizele citometrice în flux pentru expresia de suprafață a CD29 (Biolegend, San Diego, CA, SUA), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, SUA), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, SUA) , CD24 (Biolegend, San Diego, CA, SUA) și CD31 (BD, NJ, SUA). Celulele au fost tripsinizate, spălate cu PBS și colorate cu anticorpi în tampon de colorare FACS (1% BSA în PBS). ASC-urile necolorate au fost folosite ca martor. Semnalul fluorescent a fost măsurat folosind un citometru în flux (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, SUA), iar datele au fost analizate folosind software-ul FlowJo (BD, Franklin Lakes, NJ, SUA).

2.8. Diferențierea osteogenă

ASC-urile au fost crescute până la confluența în plăci de godeuri și diferențierea osteogenă a fost indusă folosind un mediu osteogenic (DMEM 10% FBS, 0,1 uM dexametazonă, 10 mM - glicerol fosfat și 50 μM acid ascorbic). În ziua 21 de după diferențiere, celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și colorate cu Alizarin Red Stain (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). a fost realizat folosind software-ul Image J.

2.9.Detecția apoptozei prin colorare cu anexină V-APC/PI

Moartea celulelor apoptotice a fost măsurată folosind un kit Annexin V-APC/PI (Biolegend, San Diego, CA, SUA). Un total de 10,000(celule/godeu) ASC au fost însămânțate pe 6-plăci de godeuri și incubate la 37 de grade cu 5% CO2. Celulele au fost tratate cu metformină (0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM și 5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). După 72 de ore de tratament, celulele au fost tratate colectate prin tripsinizare și colorate cu 2,5 μL AnnexinV-APC și 2,5 μL tampon de legare PIin, incubate la întuneric la temperatura camerei timp de 15 până la 20 de minute și analizate prin citometrie în flux (Fortessa, BD, NJ, SUA).

2.10.Detecția speciilor de oxigen de reacție

Nivelurile de ROS au fost determinate folosind o sondă colorant fluorescent 2',7'-diclorofluorescein diacetat (DCFH2-DA) (Invitrogen, Waltham, MA, SUA). ASC-urile (10,000 celule/godeu) au fost cultivate într-o placă de 6-godeuri și incubate cu metformină (5 mM) la 37 de grade, 5% CO, timp de 72 de ore. După incubare, ASC-urile au fost tripsinizate și colorate cu colorant DCFH2-DA 50μM timp de 30 de minute la 37 de grade și analizate folosind un microscop cu fluorescență.

2.11. Colorarea TMRM

ASC (10,000 celule/godeu) au fost cultivate într-o placă de 6-godeuri, tratate cu diferite doze de metformină (5 mM) timp de 72 de ore și incubate la 37 de grade cu 100 nM TMRM (Sigma-Aldrich) , St. Louis, MO, SUA) timp de 30 min la 37C. După incubare, celulele au fost observate la microscop cu fluorescență. Imaginea] a fost folosită pentru a cuantifica fluorescența imaginilor microscopice.

2.12. Expresia cantitativă a genei RT-PCR

ARN-ul total a fost izolat cu RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germania), iar sinteza cADN-ului a fost efectuată cu kit-ul de sinteză RevertAid First Strand cADN (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Primerii specifici genei au fost achiziționați de la Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA. Analiza cantitativă a expresiei a fost efectuată utilizând Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Cuantificarea ARNm a fost efectuată utilizând -actină pentru normalizare. Datele pentru fiecare transcriere a genei au fost normalizate prin calcularea diferenței (ACt) dintre genele Ct-housekeeping și Ct-Target. Creșterea sau scăderea relativă a expresiei a fost calculată prin compararea genei de referință cu gena țintă (AACT) folosind formula pentru expresia relativă (=24ACt).

2.13. Western Blot

Analiza Western blot a fost efectuată în esență așa cum este descris [19]. Metoda utilizată pentru normalizarea nivelurilor de proteine ​​a fost „Pierce BCA Protein Assay Kit” (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Lizatele celulare (15 ug proteină totală pe bandă) au fost preparate în tampon de probă de dodecil sulfat de sodiu (SDS), separate prin SDS-PAGE și tamponate pe membrane de difluorură de poliviniliden. Au fost utilizați următorii anticorpi: șoarece anti-actină umană (Proteintech, IL, SUA), perilipină (Cell Signaling, MA, SUA), fosfor-P70S6K (Cell Signaling, MA, SUA), total P70S6K (Cell Signaling, MA, SUA), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, SUA), ERK1/2 total (Cell Signaling, MA, SUA), conjugat IgG HRP anti-șoarece (Proteintech, IL, SUA) și IgG HRP anti-șobolan de iepure ( Protetech, IL, SUA). Software-ul Image J a fost folosit pentru analizele densitometrice. 2.14.Analiza statistică

Analizele statistice au fost efectuate în GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA). FlowJo a fost utilizat pentru analiza FACS. Semnificația diferenței dintre medii a fost evaluată prin testul t Student sau analiza varianței. Eroarea goală este reprezentată ca medie ± SEM. Valorile au fost semnificative la valorile p de<><0.01 and=""><>

3. Rezultate

Metformina este un medicament antidiabetic bine stabilit, care s-a dovedit a juca un rol important în extinderea longevității [31]. Pentru a studia efectul tratamentului cu metformin asupra stării celulelor stem derivate din adipos, am izolat ASC din țesutul adipos al donatorilor umani prin digestia colagenazei. ASC-urile izolate au fost aderente de plastic și au prezentat o morfologie fibroblastică sau în formă de fus. Analiza citometriei în flux a arătat că ASC-urile au fost pozitive pentru markerii de celule stem mezenchimale, cum ar fi CD29, CD90 și CD24, dar negative pentru markerul de descendență hematopoietică CD45 și markerul de descendență endotelială CD31 (Figura 1A). În plus față de afișarea fenotipului tipic ASC, ASC-urile au arătat un potențial de diferențiere adipogen și osteogenic robust, identificat prin colorarea cu Bodipy și, respectiv, Alizarin Red S (Figura 1B).cistanche แอ ม เว ย์ASC-urile caracterizate au fost utilizate pentru experimente ulterioare în studiul nostru.

S-a raportat în literatură că metforminul reduce diferențierea adipogenă a celulelor stem. Ne propunem să explorăm reglarea diferențierii adipocitelor ASC după tratamentul cu metformină. ASC-urile au fost tratate cu 1, 2,5 și 5 metformină începând cu 2 zile înainte de inducția adipogenă și pe tot parcursul procesului de diferențiere. Bodipy și Oil Red Ostains au fost folosite pentru a vizualiza picăturile de ulei în ziua 14 după inducerea diferențierii. Rezultatele Oil Red O (Figura 1C) și colorația Bodipy (Figura 1D) dezvăluie că tratamentul cu metformin inhibă semnificativ diferențierea adipogenă într-o manieră dependentă de doză în comparație cu celulele martor. Inhibarea diferențierii adipogenice a fost confirmată în continuare utilizând analiza Western blot a proteinei marker de diferențiere adipocitelor perilipină. Pentru aceasta, lizatele celulare au fost colectate din celule diferențiate în ziua 14 de diferențiere adipogenă și a fost analizată expresia perilipinei. Rezultatele noastre Western blot arată o reducere semnificativă a expresiei perilipinei la tratamentul cu metformină în timpul diferențierii adipogenice (Figura 1E), care s-a corelat cu scăderea petelor Bodipy și Oil Red O. Concluzionăm că tratamentul cu metformină inhibă diferențierea adipogenă a ASC umane, mărimea inhibării corelând pozitiv cu doza de tratament cu metformină.

Rate mai mari de diferențiere și proliferare duc la pierderea tulpinii. Deoarece am observat că metforminul reduce diferențierea adipogenă, am fost interesați să investigăm efectul tratamentului cu metformin asupra proliferării ASC in vitro. ASC-urile au fost tratate cu metformină, iar celulele au fost numărate în ziua 4 post-cultură în prezența sau absența metforminei. Din rezultatele noastre, am observat că metforminul scade semnificativ rata de proliferare celulară în comparație cu ASC-urile de control (Figura 2A). Celulele stem joacă un rol important în regenerarea și întreținerea țesuturilor.câtă cistanche să iaPentru a-și îndeplini eficient rolul de regenerare, celulele stem trebuie să-și mențină caracteristica de stemness. Am analizat efectul tratamentului cu metformin asupra expresiei genelor stemness în ASC. În acest scop, am folosit PCR cantitativ în timp real pentru a analiza genele legate de întreținerea stemness în ASC. Am observat că metformina a reglat semnificativ expresia markerilor de celule stem adipoase, cum ar fi BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 și DLK1, în comparație cu ASC-urile de control (Figura 2B). Rezultatele noastre demonstrează că tratamentul cu metformin încetinește eficient proliferarea ASC, prevenind astfel celulele de la epuizarea proliferării prin îmbunătățirea expresiei genelor semnăturii stemness.

Figura 1. Tratamentul cu metformin inhibă diferențierea adipogenă a ASC într-o manieră dependentă de doză. (A) ASC-urile au fost testate pentru expresia CD29, CD90, CD24, CD31 și CD45 prin citometrie în flux. Sunt prezentate atât pozitivitatea procentuală prezentată în histograme, cât și intensitatea medie a fluorescenței (MFI) prezentate în tabelul de control (ASC-uri necolorate) și colorate (ASC-uri tratate cu anticorpii respectivi). (B) ASC-urile au fost supuse diferențierii adipogene sau osteogene folosind cocktail-uri de diferențiere specifice liniei. Diferențierea față de descendența adipocitelor a fost confirmată prin colorația Bodipy, iar osteogeneza a fost confirmată prin colorarea cu roșu alizarina. Procentul zonei colorate cu roșu alizarina a fost calculat utilizând imaginea J. (C) ASC-urile au fost tratate cu un cocktail de diferențiere a adipocitelor în prezența sau absența diferitelor doze de metformină timp de 14 zile. Dezvoltarea adipocitelor în ziua 14 post-inducție a fost evaluată prin colorarea picăturilor de lipide folosind colorarea Oil Red O. A fost extrasă pata Oil Red O absorbită și a fost măsurată densitatea optică. Densitatea optică din ASC de control a fost luată ca 100 la sută și a fost reprezentată grafică modificarea relativă la tratamentul cu metformin (n =3). (D) Conținutul de lipide în ziua 14 a fost determinat folosind colorant Bodipy (verde). Hoechst (albastru) a fost folosit pentru a colora nucleele.ce este o cistanche(E) Analiza Western blot a expresiei proteinei perilipină. -Actina a fost folosită ca control al încărcării. Cuantificarea densităților benzilor de proteină perilipină normalizate la -Actina utilizată Imaginea J. Imaginile și graficele sunt reprezentative a trei replici independente (n=3). *p<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Pentru a exclude faptul că scăderea diferențierii și proliferării nu se datorează niciunui efecte citotoxice ale metforminei asupra ASC, am analizat viabilitatea celulelor tratate cu metformină. Analizele colorării AnnexinV/PI prin citometrie în flux nu au demonstrat nicio creștere semnificativă a celulelor apoptotice sau necrotice la tratamentul cu concentrații crescânde de metformină până la 5 comparativ cu mediul de cultură celulară de control (Figura 3A). Activitatea mitocondrială și generarea de specii reactive de oxigen (ROS) sunt importante pentru diferențierea celulelor și au fost observate niveluri crescute de metabolism mitocondrial și generarea de ROS în timpul diferențierii adipogene [32]. Din rezultatele noastre, am observat că tratamentul cu metformin reduce diferențierea adipogenă a ASC. Apoi am investigat efectele asupra activității mitocondriale și producției de ROS. ASC-urile au fost tratate cu metformină și colorate cu TMRM pentru a evalua activitatea membranei mitocondriale și cu DCF2DA pentru estimarea concentrației de ROS. Imaginile microscopului fluorescent și cuantificarea semnalului fluorescent au arătat că tratamentul cu metformin reduce semnificativ activitatea mitocondrială (Figura 3B, C) și producția de ROS (Figura 3D, E). Concluzionăm că o scădere mediată de metformină a activității mitocondriale și a producției de ROS contribuie la o creștere a tulpinii ASC.

Pentru a înțelege posibila cascadă de semnalizare responsabilă pentru diferențierea, proliferarea și reglarea în sus a genelor stemness în ASC după tratamentul cu metformină, ne-am concentrat asupra cascadelor de semnalizare mTOR, autofagie și kinazei reglate de semnal extracelular (ERK). Studiile anterioare au arătat rolul important al acestor căi în menținerea stemnessului în ASC[19,33]. Atât semnalizarea ERK cât și mTOR joacă un rol important în promovarea proliferării și diferențierii celulare. După ce ASC-urile au fost tratate cu diferite doze de metformină, lizatele celulare au fost colectate și Western blotted pentru LC3, kinaza p70S6 fosforilată, kinaza p70S6 totală, ERK42/44 fosforilată și anticorpii ERKp42/44 totali. Beta-actina a fost folosită ca genă de menaj. Analiza Western blot a arătat că, în comparație cu ASC-urile de control, tratamentul cu metformin a reglat în jos expresia p70S6K fosforilată și fosforilată-ERK42/44 kinazei (Figura 4A, B, D). Atât semnalizarea ERK, cât și mTOR joacă un rol important în reglarea căii autofagiei.bioflavonoideRezultatele Western blot au arătat că tratamentul cu metformin îmbunătățește activitatea autofagiei în ASC (Figura 4A, C). Am analizat în continuare expresia genelor căii autofagiei la tratamentul cu metformină la nivel de ARNm prin utilizarea PCR cantitativă în timp real. Cu analiza qPCR, am observat o creștere semnificativă a genelor căii autofagiei VMP1, P62, ATG5 și ATG7 la tratamentul cu metformină (Figura 4E), care este în concordanță cu creșterea activității autofagiei prezentate în rezultatele noastre Western blot. O creștere nesemnificativă a expresiei ATG 9 a fost, de asemenea, observată în analizele noastre. Concluzionăm că tratamentul cu metformină reduce activitatea ERK și mTOR și îmbunătățește autofagia în ASC ca un posibil mecanism de bază pentru reducerea proliferării și diferențierii și creșterea stemness-ului.

Pentru a sublinia rolul direct al semnalizării ERK și mTOR în inhibarea diferențierii mediată de tratamentul cu metformină și creșterea stemness în ASC, am inhibat separat semnalizarea ERK și calea mTOR folosind inhibitorul ERK U0126 și respectiv rapamicina și am analizat efectele asupra ASC. diferențiere și stemness [19,33]. Adăugarea inhibitorului ERK U0126 în timpul diferențierii adipocitelor a ASC-urilor a dus la o diferențiere semnificativ redusă, după cum a arătat imaginile colorate cu Bodipy și cuantificarea fluorescenței (Figura 5A, B). a semnalizării ERK (Figura 5C) a susținut în continuare descoperirea noastră că reglarea în jos a căii ERK prin tratamentul cu metformină contribuie la creșterea stemness.

Am folosit apoi rapamicina, un inhibitor bine cunoscut al căii mTOR care poate activa autofagia și am evaluat efectele asupra expresiei genei adipogenezei și stemness [19]. Lizatele celulare ale ASC tratate cu rapamicin au fost colectate și testate cu kinază p70S6 fosforilată, kinază p70S6 totală și anticorpi -actin. Am observat că rapamicina a reglat în jos expresia kinazei p70S6 fosforilate (Figura 6A). Pentru a determina rolul funcțional în diferențierea adipogenă, ASC-urile au fost tratate cu rapamicină și induse cu mediul adipogen. După 14 zile, celulele au fost colorate cu colorant Bodipy pentru a evalua adipogeneza. Am observat că tratamentul cu rapamicină a redus semnificativ diferențierea adipogenă (Figura 6B, C). În continuare, am analizat efectul blocării transducției semnalului mTOR asupra stemness-urilor ASC. În acest scop, ASC-urile au fost tratate cu rapamicină și a fost utilizată PCR în timp real pentru a măsura expresia transcrierilor legate de stemness. Am observat că rapamicina a reglat în mod semnificativ expresia markerilor legați de stemness (Figura 6D). Concluzionăm că inhibarea ambelor căi ERK și mTOR contribuie la o scădere a diferențierii adipocitelor și la o creștere a stemness în ASC-urile umane.

Apoi, am testat dacă am putea reproduce efectele de îmbunătățire a tulpinii ale tratamentului cu metformin asupra ASC-urilor cultivate în 2D într-un model de cultură de țesut adipos întreg mai complex și translatable in vivo. Pentru aceasta, am modificat protocolul de cultură de țesut adipos publicat de Harms și colab.30] folosind filtre de celule în loc de inserții transwell pentru a menține fragmentele de țesut adipos scufundate în mediu (Figura 7A). După ce am cultivat fragmente de 3-5 mm de țesut adipos uman cu sau fără metformină timp de 5 zile, am izolat fracția vasculară stromală (SVF) prin digestia colagenază a fragmentelor de țesut adipos și am analizat expresia genelor legate de stemness. Datele PCR în timp real au arătat că SVF din țesutul adipos tratat cu metformină a demonstrat o suprareglare semnificativă a expresiei markerilor stemness precum BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR și Wnt2 (Figura 7B). ).

4. Discutie

Celulele stem adipoase (ASC) regenerează țesutul adipos prin auto-reînnoire și diferențiere, menținând astfel rezervorul de celule stem al țesutului. Cu toate acestea, îmbătrânirea și obezitatea sunt asociate cu pierderea proprietăților stemness în ASC. Metformina este un medicament antidiabetic și a arătat rezultate promițătoare ca agent anti-îmbătrânire. Ne-am concentrat pe analiza efectului metforminei asupra tulpinii ASC-urilor și pe înțelegerea mecanismului de bază, cu scopul de a stabili metformina ca agent potențial pentru menținerea tulpinii în ASC-uri odată cu vârsta. Pentru o traducere mai ușoară a rezultatelor noastre la subiecții umani, am folosit un model de cultură celulară 2D a ASC-urilor umane și am folosit metoda culturii de țesut adipos uman pentru a simula mediul de țesut mai complex. Am folosit țesut adipos subcutanat ca sursă de țesut pentru studiile noastre. Folosind aceste metode diverse de cultură de celule și țesuturi, am studiat efectul tratamentului cu metformină asupra tulpinii ASC.

Obezitatea determină o modificare a cineticii de diferențiere a ASC, care scade acumularea de celule stem. Rezultatele noastre au sugerat că, în comparație cu ASC netratate, tratamentul cu metformin a redus rata adipogenezei într-o manieră dependentă de doză. Această observație este în concordanță cu rapoartele anterioare care au arătat că metformina inhibă adipogeneza în celulele stem adipoase, celulele stromale ale măduvei osoase, celulele stem ale ligamentului parodontal și liniile celulare 3T3 [34-37]. Rata de proliferare a celulelor stem joacă un rol important în menținerea pool-ului de celule stem, a capacității de auto-reînnoire. Am observat că metformina a inhibat proliferarea ASC fără a induce vreun efect citotoxic asupra ASC, ceea ce este de acord cu alte studii publicate pe șoareci celule stem derivate din adipos [28], celule stromale și fibroblaste [38,39].cumpara cistancheUn studiu recent folosind celule stem derivate din adipos de la cai a arătat un efect pro-proliferativ al metforminei [27]. Cea mai probabilă explicație pentru aceste observații contradictorii este diferența dintre speciile donatoare și locul anatomic al recoltării celulelor, deoarece ASC-urile de cal au fost recoltate din coadă. Agnieszka Smieszek și colab. a observat că metformina inhibă proliferarea celulară și promovează moartea celulară cu doze crescânde (5 și 10 mM) în celulele stromale derivate din măduva osoasă de șoarece și linia de celule fibroblaste embrionare Balb/3T3 [40]. În plus, metformina inhibă proliferarea celulelor satelit izolate din mușchii șoarecilor |41. În sprijinul observației noastre, Min-lung Park și colab. au raportat că metformina îmbunătățește proprietatea antiinflamatoare a ASC-urilor umane prin scăderea nivelurilor de expresie ale IL-1, IL{-6 și TGF-; metformina crește, de asemenea, supraviețuirea ASC-urilor transplantate și protejează împotriva morții celulelor apoptotice [42]. Aceste rezultate indică efecte diferite ale tratamentului cu metformin asupra viabilității celulelor derivate de la diferite specii și că ASC-urile umane sunt rezistente la potențialele efecte citotoxice ale tratamentului cu metformin.

Diferențierea ASC-urilor în adipocite este asociată cu cerințe mai mari de energie și rate metabolice, rezultând o activitate mitocondrială mai mare și producție de ROS. SRO joacă un rol esențial în menținerea inactivității și a stării în celulele stem adulte, deoarece nivelurile mai ridicate de SRO împing celulele spre diferențiere și în cele din urmă spre senescența și moartea celulelor stem [43]. Am observat că metforminul scade semnificativ potențialul membranei mitocondriale și generarea de specii reactive de oxigen. În conformitate cu datele noastre, studiile anterioare au raportat, de asemenea, că metformina scade stresul oxidativ și îmbunătățește expresia antioxidantă în fibroblastele embrionare de șoarece [44], ASC de șoarece [38] și celulele endoteliale aortice umane [45]. Mai mult, în acord cu studiul nostru, Chien-Hung Lin și colab., au raportat că metformina acționează ca un agent neuroprotector prin reducerea stresului oxidativ în celulele stem neuronale umane [46]. Mai multe alte studii confirmă că metforminul acționează ca un antioxidant prin reducerea stresului oxidativ și creșterea expresiei enzimelor antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza în ASC-urile de șoarece, mioblastele C2C12 murine și celulele progenitoare endoteliale umane circulante [38,47,48]. Mai mult, studiul lui Alejandro Martin-Montalvo et al. susține observația noastră, demonstrând că metformina inhibă semnificativ complexul mitocondrial, inhibând respirația mitocondrială la șoareci [49] Efectele metforminei asupra generării reduse de specii reactive de oxigen sunt posibil mediate de creșterea glutationului redus [50] într-un mecanism care implică redox- factor de transcripție sensibil Nrf2 [51].

S-a demonstrat că metforminul promovează starea de repaus a celulelor satelit prin scăderea metabolismului necesar pentru proliferare și diferențiere. Diverse studii confirmă, de asemenea, că metformina promovează puternic întinerirea și întinerirea celulelor stem [23,39,41,49,52,53]. De asemenea, se știe că îmbunătățește semnificativ și reglează în creștere nivelurile de expresie ale markerilor de celule stem. Deoarece am observat că metformina inhibă proliferarea și adipogeneza prin inhibarea stresului oxidativ și a activității mitocondriale, am căutat să confirmăm dacă metformina îmbunătățește stemness în ASC sau într-un model de cultură de țesut adipos in vitro. În consecință, am observat că metformina a îmbunătățit semnificativ expresia markerului legat de stemness a DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 și Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 și Mycl în modelele 2D ASCculture și culturi de țesut adipos. . Utilizarea întregii culturi de țesut adipos oferă o oportunitate unică de a simula micromediul de țesut uman in vivo, în care celulele sunt orientate ca în arhitectura lor naturală și au suport interactiv din diferite tipuri de celule țesute în matricea tisulară. Din câte cunoștințele noastre, studiul nostru demonstrează pentru prima dată un efect de îmbunătățire a tulpinii al tratamentului cu metformin asupra ASC-urilor umane, atât în ​​culturi 2D, cât și în întregul țesut adipos. Considerăm că rezultatele noastre care arată o suprareglare a semnăturii genelor stemness în ASC izolate din fragmente de țesut adipos tratate cu metformină pledează pentru investigarea ulterioară a utilizării metforminei ca terapie pentru a încetini procesul de îmbătrânire și a întineri țesuturile adipoase îmbătrânite.

Ținta mecanică a rapamicinei (mTOR) joacă un rol cheie în proliferarea și diferențierea celulelor stem. Reducerea activității mTOR prin manipulare genetică, intervenție terapeutică sau modificări legate de stilul de viață crește stemness și longevitatea [19,20]. Deoarece am observat că metformina inhibă adipogeneza, am testat efectul metforminei asupra semnalizării mTOR. Interesant, rezultatele au arătat că metforminul reglează în mod semnificativ nivelurile de fosforilare ale kinazei PS70S6, care este o moleculă cheie de semnalizare în aval de mTOR și un raportor al activității căii mTOR. Studiile anterioare sugerează, de asemenea, că metforminul suprimă adipogeneza prin inhibarea căii de semnalizare mTOR în fibroblastele embrionare de șoarece (MEF), celulele stem mezenchimale de șoarece C3H10T1/2 și preadipocitele 3T3-L1 [34]. Ținta mecanică a rapamicinei este compusă din două complexe, mTORCl și mTORC2, iar semnalizarea joacă un rol important în adipogeneză. S-a demonstrat că inhibarea semnalizării mTORC1 cu rapamicina afectează adipogeneza printr-o scădere a fosforilării PS6kinazei în preadipocitele 3T3-L1. Aceste studii au demonstrat, de asemenea, că inhibarea semnalizării mTOR inhibă adipogeneza prin reglarea în jos a nivelurilor de expresie ale markerilor de linie adipocitară, cum ar fi PPARgamma, CEBPI, CEBP1 și adiponectina [54-56]. Mai mult, semnalizarea mTOR este mediată de fosforilarea kinazei S6. Reducerea kinazei S6 s-a dovedit a fi rezistentă la obezitate și creșterea în greutate în timpul regimului alimentar bogat în grăsimi din cauza deteriorării adipogenezei [57]. Am confirmat observația noastră a scăderii mediate de metformină a activității mTOR ca posibil mediator al creșterii stemness și al diferențierii reduse a ASC prin utilizarea rapamicinei, care blochează în mod specific activitatea căii m TOR.

În plus față de mTOR, calea de semnalizare ERK joacă un rol crucial în proliferare și adipogeneză. Xiaomin Ning și colab., în publicația lor, susțin că adipogeneza este activată de semnalizarea ERK [58]. Deoarece am observat că metformina inhibă adipogeneza și proliferarea, am decis să investigăm efectul metforminei asupra semnalizării ERK. În concordanță cu rapoartele anterioare, rezultatele noastre au sugerat, de asemenea, că metformina ar putea inhiba adipogeneza prin suprimarea semnalizării ERK cu o creștere a expresiei genelor legate de stemness. Semnalizarea mTOR este necesară pentru proliferarea și diferențierea celulelor și este un regulator negativ al autofagiei [{{2]. }}]. Cu toate acestea, pierderea autofagiei este legată de pierderea stemness, deși tratamentul cu metformin a îmbunătățit expresia genei legate de stemness prin activarea expresiei markerului legat de autofagie, cum ar fi LC3Il. Astfel, rezultatele noastre sugerează că metforminul afectează adipogeneza prin îmbunătățirea stemness în modelele de cultură de țesut adipos uman sau ASC uman prin activarea autofagiei și inhibarea căilor de semnalizare mTOR. Viitoarele studii investigaționale in vivo pe animale și pe oameni axate pe evaluarea efectelor metforminei asupra biologiei ASC vor ghida adaptarea utilizării metforminei ca agent anti-îmbătrânire a celulelor stem.

Acest articol este extras din Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines