Metformina protejează celulele epiteliale ale cristalinului împotriva senescenței la un model de șoarece îmbătrânit natural

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

INTRODUCERE

Celulele epiteliale ale cristalinului (LEC) formează un monostrat de celule care căptușesc capsula anterioară a cristalinului și se extind până la arcul cristalinului ecuatorial [1, 2]. Construcția și funcționarea normală a LEC-urilor sunt esențiale pentru menținerea transparenței și homeostaziei metabolice a întregului cristalin[3]. Creșterea dovezilor indică faptul că senescența LEC poate provoca modificarea, denaturarea și agregarea proteinelor cristalinului, inclusiv enzime și cristaline, conducând astfel în cele din urmă la opacificarea cristalinului sau chiar la cataractă [3-5]. Cataracta legată de vârstă (ARC) rămâne principala cauză a deficienței vizuale și a orbirii, care afectează grav calitatea vieții persoanelor în vârstă [6]. În prezent, nu există strategii eficiente pentru prevenirea progresiei ARC. Prin urmare, este necesară dezvoltarea unei intervenții farmacologice care să poată îmbunătăți transparența cristalinului și să întârzie progresia ARC.

În ultimele decenii, oamenii de știință au realizat progrese remarcabile în îmbunătățirea sănătății și extinderea duratei de viață folosind mai multe intervenții genetice, dietetice și farmacologice [7]. Metformin (MET) este unul dintre agenții anti-îmbătrânire studiati pe larg. Studii substanțiale sugerează că MET poate atenua senescența și poate prelungi o durată de viață sănătoasă în diferite sisteme de modele animale. MET nu numai că poate prelungi durata de viață a Caenorhabditis elegans, ci și poate spori sănătatea și vitalitatea acesteia [8]. MET poate reduce acumularea de deteriorare a ADN-ului legată de vârstă și de stres oxidativ în celulele stem din intestinul mediu Drosophila pentru a prelungi durata de viață a acestora [9]. Studiile anterioare indică, de asemenea, că administrarea cronică de MET în doze mici îmbunătățește sănătatea și durata de viață a șoarecilor [10]. Mai mult, dovezile emergente indică faptul că atunci când pacienții cu diabet sunt tratați cu MET, aceștia manifestă beneficii de supraviețuire, chiar și în comparație cu martorii care nu au diabet [11].

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Pe lângă activitatea de promovare a duratei de viață a MET în diferite organisme model, MET vizează mai multe căi celulare de semnalizare pentru a ameliora bolile legate de vârstă. S-a demonstrat că MET modulează autofagia în principal prin activarea protein kinazei activate de adenozin monofosfat (AMP) (AMPK) și previne neurodegenerarea și neuroinflamația pentru a juca un rol neuroprotector în boala Parkinson [12]. În mod similar, MET ameliorează modificările legate de vârstă în celula endotelială sinusoidală hepatică prin AMPK și căile endoteliale ale oxidului nitric [13].cistanche dozaj redditMai mult, activarea cronică a AMPK de către MET previne cardiomiopatia prin suprareglarea autofagiei la șoarecii OVE26 cu diabet [14]. În plus, MET atenuează deteriorarea cardiovasculară asociată vârstei prin îmbunătățirea autofagiei și a restricției calorice [15]. În plus, tratamentul MET poate inhiba ateroscleroza asociată vârstei la șoarecii și iepurii ApoE-7-indusă de o dietă bogată în grăsimi, prevenind semnificativ calcificarea plăcii aterosclerotice, reducând nivelurile de proteină C-reactivă cu sensibilitate ridicată și reprimând activarea calea factorului nuclear kappa B(NF-kB) în vasele de sânge [16-18].

Pe baza acestor observații, prezentul studiu a încercat să exploreze dacă MET poate întârzia îmbătrânirea ARC și mecanismul molecular de bază. Descoperirile noastre sunt următoarele: (i) tratamentul cronic cu doze mici MET a întârziat senescența LEC la șoarecii în vârstă naturală, inhibând astfel opacitatea cristalinului; (i) calea AMPK a fost inactivată și fluxul autofagic a fost afectat în LEC senescente; (i) ) tratamentul cronic cu doze mici MET a întârziat senescența LEC la șoarecii în vârstă naturală prin activarea căii AMPK și îmbunătățirea autofagiei. Descoperirile noastre confirmă rolul anti-îmbătrânire presupus al MET și oferă suficiente dovezi că MET se poate dovedi a fi o posibilă opțiune terapeutică pentru ARC.

REZULTATE

Senescența LEC a fost asociată cu ARC la șoarecii în vârstă naturală

Mai multe mecanisme potențiale ale ARC, inclusiv efectul îmbătrânirii, au fost investigate pe larg.beneficii extract de cistanche,Cu toate acestea, asocierea dintre senescența LEC și ARC in vivo rămâne neclară. Am emis ipoteza că senescența LEC-urilor poate duce la ARC in vivo. Prin urmare, am construit un model de șoarece al ARC. Rezultatele noastre au arătat că transparența lentilei la șoarecii în vârstă natural (șoareci mai în vârstă) a fost semnificativ scăzută în comparație cu cea din grupul de control (șoareci tineri) (Fig.1a). După cum se arată în Fig.1b, incidența cataractei în grupul de vârstă naturală a fost de 95,23%. Testul de colorare H&E a indicat că LEC-urile din grupul de control aveau formă rotundă și aranjate în mod regulat, iar densitatea LEC-urilor normale a fost relativ mare, în timp ce LEC-urile șoarecilor în vârstă naturală aveau formă plană și aranjate inegal, iar densitatea de LEC-urile senescente au fost semnificativ scăzute (Fig.1c). În plus, colorarea SA- -Gal a arătat că raportul dintre LEC senescente a fost crescut la șoarecii în vârstă naturală (Fig. 1d). În plus, am analizat expresia proteinei markerilor asociați senescenței prin colorarea IHC și analiza Western blot. Colorarea IHC a dezvăluit că expresia p21 și p53 a fost crescută în LEC-urile șoarecilor în vârstă naturală în comparație cu șoarecii tineri (Fig. 1e, f). În mod similar, am descoperit în continuare că expresia proteinei p21 și p53 a fost mai mare în capsulele cristalinului șoarecilor în vârstă naturală decât în ​​capsulele cristalinului șoarecilor tineri (Fig. 1g). Aceste rezultate au sugerat că senescența LEC a fost asociată cu ARC la șoarecii în vârstă naturală.

Cistanche poate anti-imbatranire

Administrarea cronică de MET în doză mică a îmbunătățit transparența cristalinului și a atenuat senescența LEC Înainte de a testa efectul metforminei asupra ARC, am determinat dacă administrarea cronică de MET în doză mică este sigură pentru șoareci. După tratamentul MET timp de 10 luni, 28 de șoareci (18 în grupul în vârstă naturală și 10 în grupul MET) au murit din cauze naturale. Am descoperit că șoarecii vii din ambele grupuri au fost sănătoși și nu a existat nicio diferență semnificativă în greutatea corporală și greutatea organelor între ambele grupuri (Tabelul 1). Prin urmare, aceste rezultate au indicat că doza de metformină utilizată în studiu a fost sigură pentru animale și ar putea fi utilizată pentru experimentele ulterioare.

Ulterior, MET în doză scăzută cronică a fost administrată pentru a evalua dacă MET ar putea inhiba opacitatea cristalinului și ameliora senescența legată de vârstă a LEC-urilor la șoarecii îmbătrâniți în mod natural. După cum era de așteptat, transparența lentilei în grupul MET a fost mult îmbunătățită în comparație cu transparența lentilei în grupul în vârstă natural (Fig.2a). În plus, observațiile morfologice au confirmat că lentila grupului MET a arătat o reducere a opacității. Incidența cataractei în grupul în vârstă naturală a fost de 95,23%, în timp ce cea din grupul MET a fost de 19,00 la sută (Fig.2b). Testul de colorare H&E a arătat că densitatea LEC-urilor în grupul MET a fost considerabil mai mare. decât la șoarecii în vârstă naturală (Fig. 2c). Mai mult, LEC-urile grupului MET aveau o formă relativ rotundă în comparație cu cele ale grupului în vârstă natural (Fig.2c). Colorația SA- -Gal a arătat că raportul LEC senescente a scăzut semnificativ în grupul MET în comparație cu cel din grupul în vârstă natural (Fig.2d). Analiza IHC a arătat că expresia p21 și p53 a fost mai scăzută în LEC-urile grupului MET decât în ​​grupul în vârstă natural (Fig. 2e, f). În mod similar, analiza Western blot a arătat că expresia proteinei p21 și p53 a fost remarcabil scăzută în capsulele lentilelor grupului MET în comparație cu cele ale grupului în vârstă natural (Fig.2g). Aceste rezultate au indicat că administrarea cronică de MET în doze mici ar putea îmbunătăți transparența lentilei și ar putea atenua senescența LEC-urilor.

Administrarea cronică de MET în doze mici a atenuat senescența LEC-urilor la șoarecii îmbătrâniți în mod natural prin activarea AMPK. O cantitate copleșitoare de date susține concluzia că activarea AMPK este suficientă pentru a prelungi durata de viață în organismele model, crescând atractivitatea acestuia ca țintă de longevitate [19,20] . Având în vedere această teorie, am evaluat expresia căii AMPK în LEC-urile șoarecilor. Nivelul relativ de ARNm FAS a fost redus în grupul în vârstă natural și a crescut în grupul MET (Fig. 3a). După cum se arată în Fig. 3b, c, expresia AMPKa fosforilat (Thr172) și ACC fosforilat (Ser79) a fost redusă în LEC-urile șoarecilor în vârstă naturală în comparație cu cele ale șoarecilor tineri. Cu toate acestea, expresia AMPKa fosforilată (Thr172) și ACC fosforilat (Ser79) a fost crescută în LEC-urile grupului MET în comparație cu cele ale grupului în vârstă natural. În plus, analiza Western blot a arătat că expresia proteinei AMPKa fosforilat (Thr172) și ACC fosforilat (Ser79) a fost semnificativ redusă în capsulele cristalinului persoanelor în vârstă naturală, iar nivelurile de exprimare a proteinei ale AMPKa fosforilat (Thr172) și ACC fosforilat ( Ser79) au fost crescute în capsulele lentilelor din grupul MET (Fig.3d). Aceste date au arătat că calea AMPK a fost inactivată în LEC-urile șoarecilor în vârstă naturală. În plus, administrarea cronică de MET în doze mici a atenuat senescența LEC-urilor la șoarecii în vârstă naturală prin activarea AMPK.

Administrarea cronică de MET în doze mici a restabilit fluxul autofagic pentru a atenua senescența LEC la șoarecii în vârstă naturală. Studiile anterioare au indicat că autofagia poate juca un rol important în combaterea efectelor adverse ale îmbătrânirii [21,22]. Pentru a analiza în continuare modificările moleculare și celulare ale cristalinului după tratamentul MET, am determinat expresia LC3 și p62 deoarece sunt acceptați pe scară largă ca biomarkeri ai nivelurilor de autofagie. După cum s-a demonstrat în Fig. 4a, nivelul relativ de expresie a ARNm p62 a fost crescut semnificativ în grupul în vârstă naturală în comparație cu cel al grupului de control; cu toate acestea, nivelul relativ de exprimare a ARNm al p62 a fost substanțial scăzut în grupul MET în comparație cu cel din grupul în vârstă natural.cistanche genghis khanÎn plus, colorarea IHC a arătat că nivelurile de proteină asociată cu microtubuli 1 lanț ușor 3 (LC3-II/l) și p62 au fost crescute în LEC-urile șoarecilor în vârstă naturală. În plus, rezultatele noastre au ilustrat că nivelurile de LC3-II/l și p62 au fost remarcabil scăzute în LEC-urile grupului MET (Fig. 4b, c). Nivelurile de proteine ​​ale LC3-ll și p62 au fost semnificativ crescute în capsulele cristalinului din grupul în vârstă natural (Fig.4d). În total, am speculat că fluxul autofagic a fost afectat în LEC-urile șoarecilor în vârstă naturală și ar putea fi restabilit prin administrarea cronică de MET în doze mici pentru a atenua senescența LEC-urilor la șoarecii în vârstă naturală.

DISCUŢIE

Cataracta netratată este o cauză principală de orbire la nivel mondial, care se caracterizează prin opacificarea cristalinului [23]. Studiile epidemiologice au arătat că vârsta este factorul de risc dominant pentru cataractă, cunoscut sub numele de ARC, iar singurul tratament este îndepărtarea chirurgicală [24]. Studiile anterioare au arătat că senescența LEC este principala cauză a ARC [25]. Până în prezent, nu au existat agenți terapeutici eficienți care să inhibe opacitatea cristalinului și să atenueze senescența LEC fără efecte secundare nedorite. Obiectivul prezentului studiu a fost evaluarea bazei biologice moleculare pentru senescența LEC-urilor și mecanismul de protecție a LEC-urilor normale împotriva senescenței. Rezultatele noastre au arătat că inactivarea AMPK și afectarea autofagiei au fost asociate cu senescența LEC și ARC. În plus, am descoperit că MET ar putea proteja LEC-urile împotriva senescenței și ar putea inhiba opacitatea lentilei prin activarea AMPK și îmbunătățirea autofagiei.

Senescența este un proces biologic fundamental însoțit de o scădere generală a funcției tisulare. Pe măsură ce durata de viață crește, disfuncțiile legate de vârstă, cum ar fi ARC, devin o sănătate gravă

probleme [26]. Senescența LEC a fost raportată a fi implicată în apariția și dezvoltarea ARC [5]. Rezultatele noastre au arătat că LEC-urile șoarecilor îmbătrâniți în mod natural aveau formă plană și dispuse inegal, iar densitatea LEC-urilor a scăzut semnificativ (Fig. 1c, d). În plus, expresia genelor asociate îmbătrânirii (p21 și p53) a fost reglată în sus în LEC-urile șoarecilor îmbătrâniți în mod natural (Fig. 1e, f, g). Rezultatele noastre au implicat că senescența LEC a fost asociată cu apariția și dezvoltarea ARC. Prin urmare, o înțelegere precisă a mecanismelor moleculare care stau la baza senescenței LEC-urilor poate fi necesară pentru a oferi o justificare pentru noile strategii de tratament.

MET este cel mai prescris medicament hipoglicemic oral pentru diabetul de tip 2 la nivel mondial. Dovezile emergente indică faptul că MET are efecte benefice asupra sănătății dincolo de cele asociate cu ameliorarea glicemiei [27]. S-a confirmat că mecanismele MET sunt importante pentru țintirea căilor fundamentale în îmbătrânirea biologică, cum ar fi activarea AMPK, creșterea autofagiei, inhibarea inflamației și exercitarea efectelor antioxidante [28]. La oameni, MET a fost utilizat în practica clinică de mai bine de 60 de ani; are un profil ridicat de siguranță și este poziționat în mod unic pentru a interveni în mai multe căi cruciale responsabile de îmbătrânire și boli legate de vârstă. Cu toate acestea, efectele MET asupra ARC și mecanismul de reglementare al acestor efecte nu au fost niciodată raportate. În consecință, în studiul nostru, administrarea cronică de MET în doze mici la șoarecii în vârstă natural a îmbunătățit transparența lentilei (Fig. 2a) și a atenuat senescența LEC-urilor in vivo (Fig. 2).

Este larg recunoscut că MET activează calea AMPK, care este mecanismul potențial al MET de a exercita un efect anti-îmbătrânire [29]. AMPK, un senzor de energie celulară, joacă un rol crucial în reglarea echilibrului energetic celular [30]. Mai multe studii au ilustrat că AMPK servește ca un integrator și mediator al mai multor căi și procese care asociază energia cu longevitatea. În studiul nostru, am constatat că inactivarea AMPK a fost o caracteristică a LEC-urilor senescente la șoarecii în vârstă naturală (Fig.3). Ulterior, s-a demonstrat că MET stimulează calea AMPK pentru a preveni senescența LEC-urilor (Fig.3). Ca un activator AMPK consacrat, rolul MET în prevenirea îmbătrânirii este în general atribuit efectelor sale asupra modulării căilor de semnalizare din aval, cum ar fi restaurarea autofagiei, activarea Sirt1 și Foxo1 și suprimarea mTOR [31,32]. Studiul nostru a oferit o nouă linie de dovezi care subliniază importanța funcției AMPK activată de MET în prevenirea apariției ARC.

După cum sa menționat mai sus, AMPK comunică cu numeroase căi și proteine ​​pentru a exercita un efect anti-senescență, inclusiv creșterea autofagiei. Autofagia, care a apărut ca un proces de bază pentru asigurarea longevității, a atras un interes larg răspândit ca o potențială țintă terapeutică pentru bolile legate de vârstă. Autofagia este un proces biologic complex fluid, în mai multe etape. Procesul complet de autofagie se numește flux autofagic, care este utilizat pe scară largă pentru a reflecta nivelul autofagiei. Ca indicator al autofagiei, LC3-Il este strâns legat de membrana autofagozomală care este degradată de enzimele lizozomale.prelungirea vieții cistancheÎn mod similar, p62, un substrat specific autofagiei, este de obicei degradat în autofagolizozom, iar expresia sa reflectă indirect nivelul de autofagie. În studiul de față, constatările noastre au implicat că nivelul de autofagie a scăzut în mod distinct în LEC senescente (Fig. 4), în timp ce MET a inversat afectarea autofagiei legată de vârstă (Fig. 4). Mecanismul molecular anti-îmbătrânire al MET este atribuit funcției primare a AMPK în celule, deoarece în general îmbunătățește autofagia prin activarea AMPK [33]. Mai mult, s-a demonstrat că MET crește direct autofagia, contribuind astfel la prevenirea senescenței [34]. Cu toate acestea, sunt necesare studii mai detaliate pentru a elucida mecanismele care stau la baza, care demonstrează că MET mărește autofagia printr-o cale AMPK independentă sau dependentă.

S-a demonstrat că prevalența ARC nu a fost asociată cu sexul în populațiile de origine asiatică [35, 36]. Prin urmare, nu am considerat sexul ca un factor care poate afecta ARC. Studiul nostru ar trebui interpretat ținând cont de limitările menționate mai sus.

CONCLUZIE

În rezumat, am demonstrat că inactivarea căii AMPK și afectarea autofagiei legate de vârstă ar putea contribui la senescența LEC și la apariția ARC. În plus, datele din experimentele noastre au arătat că MET a întârziat efectiv senescența LEC-urilor și formarea ARC prin activarea căii AMPK și creșterea autofagiei. Descoperirile noastre sunt o linie de bază pentru investigarea ulterioară a mecanismelor moleculare care sunt utile în rolul MET în timpul procesului de îmbătrânire a ARC și vor fi informative pentru studii mai intense privind dezvoltarea de noi strategii împotriva apariției și dezvoltării ARC.

MATERIALE ȘI METODE Reactivi

MET a fost achiziționat de la Bristol-Myers Squibb Company(China). Anticorpi împotriva p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -actin (ab822) fosforilat și SQSTM1/p62 (3340-1) au fost obținute de la Abcam (MA, SUA). Anticorpii împotriva LC3 (12741) și fosfo-acetil CoA carboxilază (p-ACC) (Ser79) (3661) au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology ( MA, SUA).

Animale și tratament

Șoarecii masculi C57BL6J care aveau 3 și 8 luni au fost achiziționați de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Șoarecii au fost găzduiți în condiții de temperatură controlată (temperatură, 20-25 grade și umiditate relativă, 55±15 la sută) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, cu acces liber la hrană și apă. Toate procedurile și protocoalele efectuate pe animale au fost aprobate de comitetul de etică al Universității Medicale din Harbin.

Șoarecii au fost împărțiți în următoarele trei grupuri: (i) grup de control având șoareci tineri (3 luni, greutate corporală=29,72± 1,66 g, n =40) au primit o dietă standard purificată pentru șoareci și apă ad libitum; Când șoarecii aveau 10 lună, 120 de șoareci au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri: grupul în vârstă naturală și grupul MET. (i) grupul de vârstă naturală (șoareci mai în vârstă, 20 de luni, greutate corporală=32,98±1,93g, n{=60) a primit o dietă standard purificată pentru șoareci și apă ad libitum; (ii) grupul MET ( 20 de luni, greutatea corporală=31.21±2,81 g,n{=60) a fost menținută pe o dietă standard purificată pentru șoareci și apă până când șoarecii au atins vârsta de 10 luni; după care s-au început tratamentele. Șoarecii din grupul MET au fost hrăniți cu o dietă suplimentată cu 0,1% MET (Bristol Myers Squibb, China) și apă liberă timp de 10 luni.

izolarea lentilelor și a capsulelor lentilelor

Șoarecii au fost eutanasiați prin luxație cervicală. Întregul ochi a fost excizat imediat de la toate animalele de experiment și plasat în soluție salină sterilă. Nervul optic a fost așezat în sus și fixat cu o pensetă. Apoi a fost făcută o incizie pe nervul optic care intră în ochi, iar sclera a fost trasă înapoi pentru a expune cristalinul.cistanche nzUlterior, am folosit o pensetă pentru a îndepărta ușor fragmentele de corp ciliar atașate de planul ecuatorial al cristalinului. Fotografiile lentilei proaspete au fost făcute imediat, iar lentila a fost fixată rapid cu 4% paraformaldehidă la temperatura camerei. Capsulele întregii lentile au fost dezlipite rapid din lentila rămasă, congelate rapid în azot lichid și depozitate la 80 de grade C pentru experimentele ulterioare.

Hematoxilină și eozină (H&E)

Lentila proaspătă a fost fixată imediat cu paraformaldehidă 4% la temperatura camerei și încorporată în parafină. Pentru examinarea histologică, țesuturile au fost tăiate în felii de 4-μm. După deparafinizare și rehidratare, secțiunile de parafină preparate au fost colorate cu soluție de hematoxilină (H) timp de 8 minute, urmate de 5 scufundări în etanol acid 1% (1% HCI în etanol 70%).

și clătirea cu apă distilată. Ulterior, secțiunile au fost colorate cu soluție de eozină (E) timp de 3 minute, urmate de deshidratare cu alcool gradat și curățare cu xilen. Modificările morfologice au fost observate la microscop (Nikon, Eclipse, Japonia).

Testul -galactozidazei asociate senescenței (SA- -Gal) Activitatea -galactozidazei (SA{- -Gal) asociată senescenței a fost măsurată utilizând un kit de colorare cu SA{- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Conform instrucțiunilor producătorului, secțiunile de țesut, după o serie de tratamente, au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 5 minute (de trei ori) și apoi incubate în soluție de colorare SA- -gal (pH 6,0) la 37 de grade fără CO2 timp de 24 de ore. Imaginile au fost surprinse la microscop cu lumină (Nikon, Eclipse, Japonia). Procentul de celule SA- -gal pozitive a fost estimat ca numărul mediu de celule pozitive/numărul mediu de celule totale.

Reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (gRT-PCR) ARN total din capsulele cristalinului de șoareci a fost extras folosind reactivul TRlzol. Transcripția inversă a fost efectuată cu ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). Analiza cantitativă de transcripție inversă-reacția în lanț a polimerazei (qRT-PCR) a fost efectuată utilizând un SYBR Green Supermix

kit (Takara, Tokyo, Japonia), cu -actina ca control endogen. Transcripțiile au fost investigate pentru mai multe gene țintă, inclusiv FAS (înainte, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'și invers, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (înainte, 5'-GCGGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} și invers, 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') și -actină (înainte, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'și invers, 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Relativul nivelurile expresiei fiecărei gene au fost

metodă. normalizat la -actină și calculat folosind colorarea 2-△△ct r imunohistochimică (IHC) Un total de 5 secțiuni reprezentative din fiecare dintre cele 10 lentile selectate per grup au fost utilizate pentru analiza imunohistochimică (IHC) pentru a evalua expresia p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 și p62. După ce probele preparate au fost incubate la 60 grade timp de 2 ore, au fost trecute prin xilen și alcool gradat în serie pentru deparafinizare. Ulterior, probele au fost fierte în 0,1 M de acid citric (pH 6,1) timp de 30 de minute și răcite la temperatura camerei. După spălare de trei ori cu PBS, probele au fost înmuiate cu 0,3% H O, pentru a inhiba activitatea peroxidazei endogene. Ulterior, anticorpii primari au fost adăugați și răciți la 4 grade C, peste noapte. Anticorpii secundari corespunzători au fost incubați timp de 1 oră la 37 grade C. După spălarea cu PBS, probele au fost incubate în diaminobenzidină (DAB) până la dezvoltarea intensității colorate dorite. Imaginile celulelor imunocolorate au fost capturate folosind microscopul Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japonia).

Analiza Western blot

Proteina totală din capsulele cristalinului de șoareci a fost extrasă utilizând tampon de testare radio-imunoprecipitare (RIPA) cu cocktail inhibitor de protează (Pierce, SUA) și a fost folosit un kit de acid bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, SUA) pentru a cuantifica concentrația de proteine. . Proteina totală (40 ug) a fost analizată utilizând electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și transferată electroforetic pe membrane cu filtru de poliviniliden difluorură (PVDF) (Millipore, Germania). Membranele au fost incubate peste noapte cu un anticorp primar la 4 grade C. A doua zi, membranele au fost incubate cu anticorpi secundari corespunzători timp de 1 oră la 37 grade C. Benzile imunoreactive au fost vizualizate folosind metoda substratului chemiluminescent cu un Super Signal West Pico kit (Pierce Biotechnology, SUA). Au fost efectuate trei experimente independente.

analize statistice

Datele au fost exprimate ca medie ± abatere standard (SD). Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul GraphPad Prism 7.0 și Microsoft Excel. Proteina a fost cuantificată folosind software-ul Image J. Testul t Student și analiza varianței (ANOVA) au fost utilizate pentru a calcula semnificația statistică a datelor experimentale. Diferențele cu o valoare P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DISPONIBILITATEA DATELOR

Seturile de date utilizate și analizate în timpul studiului curent sunt incluse în acest articol publicat.

Acest articol este extras de pe www.nature.com/cddiscovery