Proteinele mitocondriale dezvăluie mecanismul prin care exercițiul fizic îmbunătățește memoria, învățarea și activitatea motrică în modelul de șobolan cu encefalopatie ischemică hipoxică Partea 3
Apr 07, 2024
4. Materiale și Metode
4.1. Animale și grupuri experimentale
Pentru acest studiu au fost utilizați treizeci și șase de șobolani Sprague-Dawley. Animalele au fost menținute la 22 ± 1◦C cu cicluri lumină/întuneric de 12 ore și au avut acces liber la hrană și apă. Procedurile experimentale au fost efectuate cu aprobarea Comitetului Instituțional Etic pentru Îngrijirea și Cercetarea Animalelor de la Universitatea Zhengzhou.
Ciclul întuneric se referă la perioada în care oamenii dorm noaptea și este strâns legat de memorie. Pentru majoritatea oamenilor, un somn bun de noapte îmbunătățește sănătatea fizică și funcția creierului. În același timp, somnul este legat și de procesul de memorie al creierului.
Când dormim, corpul nostru intră în diferite etape de somn, inclusiv somnul cu mișcarea rapidă a ochilor (REM) și somnul fără mișcări oculare rapide (NREM). Aceste etape joacă un rol important în reglarea integrării informaționale a creierului și în consolidarea memoriei.
Majoritatea oamenilor experimentează efectele pozitive ale somnului asupra concentrării și memoriei. Cercetările arată că somnul ne poate ajuta să ne consolidăm și să ne întărim amintirile și chiar să ne îmbunătățim capacitatea de a învăța. În timpul somnului, creierul integrează informații noi cu cunoștințele existente, sporind astfel capacitatea de a stoca și utiliza memoria.
În schimb, lipsa unui somn adecvat poate duce la pierderea memoriei și la dificultăți de învățare. Insomnia pe termen lung poate cauza o varietate de probleme în organism și creier, afectând viața de zi cu zi și funcționalitatea. Prin urmare, o strategie corectă de somn și un stil de viață rezonabil sunt cruciale pentru menținerea unei bune memorie.
În general, există o legătură între ciclurile întunecate și memorie. Somnul adecvat poate promova integrarea informațiilor din creier și consolidarea memoriei, în timp ce tulburările de somn pe termen lung pot afecta funcția și memoria creierului. Prin urmare, ar trebui să acordăm atenție calității somnului în viața noastră de zi cu zi și să menținem un stil de viață sănătos, pentru a ne susține și a îmbunătăți în mod eficient memoria și abilitățile de învățare. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria, deoarece Cistanche deserticola poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelului de acetilcolină și a factorilor de creștere. Aceste substanțe sunt foarte importante pentru memorie și învățare. În plus, Cistanche deserticola poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul primește suficiente nutrienți și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.
Faceți clic pe cunoaște 10 moduri de a îmbunătăți memoria
S-au făcut toate eforturile pentru a reduce numărul de animale și a minimiza suferința animalelor în timpul experimentelor. Animalele au fost împărțite aleatoriu în patru grupuri (Figura 8). (1) HIE, NT (grup de hipoxie-ischemiaencefalopatie fără antrenament) a constat din animale care au fost modelate pentru encefalopatie hipoxic-ischemică în ziua 7 postnatală prin anesteziarea puilor cu izofluran (5% inducție, 1,5% întreținere).
Artera carotidă comună stângă a fost apoi ligată permanent, iar puii au fost puși pe o canapea de recuperare caldă timp de 30 de minute înainte de a fi transferați într-o cameră hipoxică cu un flux continuu de amestec de gaz hipoxic de 92% N2 și 8% O2 timp de 90 de minute și apoi s-au întors în cuști până în săptămâna a 10-a fără a-i supune exercițiilor de înot. (2) HIE, T (grup de encefalopatie hipoxie-ischemie cu antrenament) a fost format din animale care au fost modelate pentru encefalopatia hipoxico-ischemică ca în (1) și s-au întors în cuști până în a 6-a săptămână de viață și apoi au fost supuse la 90 de minute de viață. exerciții de înot zilnic timp de cinci zile cu 2 zile de odihnă pe săptămână timp de 4 săptămâni, (3) SHAM, NT (grupul de control) au inclus animale care nu au fost supuse niciunui tratament, dar au trăit o viață normală în cuști din ziua 1 postnatală până în a 10-a săptămână fără antrenament cu exerciții și (4) SHAM, T a constat din animale care nu au fost supuse niciunui tratament, dar au trăit o viață normală în cuști din ziua postnatală 1 până la 6 săptămâni, după care au fost supuse exercițiilor de înot timp de 4 săptămâni.
Creierele animalelor din diferitele grupuri au fost apoi recoltate și pregătite pentru western blot (hipocamp și cortex cerebral) și imunofluorescență (cortex motor).
4.2. Paradigma exercițiului
Animalele au fost adăpostite cu hrană și apă ad libitum și menținute într-un ciclu de 12-lumină/întuneric. Au fost împărțiți în două grupe: animale sedentare (HIE, NT și SHAM, NT) și animale care exercită (HIE, T și SHAM, T). Animalele care făceau exerciții au fost supuse antrenamentului de înot după săptămâna 6 postnatală timp de 4 săptămâni; au fost supuși exercițiilor de înot timp de 5 zile pe săptămână cu 2 zile de odihnă. Fiecare sesiune de înot a durat 90 de minute. Bazinul a fost umplut la o adâncime de 50 cm pentru a împiedica animalele să atingă fundul rezervorului.
Animalele au fost lăsate să înoate liber, fără nicio încărcare suplimentară, și au fost ușor stimulate în timpul înotului. Sobolanii au fost uscați cu grijă după exercițiu și înapoiați în cuști.
4.3. Vertica! Testul motorului stâlpului
Animalele din fiecare grup au fost așezate unul câte unul cu fața în sus pe un stâlp acoperit cu bandă de pânză (3,0 cm diametru și 150 cm lungime), care a fost ținut în poziție orizontală, apoi a fost ridicat treptat până la un poziția verticală, iar timpul a stat șobolanul pe stâlp a fost înregistrat pentru maximum 2 minute (120 s). În acest test, animalul cu deficit de coordonare motorie și echilibru cade de pe stâlp.
4.4. Testul Morris Water Maze (MWM)
Șobolanii (în vârstă de 10 săptămâni) au fost supuși MWM după un protocol de antrenament de 4 săptămâni (SHAM, 'T și HlE, T). Toate datele labirintului de apă au fost înregistrate folosind sistemul de urmărire video Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, China). MWM a fost utilizat așa cum este descris de l32]. Pe scurt, șobolanii au folosit repere vizuale plasate pe marginile unei piscine pentru a ajunge la o platformă ascunsă și a scăpa din apă. Învățarea a fost evaluată pe parcursul a 7 zile. Înainte de evaluarea învățării, șobolanii au fost introduși în piscina care conținea apă limpede și o platformă vizibilă. În timpul antrenamentului, șobolanilor li s-au oferit exerciții de înot pentru a se familiariza cu sarcina.
În timpul fazei de învățare, șobolanii au fost mânjiți cu colorant negru pentru urmărire video ușoară, iar platforma a fost scufundată. Fiecare șobolan a fost supus la patru încercări din puncte de plecare diferite (cadrante). Latența sau timpul necesar pentru a ajunge la platformă a fost înregistrat în fiecare zi de către Panlab SMART Video Tracking System. În ultima zi a experimentului, platforma a fost îndepărtată și fiecare șobolan a fost reintrodus în apă de câte ori au traversat animalele locul platformei ascunse în cadranul care conținea anterior platforma (cadrantul țintă).
4.5. Western Blotting
Șase șobolani au fost selectați aleatoriu din fiecare grup pentru experimentul la nivel de proteine. Proteinele au fost extrase din hipocamp și cortex și omogenizate în reactivul RIPA (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, SUA) și separate în proteine citoplasmice și nucleare. Concentrațiile de proteine au fost determinate folosind testul de acid bicinchoninic (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, SUA) și un total de 20 g de proteină au fost separate prin electroforeză pe geluri SDS-PAGE universale (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, China.
Proteinele au fost apoi transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden, (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, SUA) Membranele au fost blocate timp de 2 ore cu 5% albumină serică bovină (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Beijing, China) la temperatura camerei și incubați cu următorii anticorpi primari de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA): AIF (D39D2, 1:1000), citocrom C (136F3, 1:1000), caspază scindată{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) și OPA1 (D7C1A, 1:1000).
GAPDH de la Servicebio, Wuhan, China (GB11002, 1:2000) și H3 de la Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) la 4 ◦C peste noapte, urmat de anticorpi secundari conjugați cu HRP00001-2 de la Proteintect (1:5000) incubare timp de 2 ore la temperatura camerei. Benzile de proteine au fost vizualizate cu un kit de chemiluminiscență îmbunătățit #KF005 de la Affinity Biosciences și imagini cu sistemul de analiză Bio-Imagine (Universitatea Zhengzhou, Zhengzhou, China). Raporturile dintre intensitățile benzilor de proteine la GAPDH (proteine citoplasmice) și H3 (proteine nucleare) ca referințe interne au fost determinate folosind ImageJ.
4.6. Imunofluorescență
Sețile coronale de {{0}}µm de țesut cerebral au fost obținute folosind un microtom de congelare (Leica, Germania) pentru imunofluorescență. Lamele au fost blocate timp de 2 ore cu PBS cu 10% ser fetal bovin, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Beijing, China) și 0,3% Triton ×-100,Amresco 0694, Biosharp, Estonia la temperatura camerei și apoi incubat cu anticorpi primari de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA): anti-AIF, D39D2 (diluție de 1:400), anti-Citocrom C, 136F3 (diluție de 1:200), caspază anti-clivată-3 , Asp175 (diluție de 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (diluție de 1:200) și anti-OPA1, D7C1A (diluție de 1:400) peste noapte la 4 °C.
Apoi, lamelele au fost spălate de 3 ori fiecare cu durata de 10 minute în PBS și apoi incubate cu anticorpi secundari (ab150077 de la Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, Marea Britanie) timp de 2 ore la temperatura camerei în întuneric.DAPI,#C0065 de la Solarbio Life Sciences, Beijing, China (1:100PBS) s-a adăugat timp de 5 minute și s-a turnat, s-a spălat în PBS de 3 ori fiecare timp de 5 minute, s-a uscat, s-a adăugat agentul anti-stingere (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China), sticlă lamelele au fost fixate pe lame, iar probele au fost depozitate la -20 ◦C timp de 2 ore și luate pentru imagistica microscopică. Imaginile de țesut au fost capturate folosind un microscop cu fluorescență confocal (Ni-U942877, Nikon, Tokyo, Japonia), iar imaginile reprezentând proteinele din cortexul motor au fost apoi cuantificate folosind FIJI-ImageJ așa cum este descris în [33].
4.7. Analize statistice
GraphPad Prism versiunea 8.0.0 pentru Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA) a fost folosită pentru toate analizele. ANOVA unidirecțională urmată de testele post-hoc ale lui Dunnett, respectiv, au fost utilizate pentru a măsura semnificația statistică. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM, iar p < 0.05 a fost considerat semnificativ statistic.
5. Concluzii
Acest studiu demonstrează că exercițiul de înot a ameliorat activitatea motorie, memoria și învățarea asociate cu HIE prin suprimarea apoptozei mitocondriale prin intermediul căilor de semnalizare Cyto.C/cleaved caspaze-3 și AIF. În plus, s-a demonstrat că intervenția exercițiului de înot stabilizează cresta mitocondrială și potențialul membranei, așa cum este descris prin inversarea Smac/Diablo și OPA1 la șobolani cu HIE. Ca rezultat, aceasta este o bază atractivă și viabilă pentru cercetări suplimentare pentru a descifra mai multe căi moleculare care ar putea fi manipulate pentru a gestiona eficient HIE și deficitele rezultate. În timp ce acest studiu a demonstrat cu succes rolul exercițiului în inversarea deficitelor structurale și funcționale din mitocondrii cauzate. de către HIE, nu a epuizat toate metodele posibile de stabilire a modului în care sunt stabilizate crestele mitocondriale; acest lucru este critic pentru cercetările viitoare pe acest subiect.
Contribuții ale autorului: Conceptualizare, FG, FP, YW și CC; curatarea datelor, FG, FP, YW, HL și JF; analiza formală, FG, HL și CC; achiziție de finanțare, CC; investigație, FG,FP, YW, HL și JF; metodologie, FG, FP, YW și CC; administrarea proiectelor, FG, YW și CC; resurse, CC; software, FG, FP, JF și CC; supraveghere, CC; validare, FG, FP, YW, HL și CC; vizualizare, FG, FP, YW, HL și JF; scriere – schiță originală, FG și YW; scriere – revizuire și editare FG și HL Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.
Finanțare: Acest studiu este susținut de Proiectul de cercetare științifică și tehnologică al Departamentului Provincial de Știință și Tehnologie Henan (grant nr. 212102310217) și un grant de la Fondurile Fundației Naționale pentru Științe Naturale din China (grant nr. 81401015).
Declarația Comitetului de revizuire instituțională: Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului pentru îngrijirea animalelor de cercetare a Universității Zhengzhou; ZZUIRB2022-32.
Declarație de consimțământ informat: Nu se aplică.
Declarație de disponibilitate a datelor: Nu se aplică.
Conflicte de interese: Autorii nu declară niciun conflict de interese.
Referințe
1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Interacțiunile creierului-imun în leziunea cerebrală hipoxică-ischemică perinatală. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]
2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Encefalopatie hipoxică-ischemică: o revizuire pentru clinician. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]
3. Negru, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al. Cauzele globale, regionale și naționale ale mortalității infantile în 2008: O analiză sistematică. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]
4. Juul, SE; Ferriero, DM Strategii farmacologice neuroprotective în leziunile cerebrale neonatale. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]
5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Rolul factorului de inducere a apoptozei în leziunile cerebrale hipoxice-ischemice perinatale. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]
6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Exercițiul Cho, YS pe banda de alergare și exercițiul cu roți îmbunătățesc funcția motrică prin suprimarea morții celulelor neuronale apoptotice la șobolanii cu inflamație a creierului. J. Exercic. Reabilitare. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]
7. Kelly, M.; Darrah, J. Exerciții acvatice pentru copii cu paralizie cerebrală. Dev. Med. Copil. Neurol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]
8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Lactat și BDNF: mediatori cheie ai neuroplasticității induse de efort? J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]
9. Intlekofer, KA; Cotman, CW Exercițiul contracarează scăderea funcției hipocampului în îmbătrânire și boala Alzheimer. Neurobiol.Dis. 2013; in presa. [CrossRef]
10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. Blocarea receptorilor BDNF împiedică efectele benefice ale exercițiului la un model de șobolan al bolii Parkinson. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
