Mortalină/proteina reglată cu glucoză 75 promovează rezistența la cisplatină a cancerului gastric

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract

Tratamentul cu medicamente cu platină este una dintre cele mai predominante strategii chimioterapeutice pentru pacienții cu cancer gastric (GC). Cu toate acestea, efectul terapeutic este mai puțin decât satisfăcător, în mare parte datorită rezistenței dobândite la medicamentele cu platină. Prin urmare, o mai bună înțelegere a mecanismelor de bază poate îmbunătăți considerabil eficacitatea terapeutică a GC. În acest studiu, ne-am propus să investigăm funcțiile/mecanismele legate de chimiorezistență și semnificația clinică a proteinei reglate cu glucoză 75 (GRP75) în GC. Aici, datele noastre au arătat că, în comparație cu celulele SGC7901, expresia GRP75 a fost semnificativ mai mare în rezistența la cisplatină (celule (SGC7901 *). Deteriorarea GRP75 a abolit menținerea potențialului membranei mitocondriale (MP) și a inhibat factorul nuclear eritroid{{ 10}}factorul 2 înrudit (NRF2), fosfatidilinozitol 3 kinaza/protein kinaza B (Pl3K/AKT), factorul 1a inductibil de hipoxie (HIF-1a) și c-myc, care au dus la blocarea activării țintele lor din aval. Aceste procese au atenuat abilitățile de anti-oxidare/apoptoză și au alterat reprogramarea metabolică în celulele SGC7901 ", ducând la resensibilizarea acestor celule la cisplatină. Cu toate acestea, supraexprimarea GRP75 în celulele SGC7901 a provocat efectele opuse. Un model de xenogrefe a confirmat rezultatele menționate mai sus.La pacienții cu GC cărora li s-a administrat chimioterapie cu platină și o meta-analiză, un nivel ridicat de GRP75 a fost asociat pozitiv cu caracteristici agresive și prognostic prost, incluzând, dar fără a se limita la gastr. cancere intestinale și a fost un predictor independent pentru supraviețuirea globală. În mod colectiv, studiul nostru a indicat că GRP75 a fost implicat în rezistența la cisplatină a GC și că GRP75 ar putea fi o potențială țintă terapeutică pentru restabilirea răspunsului la medicamente în celulele cu rezistență la platină și un instrument de prognostic aditiv util în ghidarea managementului clinic al pacienților cu GC.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

Introducere

Cancerul gastric (GC) a fost prima incidență și a doua mortalitate a cancerelor sistemului digestiv în China. Tratamentele actuale pentru GC avansat au fost operația chirurgicală combinată cu chimioterapie sistemică, dar rata de supraviețuire pe termen lung a fost mai puțin decât satisfăcătoare din cauza recidivei post-chirurgicale mari2. În practica clinică, medicamentele cu platină au fost unul dintre agenții de primă linie pentru tratamentul avansat. Chimioterapia GC3. Cu toate acestea, rezistența dobândită la medicamente a apărut întotdeauna după mai multe cicluri de tratament pe bază de platină și indică un prognostic prost.cistancăPrin urmare, iluminarea mecanismelor potențiale și identificarea noilor strategii terapeutice pentru a depăși rezistența la medicamentele cu platină la pacienții cu GC au fost urgent esențiale.

Cistanche poate anti-imbatranire

Proteina 75 reglată cu glucoză (GRP75) a fost însoțitorul molecular inductibil de stres care a aparținut familiei proteinelor de șoc termic4. Supraexprimarea GRP75 a fost strâns asociată cu progresia tumorii în diferite tipuri de cancer uman5-7. Aici, prin explorarea unei meta-analize, am descoperit că un nivel ridicat de GRP75 a indicat un prognostic semnificativ prost în mai multe tipuri de cancer ale sistemului digestiv (cancer colorectal, colangiocarcinom și cancer pancreatic). Pentru rezistența la medicamente, inhibarea GRP75 a inversat rezistența la cisplatină și doxorubicină în carcinomul hepatocelular și cancerul ovarian”. tumorile pozitive au avut un prognostic mai rău în comparație cu tumorile negative GRP75 din GC cu funcție p53 normală. Cu toate acestea, p53 a fost una dintre genele cele mai frecvent mutate în GC (afectează mai mult de 50 la sută dintre pacienți) l2-15. Așa că am emis ipoteza că, în plus față de reprimarea clasică a activității p53, GRP75 ar putea fi implicat în inducerea/menținerea rezistenței la medicamentele cu platină în GC prin folosirea unui mod independent.

În acest studiu, expresia mai mare a GRP75 a contribuit la rezistența la cisplatină în celulele SGC7901 și într-un model de xenogrefe. Din punct de vedere mecanic, GRP75 a indus/menținut rezistența la cisplatină prin reglarea abilităților anti-oxidare/apoptotice și a proprietăților de reprogramare metabolică.cistanche AustraliaLa pacienții cu GC, supraexprimarea GRP75 a contribuit la caracteristicile agresive și la prognosticul nefavorabil. Rezultatele noastre au indicat că GRP75 a promovat rezistența la cisplatină în GC și ar putea fi un biomarker pentru prezicerea răspunsului la tratamentul medicamentos cu platină.beneficii cistancheDirecționarea GRP75 ar putea oferi o nouă înțelegere a chimioterapiei sistemice GC.

Rezultate

Efectele GRP75 asupra rezistenței la cisplatină în testele de viabilitate a celulelor GC au fost folosite pentru a verifica rezistența celulelor SGC7901~, Ipsos (uM) de cisplatină pentru celulele SGC7901 și SGC7901CR au fost: 5,518 vs.72,46 (Fig. 1A). Pe baza bazelor de date KM-Plotter, expresia crescută a GRP75 a indicat un prognostic slab (Fig.1B). Mai mult, a crescut semnificativ expresiile GRP75 în celulele SGC7901CR în comparație cu celulele parentale SGC7901 (Fig. 1C), sugerând că GRP75 ar putea contribui la rezistența la cisplatină. Pentru a verifica această ipoteză, celulele SGC7901~ au fost transfectate prin amestecare sau GRP75 siRNA, iar IC50s (uM) de cisplatină pentru celulele SGC7901CK transfectate cu siRNA amestecat sau GRP75 au fost: 50,83 vs.20.86, respectiv .1D). În contrast,

supraexprimarea GRP75 prin transfectarea plasmidelor GRP75 în celule SGC7901 a arătat că IC50-urile cisplatinei pentru plasmide scramble- sau GRP75 transfectate celulele SGC7901 au fost 3,825 față de 6,98 (Fig.1E). Colectiv, aceste rezultate au arătat că GRP75 a jucat roluri cruciale în menținerea/inducerea rezistenței la cisplatină în GC, dar mecanismele au rămas investigate în continuare.

Mecanismele potențiale care stau la baza GRP75 au cauzat rezistența la cisplatină

Am descărcat seturile de date microarray GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) și GSE14209 (țesuturi, rezistente la cisplatină vs. sensibile la cisplatină) de la GEO, apoi am efectuat procesul GO-Biological și KEGG-Pathway analiza de îmbogățire pe baza DAVID, rezultatele au fost prezentate în Fig.2A-D. Diferențele esențiale ale proceselor biologice dintre celulele SGC7901C* și celulele SGC7901 au inclus reducerea oxidării, procesul apoptotic (Fig. 2A), analiza de îmbogățire a căii KEGG a constatat că seturile DEG au fost strâns corelate cu căile metabolice și fosfatidilinozitol 3 kinaza B/protein kinaza. calea (PI3K/AKT) (Fig. 2B). Răspunsul la medicament a fost inclus în diferențele esențiale ale proceselor biologice dintre țesuturile tumorale rezistente la cisplatină și sensibile la cisplatină, iar calea metabolică a fost, de asemenea, veriga centrală în analiza de îmbogățire a căii KEGG (Fig. 2C, D). În plus, o rețea de 60 de proteine ​​care au interacționat semnificativ cu GRP75 a fost construită folosind baza de date String, apoi analiza KEGG-Pathway a realizat că căile metabolice au jucat un rol important între GRP75 și interactorii săi (Fig. 2E). Pe baza acestor rezultate, am presupus că antioxidarea/apoptoza și reprogramarea metabolică ar putea promova supraviețuirea și creșterea GC, ceea ce duce la rezistența la cisplatină. Cu toate acestea, mecanismele de participare GRP75 la reglementare au avut nevoie de studii suplimentare (Fig. 2F).

Efectele GRP75 asupra antioxidării și anti-apoptozei Aici, nivelul ROS intracelular a fost crescut în celulele SGC7901CR în comparație cu omologii săi parentali (Fig. 3A), sugerând că celulele SGC7901Ck au fost expuse la condiții de stres oxidativ relativ mai ridicate. Un studiu anterior a arătat că GRP75 a fost implicat în stabilizarea MMP, o sursă importantă de generare de ROS. Aici, distrugerea GRP75 a abolit menținerea MMP în celulele SGC7901CK indusă de cisplatină, iar supraexprimarea GRP75 a avut efectul opus în celulele SGC7901 (Fig. 3B).Colesterolul cistancheApoi, am validat relația dintre GRP75 și anti-oxidare și anti-apoptoză. După cum se arată în Fig. 3C, distrugerea GRP75 a scăzut nivelul factorului nuclear eritroid-2-factorului 2 asociat (NRF2) și genele sale țintă din aval (HO-1 și NQO{-1) în SGC7901 ~ celulele și supraexprimarea GRP75 au arătat efectul opus în celulele SGC7901. În plus, distrugerea GRP75 sau NRF2 în celulele SGC7901CR a îmbunătățit și mai mult generațiile intracelulare de ROS, apoptoza (Fig. 3D) și activitățile caspazei-3 (Figura suplimentară S1) induse de cisplatină. În schimb, supraexprimarea GRP75 în celulele SGC7901 a atenuat semnificativ generațiile de ROS induse de cisplatină, apoptoza celulară (Fig. 3E) și activitățile caspazei -3 (Figura suplimentară S1). Aceste rezultate au arătat că rezistența la cisplatină menținută/indusă de GRP75 ar putea fi prin inducerea antioxidării și anti-apoptozei în celulele GC.

Efectele GRP75 asupra reprogramării metabolice În continuare, am investigat în continuare prin care GRP75 a indus alterarea reprogramării metabolice. Dovezile tot mai mari au arătat că metabolismul celulelor tumorale nu a fost o schimbare anormală într-o singură cale metabolică, ci o reprogramare a întregii rețele metabolice celulare17. Multe oncogene clasice sau căi de semnalizare au fost implicate direct sau indirect în reprogramarea metabolică, cum ar fi PI3K/AKT, factorul inductibil de hipoxie la (HIF-la), c-myc și așa mai departe" 819. Prin urmare, am verificat dacă GRP75 a fost 4A, am observat niveluri crescute de p-AKT, HIF-la și c-myc în celulele SGC7901CR în comparație cu celulele parentale SGC7901. În plus, în celulele SGC7901CR, distrugerea GRP75 a scăzut nivelurile proteinei p-AKT, HIF-la și c-Myc induse de cisplatină și țintele lor din aval legate de glicoliză (HK2: hexokinaza 2; PDK1: piruvat dehidrogenază kinaza l; și LDHA: lanț de lactat dehidrogenază A). Dimpotrivă, supraexprimarea GRP75 în celulele SGC7901 a arătat efectul opus (Fig. 4B, C). În plus, distrugerea GRP75 sau AKT în celulele SGC7901CR a arătat o scădere semnificativă a absorbției de glucoză și a viabilității/creșterii celulelor induse de cisplatină; supraexprimarea GRP75 în celulele SGC7901 în mod semnificativ a crescut capacitatea de absorbție a glucozei și viabilitatea/creșterea celulelor cauzate de cisplatină (Fig. 4D-F). Colectiv, aceste date au indicat că GRP75 a menținut/indus rezistența la cisplatină în celulele GC ar putea fi prin participarea la reprogramarea metabolică mediată de p-AKT, HIF-la și c-myc.

Confirmarea datelor in vitro într-un model de xenogrefă Apoi am investigat potențiala relevanță clinică a GRP75 in vivo. Datele xenogrefei au indicat că tratamentul cu cisplatină în monoterapie sau eliminarea GRP75 singur ar putea inhiba creșterea tumorii; cu toate acestea, tratamentul cu cisplatină combinat cu knockdown GRP75 a facilitat în mod semnificativ inhibarea indusă de cisplatină a creșterii tumorii (Fig. 5A). Mai mult decât atât, testele IHC și qPCR au arătat că cisplatin plus GRP75 siRNA au scăzut semnificativ expresiile Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT și țintele din aval în comparație cu tratamentul cu cisplatină singur, dar au crescut apoptoza (după cum este determinată prin colorarea TUNEL, Fig. 5B). , C). Colectiv, aceste rezultate au indicat că, prin reglarea abilităților anti-oxidare/anti-apoptoză și reprogramarea metabolică, GRP75 a stimulat supraviețuirea și creșterea in vivo care, la rândul lor, au condus la rezistența la cisplatină a GC.

Identificarea GRP75 ca factor caracteristic de promovare a cancerului și semnificația clinică a GRP75 în GC

Apoi am evaluat expresia GRP75 în secțiuni consecutive de probe GC. După cum se arată în Fig. 6A, în comparație cu țesuturile gastrice non-tumorale adiacente, a fost observată o creștere considerabilă a expresiei GRP75 în țesuturile GC. Supraexprimarea GRP75 a fost demonstrată în țesuturile GC prin scorul de intensitate IHC (Fig. 6B). O colorare mai puternică pentru GRP75 a fost, de asemenea, observată cu creșterea clasificării TNM a stadiului tumorilor maligne (Fig. 6C, D). Apoi, am împărțit aceste 116 specimene GC în două grupuri ("GRP75 low" vs. GRP75 high", conform intensității IHC, Fig. 6E). Diametrele transversale ale tumorilor din grupul „GRP75 high” au fost semnificativ mai mari decât cele din grupul „GRP75 low” (Fig. 6F). Am validat în continuare prognosticul clinic al GRP75 în GC. Analiza de supraviețuire Kaplan-Meier a arătat, de asemenea, că pacienții GC din grupul „GRP75 ridicat” au avut o supraviețuire globală mai proastă decât cei din grupul „GRP75 scăzut” (Fig. 6G).

Analiza multivariată a identificat că GRP75 a fost un predictor independent pentru supraviețuirea globală (Tabelul 1).efecte secundare cistanche deserticola,În rezumat, aceste rezultate au sugerat că GRP75 a avut un rol caracteristic în conducerea progresiei GC, rezistența la cisplatină și prognosticul nefavorabil. Meta-analiză a nivelului ridicat de GRP75 cu prognostic Diagrama de flux a căutării și selecției literaturii și meta-analiză au fost prezentate în Fig. S2 suplimentară. Modelul cu efect aleator și modelul cu efect fix au fost utilizate pentru a calcula și analiza valoarea HR, ambele au arătat că nivelurile ridicate de GRP75 sunt asociate semnificativ cu rezultate slabe ale pacientului. HR cumulat a fost 1,91 (IC 95 la sută 1,62 la 2,25), cu eterogenitate (I'=0.{0 procente, p =0.559) (Fig. 7A). Apoi am făcut o analiză de subgrup, care a arătat că nivelul de expresie a GRP75 în cancerul gastrointestinal (HR combinat a fost de 1,99,95% CI 1,64 până la 2,43), are o relație semnificativă cu prognosticul de supraviețuire prost. Cu siguranță, rezultate similare au fost găsite și în alte tumori (HR combinat a fost de 1,74,95 la sută CI 1,29 până la 2,33) (Fig.7B). Ambii

Graficul funnel al lui Begg și testul lui Egger au fost utilizate pentru a evalua posibila părtinire de publicare a studiilor incluse. În analiza asocierii dintre GRP75 și OS, valoarea p a testului lui Begg și a testului lui Egger a fost 0.{076 și, respectiv, 0,024 (Fig.7C și D). Cu toate acestea, testul lui Egger are o sensibilitate mai mare în evaluarea părtinirii publicării. Astfel, metoda de tăiere și umplere a fost folosită pentru a face rezultatele noastre mai credibile. După cum se arată în Fig. 7E, HR ajustată în modelul cu efect fix a fost de 1,785 (IC 95% 1,530 până la 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Discuţie

În acest studiu, am folosit unul dintre agenții chimioterapeutici de primă linie pentru pacienții cu GC, medicamente cu platină. În mod clasic, medicamentele cu platină s-ar putea lega covalent de guanina de pe lanțul ADN și, astfel, blochează replicarea și transcripția ADN2. Cu toate acestea, din cauza rezistenței la medicamente și a efectelor secundare nedorite, identificarea de noi strategii terapeutice pentru a inversa rezistența la pacienții cu GC a fost urgent esențială. În plus, pacienții GC au dezvoltat rezistență la medicamente după ce au primit mai multe cure de cisplatină, iar rezultatele noastre au arătat că celulele SGC7901~ au prezentat rezistență semnificativă la cisplatină în comparație cu celulele SGC7901.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) a jucat un rol cheie în reglarea inițierii și progresiei cancerelor umane-7. Mai recent, a devenit clar că GRP75 a avut, de asemenea, un rol critic în rezistența la chimioterapie „. Pe lângă GRP75, alte proteine ​​de șoc termic au jucat un rol critic în rezistența la cisplatină prin PI3K/AKT/NF-KB și alte căi21-24 Cu toate acestea, mecanismul molecular al GRP75 și rezistența la cisplatină a fost raportat rar. Aici, studiul nostru a dezvăluit că GRP75 a promovat abilitățile de anti-oxidare/apoptoză și a alterat reprogramarea metabolică, ducând la rezistența la cisplatină în celulele GC. De asemenea, am descoperit că GRP75 a fost reglat în creștere în celulele SGC7901~ și în probele de țesut de la pacienți și a fost corelat cu rezistența la medicamente, pro-supraviețuire, creștere și rezultate slabe. Între timp, analiza multivariată a identificat că GRP75 a fost un predictor independent pentru supraviețuirea globală. În plus, meta-analiză a indicat că un Nivelul ridicat de GRP75 a arătat un prognostic prost, incluzând dar fără a se limita la GC, ceea ce a fost foarte în concordanță cu cercetarea noastră.Toate rezultatele de mai sus au validat că țintirea GRP75 ar putea este de așteptat să devină o nouă abordare pentru a inversa rezistența la cisplatină și pentru a îmbunătăți prognosticul pacienților cu GC.

În condiții fiziologice, celulele au fost inevitabil expuse la ROS din cauza factorilor externi și a metabolismului aerob intracelular. Ca o sabie cu două tăișuri, ROS adecvate au fost molecule semnal importante care reglează funcția normală a celulelor, în timp ce ROS excesiv a dus la apoptoză. Prin urmare, în organism a existat un sistem precis de reglare antioxidantă pentru menținerea echilibrului redox și a procedurilor apoptotice 20. Cu toate acestea, spre deosebire de condițiile fiziologice, nivelurile de ROS ale tumorilor au fost în general semnificativ mai mari decât martorii normale de aceeași origine tisulară, ceea ce a determinat existența unui sistem anti-oxidant în celulele tumorale, în special pentru celulele tumorale rezistente la medicamente27-29. Rezultatele noastre au confirmat că celulele SGC7901CR au prezentat un nivel relativ mai mare de ROS în comparație cu celulele SGC7901 și că, GRP75 a crescut capacitățile de anti-oxidare/apoptoză. Celulele tumorale au avut o istorie lungă de anomalii metabolice. Încă din anii 1930, Otto Warburg a descoperit că celulele tumorale preferă glicoliza. Chiar și în condiții de oxigen suficient, celulele tumorale au menținut în continuare rate ridicate de glicoliză pentru generarea de ATP. Acest model metabolic anormal a fost numit „efectul Warburg”3031. Modificările metabolice determinate de efectul Warburg au fost denumite recent reprogramare metabolică, iar studiile asupra acestor modificări au oferit o înțelegere mai profundă a metabolismului celulelor GC. S-a demonstrat că celulele GC și celulele normale au prezentat diferențe metabolice nu numai în metabolismul glucozei, ci și în metabolismul lipidelor și aminoacizilor³2-35. În această cercetare, am descoperit că modificările metabolismului glucozei au fost una dintre esențiale. leagă menținerea creșterii celulare, conducând în cele din urmă la rezistența la cisplatină GC.

După cum am menționat, oncogenele clasice și căile de semnalizare precum PI3K/AKT, HIF-la și c-myc au fost implicate direct sau indirect în reprogramarea metabolică. Activarea căii PI3K/AKT în celulele tumorale a îmbunătățit multe activități metabolice. În primul rând, a permis celulelor absorbția de glucoză, aminoacizi și alți nutrienți. În al doilea rând, AKT a crescut glicoliza și producția de lactat prin efectele sale asupra expresiei genelor și activității enzimelor și a fost suficient pentru a induce un efect War-burg în celulele canceroase. În al treilea rând, activarea acestei căi a îmbunătățit biosinteza macromoleculelor și a stimulat expresia genelor lipogene și sinteza lipidelor7. În plus, GRP75-activat AKT și protein kinazele 1 și 2 reglate de semnal extracelular au inhibat modificările conformaționale Bax și apoptoza 8. Celulele tumorale s-au adaptat la hipoxie implicând reprogramarea metabolică prin reglarea genelor țintă HIF-la pentru a stimula absorbția de glucoză, glicoliza, producerea și secreția de acid lactic, stocarea glicogenului, glutamina cat-abolism³ și promovează acumularea de trigliceride în picăturile de lipide³. Mai recent, a devenit clar că GRP75 se poate lega în mod specific de HIF-la și țintește membrana mitocondrială exterioară, asociată cu VDAC1 și HK2, care au prevenit apoptoza. C-myc ar putea media reprogramarea metabolică în mai multe moduri, iar reprogramarea metabolică mediată de c-myc a fost realizată în mare parte prin afectarea mitocondriilor. Pe de o parte, c-myc a promovat și glicoliza prin reglarea directă a expresiei enzimelor legate de glicolitic, inclusiv LDHA, HK2 și PDK11938. Pe de altă parte, enzimele activate cu c-myc implicate în metabolismul glutaminei prin transcripție au promovat utilizarea glutamina de către mitocondriile din celulele tumorale. Acest efect se numește „glutaminoliză”. În plus, supraexpresia GRP75-a redus Ciclin-B1 și reglează în sus Cyclin-D1 și c-myc pentru a promova creșterea celulelor canceroase ovariane*. Pe baza rezultatelor noastre prezente, am oferit o nouă înțelegere a rezistenței la cisplatină GC prin GRP75 ca o legătură potențial importantă în reglarea rețelelor de reprogramare metabolică a tumorii.

Concluzii

În concluzie, am demonstrat că supraexprimarea GRP75 ar putea promova supraviețuirea/creșterea în celulele GC prin reglarea rețelelor de anti-oxidare/apoptoză și reprogramare metabolică, inducând astfel rezistența la cisplatină.

Materiale și metode

Celule, reactivi și condiții de cultură

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99,0 procente de puritate), a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Celulele au fost cultivate în mediu RPMI-1640(Gibco, Grand Island, NY, SUA), suplimentate cu 10% ser fetal bovin (FBS), 100 U/ml penicilină, 100 ug/ml streptomicina (Gibco) și incubate în 5 la sută CO2 la 37 de grade . Pentru menținerea fenotipului de rezistență la cisplatină, celulele SGC7901CR au fost incubate într-un mediu care conține cisplatină （5μM）.

Xenogrefe și tratamente

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Medicală din Nanjing, iar animalele au fost tratate uman și cu privire la atenuarea suferinței. Șoarecii nuzi BALB/c au fost obținuți de la Centrul pentru animale de laborator SLRC (Shanghai, China) și ținuți în mod convențional așa cum am descris anterior*l. Pentru studiul xenogrefei, celulele SGC7901CK de 2 x 10 grade în matrigel de 100 ul au fost injectate subcutanat în flancurile șoarecilor timp de 5 săptămâni. Pentru a determina efectele GRP75 asupra rezistenței la cisplatină a GC, am efectuat testul de injecție intratumorală și intraperitoneală. Pe scurt, șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în 4 grupuri (5 șoareci per grup): (1)MOCK, (2)GRP75KD, (3)MOCK＋cisplatină și (4) GRP75 KD＋cisplatină. 100 ul de siARN (si-Con sau si-GRP75, 100 nM) au fost injecții intratumorale la fiecare 3 zile. Loturile supuse terapiei cu cisplatină (5 mg/kg) au fost injecții intraperitoneale de 3 ori pe săptămână, iar celelalte grupuri au fost perfuzate cu un volum egal de soluție salină. Tumorile au fost măsurate în fiecare săptămână și volumele lor au fost calculate utilizând formula: V=Y (lățime2 lungime). După 5 săptămâni, șoarecii au fost sacrificați și țesuturile tumorale au fost îndepărtate pentru investigații suplimentare.

Pacienți și probe de țesut

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de etică medicală al celui de-al doilea spital afiliat, Universitatea Medicală Nanjing și Spitalul afiliat Changzhou nr. 2 al Universității Medicale Nanjing și au fost obținute consimțământul informat scris al participantului de la fiecare pacient. Datele clinico-patologice au fost enumerate în tabelul suplimentar S1. Microarray-ul de țesuturi a fost construit de Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, China) așa cum am descris anterior*

Transfecția celulară

Pentru transfecție, scrambled și pcDNA-3.1-GRP75-Flag au fost sintetizate de General Biotech (Shanghai, China); în timp ce siRNA-urile au fost listate în tabelul suplimentar S2. Celulele au fost transfectate tranzitoriu prin reactiv lipofectamină 3000 (Invitrogen, Carlsbad, SUA), conform protocolului producătorului. Pe scurt, celulele au fost placate pe plăci 6-godeuri la o densitate de 1 x 10 grade celule în mediu RPMI 1640 care conține 10% FBS fără antibiotice. După incubare timp de 24 de ore, celulele au fost transfectate tranzitoriu cu 5 ng/ml amestecat sau GRP75-Flag sau 20 nM si-Con sau si-GRP75 timp de 12 ore. După transfecție, celulele au fost cultivate într-un mediu proaspăt suplimentat cu 10% FBS timp de încă 24 de ore înainte de a fi utilizate pentru alte experimente.

Reacția cantitativă în lanț a polimerazei în timp real (qPCR) Primerii utilizați au fost enumerați în tabelul suplimentar S3. Izolarea ARN-ului total, transcrierea ARN-ului la cADN și performanța qRT-PCR cu aparatul Applied Biosystems 7300HT au fost toate conform studiului nostru anterior 2. -actina a fost amplificată pentru a asigura integritatea cADN-ului și pentru a normaliza expresia. Modificările de pliere ale expresiei fiecărei gene au fost calculate printr-o metodă comparativă a ciclului de prag (Ct) folosind formula 2-(4ACt)

Acest articol este extras din Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w