Complexe de proteine-mucilagii nano lapte: Caracterizare și efect anticancer Partea 2

Pentru mai multe informații contacteazătina.xiang@wecistanche.com

Faceți clic pe link pentru a afla partea 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Materiale și Metode

3.1. Materiale

Coji de Plantago ovata (subgoal) și fructele mature ale lui Ziziphus Spina-Christi(Nabeq) au fost achiziționate din Giza, Egipt; concentratul de proteine ​​din lapte (MP, 81,3 procente de proteine) a fost achiziționat de la compania Fonterra (Auckland, Noua Zeelandă). Cazeina și proteinele din zer din MPC sunt în mare parte în forma lor nativă și similară, micelară, cu cele găsite în lapte. Toate substanțele chimice utilizate au fost de puritate analitică.

3.2.Pregătirea mucilagiului Isabgol Husk (IHM) și a mucilagiului Nabeg (NabM)

Mucilagiul de coajă Isabgol (IHM) și mucilagiul Nabeq (NabM) au fost preparate conform metodei descrise de El-Maksoud și colab. [5]. Pe scurt, o suspensie de coji de isabgol a fost preparată prin dizolvarea a 1,2 g în 100 ml apă distilată și purificată cu soluție de acetonă. Gelul rezultat a fost păstrat la frigider (4-5 grade) până la utilizare.

Pentru NabM, fructele Nabeq coapte au fost spălate bine cu apă de la robinet pentru a îndepărta murdăria. Fructele proaspete au fost separate de semințe și amestecate cu apă distilată într-un raport de 1:10 (g/v) după ce au fost tăiate în bucăți mici. Amestecul a fost amestecat folosind un blender de laborator (Toshiba Mixie, Japonia) și lăsat să stea timp de 12 ore în frigider.

Extractul mucilaginos a fost apoi centrifugat la 2000 rpm timp de 30 min și filtrat printr-o cârpă de muselină. Mucilagiul vâscos solubil rezultat a fost precipitat cu acetonă. Mucilagiul brut obținut a fost păstrat la frigider până la utilizare.

În scopuri analitice, mucilagiul a fost uscat într-un cuptor cu aer la 40 grade și măcinat folosind moara cu bile MM4{00 (Retsch, Germania). A fost măsurată compoziția chimică a pulberii de mucilagiu cu coajă de psyllium (PHMP) și a pulberii de mucilagiu Nabeq (NabMP). Umiditatea, proteinele, grăsimile, cenușa, fibrele brute și conținutul total de carbohidrați au fost de 8,49, 0,34, 0,21, 2,13, 1,53 și 87,44 procente pentru PHMP și 9,18, 4,72, 2,05, 2,69, 1,70 și 78,26 procente pentru NabMP. , respectiv. Pulberea rezultată a fost păstrată la o temperatură rece (4-5 grade) până la o analiză ulterioară.

Faceți clic pentru a afla mai multe informații

3.3. Prepararea complexelor proteine-mucilagii din lapte (MPMC)

Complexele de proteine ​​din lapte (MP) cu IHM și NabM au fost preparate conform lui Morr și colab. cu unele modificări [44]. Concentratul de proteine ​​din lapte a fost reconstituit în apă distilată (10 procente). Coloidul de proteină din lapte rezultat a fost amestecat cu IHM și NabM într-un raport de 1:3 (o/o). pH-ul amestecului a fost ajustat la 10 și lăsat să stea timp de 10 minute. După aceea, pH-ul a fost scăzut la 3,5 folosind HCI 0,1 N și lăsat timp de încă 10 minute. pH-ul a fost apoi ajustat la pH 4,6 folosind 0,5 M NaOH pentru a colecta MPMC prin filtrare pe o hârtie de filtru: MP, precum și MPMC rezultat, au fost uscate prin liofilizare la -45 grade C timp de 24 de ore utilizând liofilizatorul Novalyphe-NL500 , Savant Instruments, Holbrook, NY, SUA.

3.4. Caracteristici fizico-chimice și funcționale

3.4.1.Măsurarea pH-ului

pH-ul produselor rezultate la o soluție de 10 procente a fost măsurat folosind un pH-metru calibrat (HANNA, HI 902 m, Germania).

3.4.2. Determinarea densității în vrac (BD), a densității tape (TD) și a indicelui Carr

Pulberea MPMC a fost turnată într-un cilindru de măsurare de 50 ml până la 25 ml, corespunzând volumului neatingat, apoi bateți de 5-10 ori până când nu s-a observat nicio modificare ulterioară a volumului pulberii corespunzătoare volumului bătut.

Densitatea în vrac, densitatea tapată și indicele Carr au fost determinate aplicând următoarele ecuații [45]:

(1) BD=masa/volum neexploatat

(2) TD=masa/volumul atins

(3)Indexul lui Carr ( procente )= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Indicele de absorbție a apei (WAI) și indicele de solubilitate în apă (WSD)

Solubilitatea în apă și indicii de absorbție a apei ai MP și MPMC au fost examinați conform metodei descrise de Yagc și Gogus cu unele modificări [46]. Probele (0,5 g) au fost dispersate în 10 ml apă distilată la 25 de grade într-un tub de centrifugă. După ce au stat timp de 30 de minute, cu inversarea tubului la fiecare 5 minute, probele au fost centrifugate la 3500 rpm timp de 15 minute. Filtratul a fost transferat pe o placă de aluminiu şi uscat timp de 3 ore la 105 grade. Greutatea gelului rămas a fost înregistrată și WSI și WAI au fost determinate după cum urmează:

(4)WAI(g/g)= Creșterea în greutate a gelului/Greutatea uscată a probei

(5) Procent WSI=Greutatea solidelor uscate în supernatant × 100/Greutatea uscată a probei

3.4.4. Digestibilitatea proteinelor din lapte

Digestibilitatea proteinelor a fost determinată conform lui Abd El-Ghany et al. [47]. Pe scurt, probele de MP și MPMC au fost dispersate în apă distilată la o concentrație de 6,38 mg/mL, iar pH-ul a fost ajustat la 8.0. Un mililitru de soluție stoc de enzime proaspăt preparată (1,6 mg/mL tripsină, 3,1 mg/mL chimotripsină și 1,3 mg/mL ER amino peptidază1)

(ERAP1) a fost amestecat cu suspensie de proteine ​​la 37 de grade. pH-ul a fost înregistrat după 10 minute, iar activitatea enzimatică a fost determinată folosind cazeina ca referință. Următoarea ecuație a fost utilizată pentru a calcula digestibilitatea proteinelor [47]:

(6) procente Digestibilitate=210.46-18.10 (pH)

3.5.Fracțiunile fenolice ale PHM și NabM

Compușii fenolici ai probelor de mucilagi folosind analiza HPLC au fost conduși prin protocolul descris de Elsayed și colab. [48]. Pe scurt, extractul de mucilagiu a fost analizat folosind un sistem HPLC din seria 1260 Agilent (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, SUA). Separarea a fost trecută folosind coloana C18 (100 mm x 4,6 mm id, 5 um). Faza mobilă a conținut (A) apă 0,2% H3PO4, (B)metanol și (C) acetonitril la un debit de 0,6 ml/min. Gradient de eluare a fost conform următoarei scheme: 0-11 min (96 la sută A., 2 la sută B);11-13 min (50 la sută A, 25 la sută B);13-17min (40 la sută A, 30 la sută B);17-20,5 min (50 la sută B, 50 la sută C); și 20,5-30 min (96 la sută A, 2 la sută B). Lungimea de undă de detectare (UV) detector, 284 nm) a fost setat la 284 nm. Mărimea injecției a fost de 20 μL și temperatura coloanei a fost menținută la 30 de grade. Compușii au fost cunoscuți prin compararea timpului lor de retenție cu cei din standarde autentice. Curbele de calibrare au fost utilizate pentru a evalua cantitățile de compus.

3.6.Conținutul total de fenolici și flavonoizi de MP și MPMC

Conținutul de polifenolici a fost determinat prin metoda Folin-Ciocalteu cu unele modificări [5]. Pe scurt, 2,8 ml de apă milli-Q conţinând 10 mg de MP sau MPMC au fost amestecate cu 2 ml de 2% carbonat de sodiu şi 0,1 ml de 50% reactiv Folin-Ciocalteau. După 30 de minute de incubare la temperatura camerei, absorbanța amestecului de reacție a fost măsurată la 750 nm față de apă deionizată ca martor folosind un spectrofotometru (Hitachi, Model 100-20). Acidul galic (GA) a fost utilizat ca compus fenolic standard și a fost construită o curbă standard în șapte puncte (0-200 mg/L). Rezultatele au fost exprimate ca miligrame de echivalenți de acid galic per gram de proteină (GAE/g).

Flavonoideconținutul a fost determinat folosind metoda clorurii de aluminiu așa cum a fost descrisă anterior de Abedelmaksoud și colab. cu unele modificări [5]. Pe scurt, 2,8 ml apă milli-Q care conține 10 mg MP sau MPMC a fost amestecată cu 0,1 ml de 10% clorură de aluminiu hexahidrat și 0,1 ml de acetat de potasiu 1 M. După incubare la temperatura camerei timp de 40 de minute, absorbanța amestecului de reacție a fost măsurată la 415 nm față de apă deionizată ca martor. Quercetina a fost utilizată ca standard utilizând o curbă standard în șapte puncte (0-50 mg/L). Conținutul total de flavonoide a fost exprimat ca echivalenți de quercetină miligrame (QE/g).

3.7. Activitatea antioxidantă a MP și MPMC

Capacitatea totală de captare a radicalilor liberi a MP și MPMC a fost evaluată folosind trei teste antioxidante diferite: stabil 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), Azino-bis(3-etilbenzotiazolină{{5 }}acid sulfonic (ABTS) și radicali hidroxil (HS), așa cum a fost descris anterior de El-Maksoud și colab. [5].

3.8. Profilul aminoacizilor MP și MPMC

Probele de proteine ​​au fost hidrolizate acid folosind HCI 6 N conform Peksa și colab. [49. Pentru determinarea aminoacizilor a fost utilizat un analizor automat de aminoacizi (AAA 400, INGOs Ltd.).

3.9. Proprietăți reologice

Probele au fost pregătite așa cum este descris de Barnes [50], cu unele modificări. Vâscozitatea soluției de 2,5 procente (g/g) la pH7 a fost determinată la 25±1 grade utilizând un viscozimetru Brookfield (DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Germania). Tensiunea （σ） și vâscozitatea （n）au fost reprezentate în funcție de viteza de forfecare. S-au calculat indicele de consistență (K) și indicele de comportament al curgerii (n) al modelului putere-lege:

Valoarea lui n este egală cu 1 pentru fluidele newtoniene și variază de la 0 la 1 pentru fluidele care se subțiază prin forfecare și mai mare decât 1 pentru fluidele cu îngroșare prin forfecare [51].

3.10. Calorimetrie de scanare diferențială (DSC)

Proprietățile termice ale MP și MPMC au fost măsurate utilizând un calorimetru cu scanare diferențială (PerkinElmer, SUA). Probele (4-6 mg) au fost plasate într-o placă de aluminiu și sigilate. Fiecare tigaie a fost apoi încălzită la 350 de grade cu un flux de azot gazos uscat la 20 mL min-I la o viteză de încălzire de 10 grade min-1. Din vârful endotermic al termogramei DSC, au fost estimate temperatura de debut al denaturarii, temperatura maximă de tranziție și punctul de degradare [52]. Valoarea entalpiei de tranziție (AH) din zona de sub vârful endotermic din curba DSC a fost determinată și a fost folosită ca referință tava de aluminiu goală.

3.11. Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR)

Spectrele infraroșu între 600 și 3500 cm-I au fost măsurate la 25 de grade folosind un spectrofotometru FTIR (QFA Flex, SUA) prin metoda reflexiei totale atenuate folosind o rezoluție de 4 cm-I și dobândind 10 scanări pe secundă.

3.12. Microscopia electronică cu transmisie

Microstructura MP și MPMC a fost vizualizată folosind un microscop electronic cu transmisie (JEOL, JEM 1400 Flash, Japonia) la 80 kV. S-a aplicat crio-etapa în metoda de colorare negativă [53].

3.13.Studii biologice asupra MP și MPMC

3.13.1.Activitate anticancer in vitro

Toate liniile celulare utilizate în acest experiment au fost obținute din Colecția Americană de Cultură de Tip (ATCC, Manassas, VA, SUA). În acest test au fost utilizate două linii de celule canceroase umane: adenocarcinomul mamar (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) și carcinomul hepatocelular (HepG2, ATCC4 HB{-8065TM). Liniile celulare BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) și epiteliale ale sânului MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) necanceroase ale pielii au fost testate pentru comparație. Liniile celulare au fost crescute în mediu Eagle modificat de la Dulbecco (DMEM/high glucose, HyCloneTM, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS, Gibco, Brazilia), 100 U/mL penicilină, 100 ug/mL streptomicina și 25 ng/ mL amfotericină B (Sigma, Oakville, ON, Canada) și cultivat la 37 de grade cu 5% CO, într-un incubator umidificat. Mediul de cultură a fost înlocuit o dată la două zile cu un mediu proaspăt. Când celulele au atins o confluență de 70%, acestea au fost detașate folosind 0,25% Tripsină-EDTA(1X) Gibco, Canada și transferate într-un balon de cultură nou. După a doua trecere, celulele au fost tripsinizate și placate într-o placă de 96-godeuri la o concentrație de 2 x 10* celule/godeu. După 24 de ore de incubare, mediul a fost decantat, iar celulele au fost spălate de două ori cu PBS apoi tratate cu 200 μL de mediu de cultură care conține diferite concentrații de probe de proteine ​​(1, 5, 10 și 20 ug/mL). Doxorubicină HCI (4 ug/mL) a fost utilizată ca martor pozitiv, în timp ce celulele tratate cu un mediu nesuplimentat au fost luate ca martor negativ. Plăcile au fost incubate la 37 grade C timp de 24 de ore șianti-canceractivitatea probelor a fost determinată utilizând un test de captare roșu neutru conform Repetto și colab. [54]. Pe scurt, după perioada de incubare, mediul a fost înlocuit cu 150 uL de colorant roșu neutru (100 mg/mL) dizolvat într-un mediu fără ser și celulele au fost incubate la 37 grade C timp de 3 ore. Apoi, celulele au fost clătite cu PBS și s-au adăugat 150 μL de mediu de eluție (EtOH/AcCOOH, 50∶1), urmat de agitare ușoară timp de 10 minute pentru a asigura dizolvarea completă. Absorbanța a fost măsurată la 540 nm utilizând un cititor de plăci de microtitrare (BioTek, 96 Well Plates, ELX808, SUA).

unde Ac este absorbanța controlului și As este absorbanța probei. Moartea celulară procentuală prezentată ca citotoxicitate (procent) și concentrația care ucide 50 la sută din celule (IC50) a fost calculată pentru fiecare probă.

3.13.2. Determinarea nivelului de proteine ​​p53, Bax, caspază-3 și Bcl-2

Nivelurile celulare ale markerilor cheie ale proteinei de apoptoză au fost determinate după 24 de ore post-tratament cu ICso de MP și MPMC. Pe scurt, celulele Hep G-2, MCF-7, Bj-1 și MCF{-12F au fost însămânțate la 5 × 10* celule/godeu în 6-godeu farfurii. După 24 de ore de incubare cu probele la 37 de grade, celulele au fost colectate și lizate apoi centrifugate la 10,000rpm timp de 20 de minute la 4 grade. Concentrația de proteine ​​a fost cuantificată în supernatant prin testul Bradford [55]. Activitatea caspazei-3 a fost analizată folosind un kit de analiză colorimetrică (Abcam, ab39401) conform instrucțiunilor producătorului [56]. Pe scurt, s-au adăugat 10 mg proteină la 50 uL de substrat Caspază și volumul final a fost ajustat la 200 μL folosind tampon de reacție la 37 de grade, iar amestecul a fost incubat timp de 1 oră la întuneric, urmat de măsurarea Caspazei{{24} } concentrație la 405 nm.

Nivelul markerului pro-apoptotic p53, asociat X(Bax) și al markerului anti-apoptotic al limfomului cu celule B-2(Bcl{-2) au fost determinate în lizat de celule utilizând Testul imunosorbent legat de enzime Pas simplu ELISA conform instrucțiunilor producătorului (ab207225, ab119506 și ab199080; Abcam, SUA), respectiv [57,58].

3.13.3.Daune ADN induse de protecția la stres oxidativ

Testul de deteriorare a ADN-ului a fost efectuat așa cum a fost descris anterior de Leba și colab. [59] cu o ușoară modificare. Pe scurt, 3 μL de plasmida inhibitor de ribonuclează RNH1（NM_203387）Human Tagged ORF Clona 10 ug/μL au fost amestecate cu reactivul Fenton (5 mM de H2O2 și 0,3 mM) de FeSO4 și 0,6 mM de EDTA), iar volumul final a fost ajustat la 25 μL utilizând tampon fosfat (H2POA, 8,3 mM, pH 7,4). Apoi, soluția a fost incubată timp de 20 de minute la 37 de grade. Pentru a evalua capacitatea de protecție antioxidantă a MP și MPMC față de deteriorarea ADN-ului indusă de reactivul Fenton, au fost adăugate 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM și MP înainte de incubare. ADN-ul plasmid RNH1 (3 μL, 10 ug/μL) a fost utilizat ca control al protecției ADN-ului.

3.13.4. Testul de deteriorare a ADN-ului genomic bazat pe PCR

Gena Homo sapiens metilentetrahidrofolat reductază (MTHFR) a fost amplificată utilizând PCR din genomica sângelui extrasă anterior din probe de sânge sănătoase folosind un kit standard de extracție ADN [60]. ADN-ul a fost incubat timp de 10 minute cu sau fără reactiv Fenton suplimentat cu MP sau MPMC. Un fragment 198-bp a fost amplificat utilizând amorsări forward5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' și inverse 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'. Folosind 50 ng de ADN tratat, amplificarea PCR a fost efectuată după termociclorul următor (94 grade timp de 5 minute, urmat de 25 de cicluri de denaturare, 30 s la 94 grade; recoacere, 30 s la 60 grade; și extensie, 30 s la 72 grade) pentru 25 de cicluri și 1 ciclu final de extensie la 72 de grade timp de 5 minute. Probele de reacție PCR au fost aplicate pentru electroforeza pe gel de agaroză (2 la sută).

3.13.5. Profilarea expresiei genelor prin RT-qPCR

Analizele exprimării genelor ale genelor marker-cheie pro și anti-apoptotice au fost efectuate cu celule HepG-2, MCF-7, Bj-1 și MCF{-12F expuse la IC50 obținut date (Tabelul 3) pentru 72 h. Pe scurt, ARN-ul total a fost extras folosind kitul de purificare a ARN total (QIAGEN., Thorold, ON, Canada) conform instrucțiunilor producătorului. cADN

sinteza a fost efectuată așa cum a fost descris anterior de Aboul-Sound și colab. [61]. Programele de amplificare și specificitatea ampliconului PCR au fost efectuate și evaluate prin utilizarea unui termociclator Rotor-Gene O 5-Plex HRM (Qiagen, Germania) cu Kitul Quanti-Tect SYBR-Green PCR (Qiagen, Germania), așa cum sa documentat anterior urmând protocoale standard [61]. Au fost utilizaţi următorii primeri: Hs_P{53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); Limfom cu celule B 2 Hs_BCL{2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011); Bcl-2-proteina similară Hs{{_BAX{_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); și 18S rDNA house-keeping (HK) gena Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay (QT00199367). Programul de ciclizare termică PCR și analiza expresiei genei pentru a determina schimbarea pliului în raport cu gena 18S au fost efectuate în esență așa cum a fost raportat anterior [61].

3.14.Analiza statistică

Rezultatele obţinute au fost exprimate ca medie ± abatere standard. Statisticile au fost realizate folosind software-ul SPSS 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, SUA). Testul lui Duncan cu intervale multiple a fost utilizat pentru a determina diferențele semnificative între toate probele, iar diferențele au fost considerate semnificative la p<>

4. Concluzii

În concluzie, acest studiu a relevat faptul că amestecarea proteinelor din lapte cupolizaharideprin diferenţierea pH-ului soluţiei este o tehnică potrivită pentru complexare. Complecșii mucilagii ai proteinelor din lapte (MPMC) rezultați au fenolici semnificativ mai mari șiflavonoidemai mult decât proteina din lapte (MP). Rezultatele DSC au arătat că complexarea MP cu polizaharide a crescut semnificativ stabilitatea termică cu o schimbare a temperaturii de denaturare. Au fost efectuate analize FTIR pentru identificarea grupelor funcționale și a fost investigat comportamentul de curgere al complexelor preparate. WSI și WAI ale proteinei din lapte au fost crescute prin complexarea cu NabM sau IHM. TEM a fost folosit pentru a vizualiza microstructura complexelor preparate. Pe de altă parte, se așteaptă ca complexele de proteine ​​din lapte rezultate cu mucilagiul de coji de isabgol (HM) sau mucilagiul Nabeq (NabM) să depășească proteinele native din lapte în efectul antioxidant și anticancer. În rezumat, MPMC a exprimat proprietăți anticancerigene unice împotriva modelului de cancer de sân și a liniilor celulare de carcinom hepatic (MCF7 și, respectiv, HEPG2), așa cum a fost demonstrat printr-un test de absorbție roșu neutru.

MPMC le-a îmbunătățit pe ambeleantioxidantși activitate antiproliferare. Caspazele sunt proteine ​​regulatoare cheie care sunt implicate în inducerea apoptozei. Reglarea în creștere a proteinei caspazei 3 și a transcrierilor ARNm (Figura 9A, B) controlează alte proteine ​​în calea apoptozei, care este caracterizată prin prăbușirea membranei mitocondriale cu eliberarea citocromului c indusă de Bax și activarea caspazei 9 conducând la angajarea ulterioară a caspaza 3. Reglarea ascendentă a Casp3, p53 și Bax, împreună cu reducerea expresiei Bcl-2 a dezvăluit că MPMC a indus inducerea apoptozei, unde reglarea în sus a p53 va stimula expresia Bax, care, la rândul său, va induce citocromul c eliberare, urmată de activarea caspazei-9 și-3. Mai mult, se știe că Bcl-2 inhibă eliberarea citocromului c. În studiul nostru, s-a demonstrat că reglarea în jos a Bcl-2 indusă de MPMC facilitează eliberarea fără opoziție a citocromului c indusă de Bax și apoptoza ulterioară.

Efectul anticancer al complexelor proteină-polizaharidă oferă mai multe lămuriri cu privire la aplicabilitatea acestor complexe pentru a fi utilizate în dezvoltarea de terapii pentru cancer la prețuri accesibile și eficiente, cu efecte secundare minime.