Natalenamides A–C, Tripeptide ciclice din Actinomadura Sp. asociată cu termite. RB99

Abstract:

În ultimii ani, investigațiile privind biochimia bacteriilor asociate insectelor au crescut. Atunci când sunt combinate cu procese de dereplicare analitică, aceste studii oferă o strategie puternică pentru a identifica compuși noi din punct de vedere structural și/sau biologic. Peptidele ciclice sintetizate non-ribozomal au un spectru larg de bioactivitate cu potențial medicinal ridicat.

Aici, raportăm descoperirea a trei noi tripeptide ciclice: natalenamide A-C (compuși 1-3). Acesti compuși au fost identificați din bulionul de cultură al Actinomadura sp. RB99 utilizând o metodă de dereplicare bazată pe cromatografie lichidă (LC)/ultravioletă (UV)/spectrometrie de masă (MS). Structurile chimice ale noilor compuși (1–3) au fost stabilite prin analiza unor metode spectroscopice cuprinzătoare, inclusiv unidimensional (1H și 13C) și bidimensional (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) magnetic nuclear spectroscopie de rezonanță (RMN), împreună cu date de spectrometrie de masă cu ionizare cu electrospray de înaltă rezoluție (HR-ESIMS). Configurațiile absolute ale noilor compuși au fost elucidate folosind analiza lui Marfey. Prin mai multe teste de bioactivitate pentru tripeptide, am descoperit că compusul 3 a prezentat efecte inhibitoare semnificative asupra producției de melanină indusă de 3-izobutil{-1-metilxantina (IBMX). Efectul compusului 3 a fost similar cu cel al acidului kojic, un compus utilizat pe scară largă ca material cosmetic cu efect de albire a pielii.

Pielea dreaptă, netedă și delicată a fost întotdeauna scopul urmărit de femeile orientale. Cercetarea și dezvoltarea agenților de albire pentru produsele de îngrijire a pielii se bazează în principal pe inhibarea activității tirozinazei.

Compușii care conțin inele benzenice sau structuri fenolice hidroxil au efecte potențiale de albire, cum ar fi agentul de albire utilizat în mod curent arbutina, care poate exercita efecte de albire prin inhibarea activității tirozinazei.

Și am constatat că Cistanche deserticola are efect de albire. Principalul ingredient activ al Cistanche deserticola, glicozidele feniletanoide, este un fel de compus glicozidic natural. Studiile au descoperit că glicozidele feniletanoide pot inhiba activitatea tirozinazei și producția de melanină în melanocitele epidermice umane și au un efect de albire. eficacitatea agentului.

Faceți clic pe pudră de extract de cistanche tubulosa

Cuvinte cheie:

termite care cresc ciuperci; Actinomadura sp.; tripeptide; natalenamide A–C; efecte de albire a pielii.

1. Introducere

Analiza chimică a simbioților bacterieni protectori ai insectelor de fermă a atras multă atenție în rândul chimiștilor de produse naturale în ultimii ani [1–5]. Folosind procese de dereplicare bazate pe rezonanță magnetică nucleară (RMN)/spectrometrie de masă (MS) de ultimă generație și analize biologice relevante din punct de vedere ecologic, au fost descoperite o cantitate impresionantă de produse naturale interesante din punct de vedere structural, inclusiv câteva peptide ciclice sintetizate non-ribozomal. din simbioți microbieni [6]. Cele mai proeminente exemple includ dentigerumicina antifungică, o depsipeptidă ciclică izolată dintr-o Pseudonocardia sp. [7] și gerumicinele A-C, depsipeptide ciclice purtătoare de acid piperazic identificate din Pseudonocardia sp. [8].

S-a demonstrat că peptidele ciclice prezintă o gamă largă de activități biologice, favorizând mai multe abordări sintetice față de aceste structuri promițătoare din punct de vedere farmacologic [9-12]. Peste 40 de medicamente cu peptide ciclice sunt comercializate și utilizate pe scară largă în mediile clinice și aproximativ un nou medicament cu peptide ciclice intră pe piață în fiecare an, în medie [13].

Ca parte a eforturilor noastre continue de a identifica metaboliți secundari structural noi și/sau bioactivi din microbii asociați cu termite [14–17], ne-am concentrat pe Actinomadura sp. RB99, izolat din termita care crește ciuperca, Macrotermes natalensis. Strategia noastră de dereplicare bazată pe cromatografie lichidă (LC)/ultravioletă (UV)/spectrometrie de masă (MS) a produs produse naturale bioactive potențial noi. În acest studiu, raportăm izolarea și identificarea chimică a trei noi tripeptide ciclice, natalenamida A-C (compușii 1-3, Figura 1), folosind o metodă de dereplicare bazată pe LC/UV/MS, precum și evaluările lor biologice pentru citotoxice , activități antiinflamatoare și de albire a pielii.

2. Rezultate și discuții

2.1. Cromatografie lichidă (LC)/Ultravioletă (UV)/Spectrometrie de masă (MS) - Izolarea compuşilor 1–3

Actinomadura sp. RB99 a fost izolat de pe suprafața unui lucrător de termite (M. natalensis). Analiza filogenetică a unei secvențe aproape complete de acid ribonucleic ribozomal (ARNr) 16S sugerează că tulpina RB99 aparține genului Actinomadura, cu cel mai apropiat vecin Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Analiza ulterioară bazată pe LC/UV/MS a extractelor de cultură îmbogățite a dezvăluit un set de absorbții UV caracteristice cu vârfuri unice de ioni moleculari care conțin atomi de azot.

Pentru a identifica metaboliții respectivi și a investiga activitatea acestora, au fost fermentate la scară largă utilizând condiții de creștere optimizate (100 plăci de agar din 2 L ISP2 agar, pH 6, 10 zile la 30 ◦ C) și o procedură stabilită de prelucrare și pre-purificare. aplicat [17]. Fracționarea ulterioară ghidată de LC-UV/MS și cromatografia lichidă de înaltă performanță semipreparativă repetitivă (HPLC) a dus la izolarea a trei metaboliți cu un model unic RMN/MS. Am efectuat studii de creștere și medii folosind diferite compoziții de sare (NaCl, KBr 1–3 la sută) și medii (medii ISP1-6) pentru a imita mediul natural și a stimula producția de metaboliți, ceea ce a condus, de asemenea, la prezența celor trei noi metaboliți (a se vedea figura suplimentară S19).

2.2. Elucidarea structurală a compuşilor

Natalenamida A (1) a fost dobândită sub formă de pulbere amorfă. Formula moleculară a lui 1 a fost determinată a fi C19H25N3O5 de la ionul molecular indus cu sodiu la m/z 398,1691 [M plus Na] plus (calculat pentru C19H25N3O5Na, 398,1692) utilizând modul de ioni pozitivi de înaltă rezoluție (spectrometrie de masă cu ionizare electrospray de înaltă rezoluție (HR). date ESIMS). Spectrul infraroșu (IR) a arătat o bandă puternică de absorbție la 1670 cm-1, sugerând prezența grupărilor amidice în moleculă. Analiza detaliată a datelor 1H RMN din 1 (Tabelul 1) a indicat semnalele tipice ale unui schelet de peptidă, afișând două semnale metil (δH 0,91 (3H, d, J=7.{{29). }} Hz, H-3) și 0,92 (3H, d, J=7.{0 Hz, H{-4)), trei semnale de metilen (5H 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H{-8b), 2,48 (1H) , m, H{{5{0}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.{0, 8.0 Hz, H{{58} }a) și 3,20 (1H, dd, J=14.{0, 5,0 Hz, H{-12b)), patru semnale de metină (δH 2,02 (1H) , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H{-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) și 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H{-11)) și cinci protoni aromatici suprapusi (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H{-14/18) și 7,24 (2H, m, H{{-15/17)).

Spectrul 13C RMN (Tabelul 1), cu asistență din spectrele HSQC și HMBC, a arătat un total de 19 rezonanțe de carbon responsabile pentru două semnale metil (δC 18,9 și 19,9), trei semnale metilen (δC 27.0, 30.6 și 38,8), nouă semnale de metină (δC 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (×2) și 130,6 (×2)), inclusiv cinci atomi de carbon aromatici, un carbon olefinic semnal (5C 138,8) și patru semnale carbonil carbon (5C 173,2, 173,3, 174,8 și 181,3). Combinată cu datele spectroscopice de mai sus, inspecția detaliată a RMN bidimensional (2D) (experimentele 1H-1H COSY, HSQC și HMBC) a relevat prezența a trei aminoacizi în 1: glutamat (Glu), fenilalanină ( Phe) și valină (Val) (Figura 2). Conectivitatea acestor aminoacizi a fost determinată de corelațiile HMBC dintre H-1/C{-5 și C-19, H{-11/C{-10 și C{ {50}} și H{-6/C{-5 și C{-10 (Figura 2).

Pentru a identifica configurația absolută a lui 1, metoda lui Marfey a fost aplicată pentru a determina stereochimia multiplilor -H (C-1, C-6 și C-11). Hidrolizatele acide ale 1 și aminoacizii standard (L/D-Glu, Phe și Val) au fost derivatizate cu 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanină amidă (L-FDAA). Sucesiv, amestecul derivatizat de 1 și aminoacizii standard au fost analizați prin LC/MS pentru a examina timpul de retenție al acestora. Configurațiile absolute ale fragmentelor Glu, Phe și Val au fost toate determinate a fi forme L, pe baza timpilor de retenție ai derivaților L-FDAA de 1 în comparație cu cei ai aminoacizilor standard. Astfel, structura lui 1 a fost elucidată ca tripeptidă ciclică prezentată în Figura 1.

Natalenamida B (2) a fost izolată ca o pulbere amorfă. Formula sa moleculară (C20H27N3O5) a fost dedusă din picurile ionilor moleculari aduși de hidrogen și sodiu la 390,2032 [M plus H] plus (calculat pentru C20H28N3O5, 390,2029) și respectiv 412,1849 [M plus Na] plus (calculat pentru C2028N3O5, respectiv Na], respectiv 412,1849 [M plus Na] plus (calculat pentru C205. În comparație cu formula moleculară și datele spectrale RMN de 1, compusul 2 pare să aibă o grupare CH2 suplimentară în scheletul peptidei. O examinare cuprinzătoare a spectrelor unidimensionale (1D) (1H și 13C RMN) și 2D RMN (1H-1H COSY, TOCSY, HSQC și HMBC) ale spectrelor 2 a dezvăluit existența a trei reziduuri de aminoacizi: Glu, Phe și Leu (leucină). Secvența acestor aminoacizi a fost construită pe baza corelațiilor HMBC dintre H-1/C{-6 și C-20, H-12/C{-11 și C -20 și H-7/C{-6 și C-11 (Figura 2). Pentru a determina configurația absolută a lui 2, a fost efectuată derivatizarea resturilor Glu, Phe și Leu cu L-FDAA și apoi a fost analizată prin LC/MS. În datele LC/MS, L-Glu, L-Phe și L-Leu au fost detectate prin compararea timpilor de retenție pentru derivații L-FDAA de 2 cu cei ai aminoacizilor standard. Astfel, structura chimică a lui 2 a fost stabilită ca tripeptidă ciclică prezentată în Figura 1.

Datele HR-ESIMS în mod pozitiv ale natalenamidei C (3) au afișat ioni moleculari aduși de hidrogen și sodiu la 424,1870 [M plus H] plus (calculat pentru C23H26N3O5, 424,1872) și 446,1694 [M plus Na] plus (calculat pentru C3O3H25, 424,1692). Aceasta a sugerat că formula sa moleculară a fost C23H25N3O5. O analiză detaliată a spectrelor RMN 1D și 2D ale lui 3 a indicat că structura sa chimică a fost similară cu cea a lui 2, cu excepția faptului că Leu a fost înlocuit cu Phe în 3. Conectivitatea celor trei aminoacizi identificați în 3 a fost verificată folosind corelațiile HMBC ale H-1/C-9 și C-23, H{-15/C{-14 și C-23 și H{-10/ C-9 și C-14 (Figura 2). Prin aplicarea metodei lui Marfey la compusul 3, configurațiile absolute ale multiplilor -H (C-1, C-10 și C{-15) au fost elucidate a fi un L-Glu și două L. - Fragmente Phe. În consecință, structura completă a lui 3 a fost determinată așa cum se arată în Figura 1.

Natalenamidele A–C sunt peptide triciclice, probabil de origine non-ribozomală. În prezent, mai multe tripeptide ciclice bioactive au fost caracterizate ca produse naturale: tripeptide ciclice membre citotoxice 17-(de exemplu, OF4949 I–IV) izolate din Penicillium rugulose [18]; sclerotomii antifungice A−K, identificate din bulionul de fermentație al bacteriilor halotolerante [10]; și E psihrofil antiproliferativ, izolat dintr-o cultură mixtă de două tulpini de ciuperci derivate din alge marine din genul Aspergillus [19].

2.3. Activitățile biologice ale compușilor 1-3

Deoarece peptidele ciclice au fost raportate că prezintă o gamă largă de activități biologice, efectele biologice ale tripeptidelor ciclice izolate ({{0}}) au fost evaluate folosind trei bioactivități. Citotoxicitatea compușilor 1-3 a fost investigată împotriva a patru linii de celule canceroase (celule de cancer de sân MCE7, celule de cancer de col uterin HeLa, celule de cancer pulmonar uman A549 și celule de cancer hepatic HepG2) la diferite concentrații (0, 6,25). , 12,5, 25, 50 şi 100 uM). Compusul 1 nu a afectat viabilitatea celulelor MCF-7, HeLa sau A549. Cu toate acestea, tratamentul celulelor HepG2 cu 100 M de compus 1 a scăzut viabilitatea celulei la 78,5 plus 3,2 procente (Figura 3). Compusul 2 a redus viabilitatea celulelor HeLa și A549 la 82,9  2,1% și, respectiv, 73,5=3,0%, dar nu a afectat viabilitatea MCF{-7 sau Celulele HepG2 (Figura 3). Compusul 3 nu a afectat viabilitatea niciunei linii celulare (Figura 3).

Apoi, macrofagele RAW264.7 au fost folosite pentru a investiga efectele antiinflamatorii ale compușilor izolați. Pentru a elimina erorile în producția de NO cauzate de schimbarea ratelor de supraviețuire a celulelor, au fost examinate concentrațiile netoxice ale fiecărui compus. După cum se arată în Figura 4, compușii 1-3 au avut puține efecte citotoxice în celulele RAW264.7 (Figura 4A-C) și nu au exercitat efecte inhibitoare asupra producției de NO în celulele RAW264.7 stimulate de lipopolizaharide (LPS) (Figura 4D-F) .

Efectele inhibitoare ale compușilor 1-3 asupra conținutului de melanină din celulele B16F10 au fost examinate ca dovadă a activităților lor de albire a pielii (Figura 5). Deoarece schimbările în viabilitatea celulelor cauzează erori în producția și măsurarea melaninei, am examinat mai întâi efectele compușilor 1-3 asupra supraviețuirii celulelor B16F10. Compușii 1-3 nu au exercitat efecte citotoxice în celulele B16F10 la oricare dintre concentrațiile utilizate (Figura 5A-C). Apoi am evaluat efectele inhibitoare ale compușilor asupra producției de melanină indusă de 3-izobutil{-1-metilxantina (IBMX) în celulele B16F10 (Figura 5D-F). IBMX, un stimulator binecunoscut al melanogenezei, induce o creștere semnificativă a producției de melanină în urma unui singur tratament în celulele melanomului. Printre compușii evaluați, compusul 3 (la 5-100 µM) a prezentat efecte inhibitoare semnificative asupra sintezei melaninei mediată de IBMX într-o manieră dependentă de doză. Acidul Kojic, controlul nostru pozitiv, a fost utilizat pe scară largă ca material cosmetic cu efecte de albire a pielii [20]. Efectul inhibitor al compusului 3 asupra producției de melanină indusă de IBMX a fost similar cu cel al acidului kojic (Figura 5F), sugerând că compusul 3 funcționează ca un inhibitor puternic al producției de melanină indusă de IBMX în celulele melanomului B16F10.

În plus, compusul 3 a fost contaminat cu un număr mic de impurități, care au fost determinate a fi analogi de acizi grași prin interpretarea datelor spectroscopice RMN și analiza LC/MS (materiale suplimentare, figurile S11-S15 și S23). Pentru a identifica activitatea impurităților, au fost efectuate experimente suplimentare cu analogii acizilor grași pentru efectele lor inhibitoare asupra producției de melanină indusă de IBMX în celulele B16F10, ceea ce a arătat că compușii testați nu au avut efect de albire (Materiale suplimentare, Figura S24). Astfel, deși nu putem exclude faptul că impuritățile din compusul 3 sunt responsabile pentru efectul inhibitor asupra producției de melanină indusă de IBMX, acest lucru pare puțin probabil.

3. Materiale și Metode

3.1. Proceduri generale experimentale

Spectrele în infraroșu au fost obținute pe un spectrometru Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, SUA). Ionizarea prin electrospray și spectrele HR-ESIMS au fost măsurate pe un spectrometru de masă SI-2/LCQ DecaXP cromatografie lichidă (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Spectrele RMN, inclusiv experimentele 1H–1H COSY, HSQC și HMBC, au fost efectuate folosind un spectrometru RMN Varian UNITY INOVA 800 (Varian, Palo Alto, CA, SUA) care funcționează la 800 MHz (1H) și 200 MHz (13C), cu deplasări chimice date în ppm (δ). HPLC preparativă a utilizat o pompă HPLC binară Waters 1525 cu detector cu matrice de fotodiode Waters 996 (Waters Corporation, Milford, CT, SUA). Silicagel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, SUA) și silicagel RP-C18 (230–400 mesh, Merck, au fost utilizate pentru cromatografia pe coloană. HPLC semipreparativă a folosit un sistem Shimadzu Prominence HPLC cu SPD{ {22}}Detectoare HPLC Prominence din seria A/20AV (UV-Vis) (Shimadzu, Tokyo, Japonia). Analizele LC/MS au fost efectuate pe un sistem HPLC Agilent din seria 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) echipat cu un detector cu matrice de diode și un spectrometru de masă ESI seria 6130 cu un Kinetex analitic (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Pentru subțiri s-au folosit plăci de silicagel pre-acoperite Merck și plăci RP-18 F254s. -cromatografie în strat (TLC).Petele au fost detectate pe TLC sub lumină UV sau prin încălzire după pulverizare cu o soluție de anisaldehidă-acid sulfuric.

3.2. Material microbian

Actinomadura sp. RB99 a fost izolat de pe suprafața unui lucrător de termite din genul, M. natalensis, (colonia Mn103, GPS S25 43 45.9 E{28 14 08.9) în 2 ianuarie{ {13}}10. Biomaterialul a fost plasat în pungi de plastic curate și procesat în decurs de o zi de la colectare. Termitele au fost spălate în apă sterilă deionizată și bacteriile au fost izolate prin placarea suspensiilor rezultate pe medii cu conținut scăzut de nutrienți cu chitină (per litru: 4 g chitină, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g). KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 și 20 g agar) [21]. Izolatele cu morfologie asemănătoare cu Actinobacteria au fost transferate în agar ISP2 (per litru: 10 g extract de malț, 4 g extract de drojdie, 4 g glucoză și 20 g agar) și subcultivate până când au fost obținute izolate pure.

3.3. Extracția ADN și amplificarea prin reacție în lanț a polimerazei

Actinomadura sp. RB99 a fost crescut în mediu lichid bogat în nutrienți ISP2 timp de cinci până la șapte zile la 30 ◦ C. Celulele au fost recoltate și ADN-ul genomic a fost extras folosind kitul de purificare a ADN-ului genomic GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) urmând instrucțiunile producătorului cu următoarele modificări: (a) tratamentul cu lizozim a fost extins la 40 de minute și (b) tratamentul cu proteinază K a fost extins la 40 min. ADN-ul a fost cuantificat fotometric folosind un spectrometru Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Pentru studii filogenetice, gena ARNr 16S a fost amplificată folosind setul de primeri, 1492R/27F. Fiecare reacție de amplificare a fost preparată într-un volum final de reacție de 25 µL care conține 7,25 µL de apă distilată, 5 µL de tampon HF, 5 µL din fiecare primer (2,5 µM), {{10}},5 µL de dNTPs (10 uM), 0,25 uL de ADN polimerază Phusion High-Fidelity (New England Biolabs, Ipswich, MA, SUA) și 2 uL de ADN extras (șablon). Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost efectuată în următoarele condiții: 98 ◦C timp de 38 s; 32 de cicluri de 98 ◦ timp de 30 s, 52 ◦C timp de 45 s, 72 ◦C timp de 1 min 20 s; și o prelungire finală de 72 ◦C timp de 8 min. Produsul PCR a fost vizualizat prin electroforeză pe gel de agaroză, iar reacțiile PCR au fost purificate folosind un kit de purificare PCR (Thermo Scientific). Fragmentele de ADN au fost secvențiate la GATC (Konstanz, Germania).

3.4. Secvențierea și identificarea speciilor

Secvențele au fost evaluate pentru puritate și nepotriviri folosind BioEdit [22]. Secvențele direct și invers obținute pentru fiecare tulpină au fost asamblate cu BioEdit și testate pentru himere folosind DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Secvențele rezultate au fost depuse în GenBank (număr de acces: KY558684). Analizele de explozie cu secvențe de ARNr 16S aproape complete (1368 bp) au fost efectuate utilizând baza de date a Centrului Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI) (secvențe de ARN de referință). Rezultatele au indicat că tulpina RB99 este un membru al genului, Actinomadura. Secvențele primelor 10 accesări au fost descărcate din baza de date NCBI și aliniate cu secvența de ARNr 16S a Actinomadura sp. RB99 utilizând serviciul de aliniere a secvențelor Sina [23]. Doi arbori filogenetici diferiți au fost reconstruiți cu algoritmi de unire a vecinilor sau de probabilitate maximă folosind software-ul MEGA versiunea 7.0.26 [24–26]. Modelul de distanță evolutivă al lui Tamura și Nei a fost utilizat pentru a genera matrice de distanță evolutivă pentru algoritmii de probabilitate maximă și de îmbinare a vecinilor, cu ștergerea golurilor complete și a datelor lipsă [27]. Pentru algoritmul de probabilitate maximă, a fost utilizată distribuția gamma discretă (plus G), iar modelul de variație a ratei a permis ca unele site-uri să fie invariabile din punct de vedere evolutiv (plus I). Pentru algoritmul de îmbinare a vecinilor, variația ratei între site-uri a fost modelată cu o distribuție gamma (plus G). Valorile de încredere ale nodurilor au fost evaluate prin analize bootstrap bazate pe 1000 de pași de reeșantionare [28].

3.5. Extracție și izolare

Actinomadura sp. RB99 a fost crescut în 50 mL bulion ISP2 timp de șapte zile la 30 ◦C (pre-cultură) și utilizat pentru a inocula 100 plăci de agar ISP2. Plăcile au fost incubate timp de 10 zile la 30 ◦ C, tăiate în bucăți mici, consolidate și scufundate peste noapte în MeOH. Faza de MeOH a fost filtrată şi evaporată sub presiune redusă. Extractul de MeOH (20 g) a fost dizolvat în apă distilată (700 ml) și apoi împărțit cu solvent cu EtOAc (700 ml) de trei ori, obținându-se 1,1 g de reziduu. Fracția solubilă în EtOAc (1,1 g) din extractul de MeOH a fost încărcată pe o coloană cu silicagel (230-400 mesh) pentru cromatografie și eluată cu un sistem de gradient de solvent de CH2Cl2-MeOH (100:1 la 1: 1, v/v). Aceasta a furnizat șase fracții (A-F), care au fost supuse analizei bazate pe LC-UV/MS. Analiza dereplicarii folosind o bibliotecă spectrală UV internă a sugerat existența unor analogi minori de peptide în fracția E. Acestea au afișat un model UV simplu la aproximativ 220 nm și vârfuri de ioni cu formulă moleculară unică care conțineau atomi de azot. Fracția polară E (233 mg) a fost fracționată prin HPLC preparativă în fază inversă (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, SUA) utilizând CH3CN/H2O (1:9 până la 9:1, v /v, sistem gradient, debit: 5 mL/min) pentru a produce cinci sub-fracții (E1–E5). Sub-fracția E2 (27 mg) a fost purificată printr-un HPLC semipreparativ în fază inversă (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) cu 33% MeOH/H2O (sistem izocratic, debit: 2 mL/min). ) pentru a da compusul 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Compușii 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) și 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) au fost izolați din sub-fracția E3 (15 mg) prin fază inversă semipreparativă HPLC eluând 43% MeOH/H20 (sistem izocratic, debit: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamidă A (1)

3.5.2. Natalenamidă B (2)

3.5.3. Natalenamidă C (3)

3.6. Hidroliza acidă a compuşilor 1–3

O cantitate totală de 0,4 mg din fiecare compus (1–3) a fost hidrolizată cu HCI 6 N (500 µL) timp de 1 oră la 110 ◦C. După răcire la temperatura camerei, hidrolizatele de 1-3 au fost evaporate pentru a îndepărta urmele de HCI. S-a adăugat apă distilată (500 uL) la amestecurile de hidrolizat și apoi s-a evaporat pentru a îndepărta urmele de HCI; acest proces a fost efectuat de trei ori.

3.7. Determinarea configurației absolute a aminoacizilor din 1–3

Amestecuri de hidrolizat (1–3), precum și aminoacizii standard (L/D-Leu, Glu, Phe și Val), au fost dizolvate în NaHCO3 1 N (100 µL) și apoi tratate cu 50 µL de L-FDAA (10 mg/mL în acetonă). Sucesiv, fiecare hidrolizat a fost încălzit timp de 10 minute la 80 ◦C. Fiecare amestec a fost stins cu HCI 2 N (50 uL) şi concentrat in vacuo. Reziduul a fost dizolvat în 300 uL de MeOH. Fiecare alicotă (5 µL) obținută din amestecurile de hidrolizat a fost injectată direct pe LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, debit de 0,3 mL/min) și o scanare completă în pozitiv și negativ moduri ionice (interval de scanare de la m/z 100 la 1000) au fost aplicate pentru a identifica timpii de retenție ai aminoacizilor derivați de L-FDAA.

Faza mobilă, constând din acid formic în apă distilată ({{0}},1 la sută v/v) (A) și acetonitril (B), a fost purtată cu un sistem de gradient de solvent după cum urmează: 20-40 la sută (B) timp de 10 minute, 100 la sută (B) izocratic timp de 5 minute și apoi 20 la sută (B) izocratic timp de 5 minute, pentru a efectua o procedură de spălare după rulare pentru coloană. Timpii de retenție ai aminoacizilor derivati ​​L-FDAA utilizați ca standarde au fost 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus) și 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus). Timpii de retenție ai hidrolizaților derivatizați de 1-3 au fost L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) și L-Val (22,5 min) de la 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) şi L-Leu (25,6 min) de la 2; și L-Glu (16,9 min) și L-Phe (25,7 min) de la 3.

3.8. Teste citotoxice folosind celule canceroase

Celulele MCF7, HeLa și A549 au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, SUA). Celulele HepG2 au fost achiziționate de la Korean Cell Line Bank (Seul, Coreea). Celulele MCF7 au fost cultivate în mediu 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Celulele HeLa și A549 au fost cultivate în mediu esențial minim Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Celulele HepG2 au fost cultivate în Mediu Esențial Minim suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Condițiile de cultură au fost menținute la 37 ◦ C într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2. Citotoxicitatea a fost testată pe aceste patru linii celulare umane (MCF7, HeLa, A549 și HepG2) folosind kitul de analiză a viabilității celulare EZ-CyTox (Laboratoarele Dojindo, Kumamoto, Japonia). Pe scurt, 5 × 103 celule/godeu au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu compuși la concentrațiile indicate. După 72 de ore de incubare, a fost utilizat trusa de analiză a viabilității celulelor EZ-CyTox. După 2 ore de incubare, absorbanța a fost măsurată la 450 nm cu o referință la 620 nm. Viabilitatea celulară a fost calculată ca procent din martor.

3.9. Activitate antiinflamatoare

Linia celulară RAW264.7 de macrofage de șoarece a fost achiziționată de la American Type Culture Collection. Celulele au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS), 100 unități/ml penicilină și 100 ug/ml streptomicină și incubate la 37 °C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Viabilitatea celulară a fost măsurată folosind kitul de detectare a viabilității celulare Ez-Cytox. Celulele au fost incubate în plăci de 96-godeuri la o concentrație de 2500 de celule per godeu timp de 24 de ore și tratate cu concentrațiile indicate de compuși 1-3 timp de 24 de ore. Apoi, reactivii Ez-Cytox au fost adăugați în fiecare godeu. Densitatea optică la 450 nm a fost măsurată după 1 oră folosind un cititor de microplăci (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, SUA) pentru a estima viabilitatea celulei. Într-un experiment separat, celulele RAW264.7 au fost incubate în 96-plăci de godeuri la o concentrație de 30,000 celule per godeu timp de 24 de ore. După înfometarea serului timp de 12 ore, celulele au fost pretratate cu compușii 1-3 timp de 1 oră și apoi stimulate cu 1 µg/mL de LPS timp de 24 de ore. Absorbanța mediului de cultură într-o reacție Griess a fost măsurată la 540 nm folosind un cititor de microplăci PowerWave XS pentru a estima nivelul de NO.

3.10. Măsurarea conținutului de melanină

Linia celulară de melanom de șoarece, B16F10, a fost achiziționată de la American Type Culture Collection. Celulele au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS, 100 unități/mL penicilină și 100 ug/ml streptomicină și incubate la 37 °C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Celulele B16F10 au fost incubate în vase de cultură de 6 cm la 250,000 celule per godeu în DMEM suplimentat cu 10% FBS, 100 ug/mL streptomicină și 100 U/mL penicilină timp de 24 de ore. Celulele au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și apoi stimulate de IBMX și incubate cu diferite concentrații de compuși 1-3 sau acid kojic (control pozitiv) în mediu RPMI fără roșu fenol suplimentat cu 10% FBS, 100 de unități. /mL penicilină și 100 ug/mL streptomicină timp de 24 de ore și 48 de ore. Absorbanța mediului de cultură a fost măsurată la 405 nm folosind un cititor de microplăci PowerWave XS pentru a estima conținutul de melanină. Rezultatele sunt exprimate ca schimbare de pliere în comparație cu controlul (celule nestimulate de IBMX).

3.11. Analize statistice

Toate datele, inclusiv viabilitatea celulară, NO și producțiile de melanină au fost prezentate ca valoare medie și abatere standard (SD). Toate testele au fost făcute în trei exemplare și au fost repetate de cel puțin trei ori. În acest studiu, au fost incluse doar câteva repetări ale fiecărui experiment celular, astfel încât metoda de analiză neparametrică a fost adoptată pentru analiza statistică. Pentru analiza statistică a fiecărei variabile a fost utilizat testul Kruskall-Wallis. Pachetul statistic SPSS a fost utilizat pentru toate analizele (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistics versiunea 21, Boston, MA, SUA). Semnificația statistică a fost considerată la o valoare p mai mică decât 0.05.

4. Concluzii

Raportul nostru oferă o analiză chimică a izolatelor microbiene dintr-o termită care crește ciuperci. Trei noi tripeptide ciclice, natalenamide A–C (1–3), au fost izolate și caracterizate structural din bulionul de cultură al Actinomadura sp. RB99 utilizând o metodă de dereplicare bazată pe LC-UV/MS. Toți compușii izolați au fost evaluați pentru activitățile biologice folosind teste pe bază de celule. Compușii 1 și 2 au prezentat citotoxicitate slabă împotriva celulelor HepG2 și, respectiv, HeLa/A549. Niciunul dintre compușii izolați nu a prezentat efecte inhibitoare semnificative asupra producției de NO în celulele RAW264.7 stimulate cu LPS. Compusul 3 a prezentat efecte inhibitoare semnificative asupra sintezei melaninei mediată de IBMX într-o manieră dependentă de doză. Efectul a fost similar cu cel al acidului kojic, care este folosit ca material cosmetic cu efecte de albire a pielii.

Mulțumiri:

Suntem profund recunoscători lui Michael Thomas-Poulsen (Departamentul de Biologie, Universitatea din Copenhaga, Danemarca) pentru sprijinirea muncii noastre de teren.

Conflicte de interes:

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Referințe

1. Newman, DJ; Cragg, GM Produsele naturale ca surse de noi medicamente din 1981 până în 2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Produse naturale: un rol în evoluție în viitoarea descoperire a medicamentelor. EURO. J. Med. Chim. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Produse naturale din microbi asociați cu insecte. Beilstein J. Org. Chim. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Simbioții bacterieni în sistemele agricole oferă o sursă strategică pentru descoperirea antibioticelor. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Re-apariția produselor naturale pentru descoperirea medicamentelor în era genomică. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Biosinteză totală: Reconstituirea in vitro a căilor de polichetide și peptide nonribozomale. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, un peroxid de polienă de la Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Stai, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Arhitecturile genetice variabile produc molecule practic identice in simbiontii bacterieni ai furnicilor care cresc ciuperci. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Scăzut, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, Alaska; Zaretsky, S. Rational design of calpain inhibitors based on calpastatin peptidomimetics. J. Med. Chim. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Tripeptide ciclice din ciuperca halotolerantă Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Peptide ciclice noi, sensibile la pH. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosinteza psihrofilelor tripeptide ciclice care conțin nitro. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Terapia cu peptide ciclice: trecut, prezent și viitor. Curr. Opinează. Chim. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, o ansamicină dintr-un Streptomyces sp. asociat cu termite. Chim. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavone A–C, glicozide izoflavonoide din Streptomyces sp. asociate cu termite. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Macrotermicinele A–D, macrolactame glicozilate dintr-o Amycolatopsis sp. asociată cu termite. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, Alaska; de Beer, ZW; et al. Izolarea, biosinteza și modificările chimice ale rubterolonelor A–F: alcaloizi tropolone rari din Actinomadura sp. 5–2. Chim. EURO. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, noi inhibitori ai aminopeptidazei B. II. Elucidarea structurii. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, o tripeptidă ciclică din burete Vanuatu Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Agenți de hipopigmentare: o revizuire actualizată asupra aspectelor biologice, chimice și clinice. Pigm. Melanomul celular Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Explorarea potențialului pentru actinobacteriile ca simbioți defensivi în termitele care cresc ciuperci. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Un editor de aliniere a secvențelor biologice ușor de utilizat și un program de analiză pentru Windows 95/98/NT. Simp. acizilor nucleici Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Alinierea precisă a secvenței multiple de mare capacitate a genelor ARN ribozomal. Bioinformatica 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Metoda de îmbinare a vecinilor: O nouă metodă de reconstrucție a arborilor filogenetici. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Arbori evolutivi din secvențe ADN: O abordare de maximă probabilitate. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Analiza genetică evolutivă moleculară versiunea 7.0 pentru seturi de date mai mari. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Estimarea numărului de substituții de nucleotide în regiunea de control a ADN-ului mitocondrial la oameni și cimpanzei. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Limitele de încredere privind filogeniile: O abordare folosind bootstrap. Evoluția 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Disponibilitatea eșantionului:

Probele de compuși nu sunt disponibile de la autori.

For more information:1950477648nn@gmail.com