Dietele pe bază de plante au fost asociate cu un risc mai scăzut de a dezvolta boli cronice, cum ar fi obezitatea

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:S-a sugerat că extractul metanolic de spanac (SME) inhibă formarea produselor finale de glicare avansată (AGE), care sunt crescute în timpul progresiei diabetului, de aceea este important să știm dacă IMM-urile au efecte benefice asupra retinei diabetului. În acest studiu, testele in vitro au arătat că SME inhibă glicația, formarea grupării carbonil și epuizarea grupului tiol redus în albumina serică bovină incubată fie zaharuri reducătoare, fie metilglioxal. Efectul SME în retinele șobolanilor diabetici induși de streptozotocină (STZ2) a fost, de asemenea, studiat (n=10) în grupul normoglicemic, STZ, șobolani STZ tratați cu SME și șobolani STZ tratați cu aminoguanidină (referință anti-AGE). grup) timp de 12 săptămâni. Retina a fost secționată și imunocolorată pentru Ne-carboximetil lizină (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, oxid nitric sintază inductibilă (iNOS),3-nitrotirozină (NT), NF-kB nuclear, factor de creștere endotelial vascular ( VEGF), proteina acidă fibrilară glială (GFAP), proteina S100B și testul TUNEL. Peroxidarea lipidelor a fost determinată în întreaga retină prin nivelurile de malondialdehidă (MDA). Rezultatele au arătat că în retina diabetică, SME a redus co-localizarea CML-RAGE, stresul oxidativ (NOX4, iNOS, NT, MDA), inflamația (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) și apoptoza (p.<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Cuvinte cheie:spanac; retinopatie diabetică; produse finale de glicație avansată; stresul oxidativ; inflamaţie; FURIE; carboximetil L-lizină

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

Dietele pe bază de plante au fost asociate cu un risc mai scăzut de a dezvolta boli cronice, cum ar fi obezitatea, diabetul de tip 2 și bolile coronariene. Spanacul (Spinacia oleracea L.) este o legumă cu frunze comestibilă consumată în întreaga lume datorită furnizării unei cantități apreciabile de fibre, vitamine și minerale [1,2]. Au fost identificate mai multe dintre substanțele fitochimice ale sale, inclusiv clorofilele, carotenoidele (luteină și zeaxantina) [3] și compușii fenolici (flavone, flavonoide, cumarine) [4-8] (vezi suplimentul 1). S-a raportat că spanacul, atunci când este ingerat ca aliment, extract solubil în apă sau sub formă liofilizată, și tilacoizii săi au proprietăți anticancerigene, anti-obezitate și hipoglicemiante [9]. Efectul antiinflamator al spanacului a fost demonstrat pe modele de endotoxemie animale, animale obeze și oameni sănătoși [9]. Efectul său antioxidant a fost studiat în celulele carcinomului de prostată uman, modele animale cu obezitate, șoareci iradiați cu UV și adenocarcinom al prostatei de șoarece transgenic [9,10]. Efectele anti-glicație și antiinflamatoare ale extractului metanolic de spanac (SME) au fost studiate în modelul de diabet indus de glucoză la peștele zebra și, respectiv, necroza miocardică indusă de izoproterenol la șobolani [11,12]. SME a diminuat nivelurile de hemoglobină glicozilată și fructozamină, inclusiv nivelurile de proteine ​​glicate, prin reducerea activității aldozo-reductazei în cristalinul ocular [11]. Constatările de mai sus sugerează că IMM-urile ar putea avea un efect preventiv asupra progresiei complicațiilor diabetului zaharat, cum ar fi retinopatia diabetică (DR).

DR duce progresiv la pierderea acuității vizuale sau a orbirii care a fost legată de inflamație, stres oxidativ și acumulare de produse finale de glicație avansată (AGE) [13,14]. AGE-urile induc reticularea proteinelor, modificând structura/funcția și turnover-ul/clearance-ul acesteia. AGE-urile pot fi produse printr-o reacție non-enzimă între glucoză cu o grupă amino liberă de proteine, formând intermediari reversibile precum bazele Schiff și produsele Amadori (fructozamină)[15]. Alte mecanisme pentru formarea AGE-urilor includ calea „stresului carbonil”, în care oxidarea zaharurilor și a lipidelor creează compuși intermediari dicarbonil, cum ar fi glioxalul și metilglioxalul (MGO), care duc la formarea AGE-urilor ca N:-carboximetil lizină (CML)[ 16]. Nivelurile crescute de LMC în ser și vitros pot fi un marker biochimic atât pentru apariția, cât și pentru progresia DR [17,18]. În retină, activarea receptorului RAGE de către AGEs (AGEs-RAGE) induce supraexprimarea proteinei gliale fibrilare acide (GFAP) și a factorilor proinflamatori, reglați de factorul nuclear kappa-amplificator de lanț ușor al B activat. celule (NF-kB)[19]. NF-kB reglează pozitiv expresia RAGE acționând ca un mecanism de feedback pozitiv [20].ce este cistanchePe de altă parte, concentrațiile mari de S100B, o proteină care leagă calciul, pot activa și NF-kB, inducând neuroinflamația și activarea celulelor gliale [21]. Supraexprimarea S100B în astrocite provoacă efecte neurotoxice manifestate prin astroglioza retiniană [22].

Cistanche poate anti-imbatranire

Au fost dezvoltate experimental strategii pentru a preveni afectarea retinei. Unele substanțe fitochimice ale spanacului izolate din alte plante au fost asociate cu inhibarea AGE și stresul oxidativ [8,23-26]. Luteina, astaxantina și kaempferolul au protejat celulele epiteliale pigmentare retiniene derivate din om (ARPE-19) de leziuni prin proprietățile lor anti-AGE, antioxidante și anti-apoptoză [26-28]. Aceste rezultate sugerează că substanțele fitochimice ale spanacului au un rol relevant în prevenirea degenerării retiniene, cum ar fi DR. O altă strategie a fost utilizarea aminoguanidinei (AG) ca un inhibitor puternic al glicației și al activității iNOS, atenuând acumularea de LMC și formarea precursorilor dicarbonilici reactivi la șobolani [29]. Cu toate acestea, într-un studiu clinic multicentric și randomizat cu 690 de pacienți diabetici, efectul benefic nu a fost stabilit clar [30].

Modificările degenerescenței retinei în condiții de hiperglicemie au fost puțin studiate. Prin urmare, este interesant de știut dacă SME protejează straturile retiniene de daune legate de proprietățile sale anti-AGE, antioxidante și antiinflamatorii în retina șobolanilor diabetici induși de streptozotocină.

2. Materiale și metode

2.1.Prepararea extractului metanolic de spanac (SME)

Frunzele proaspete de spanac (S.oleracea L.) au fost recoltate în sezonul toamnă-iarnă într-un câmp agricol din provincia Puebla, Mexic, și identificate de un botanist în herbarul Institutului Politehnic Național (IPN, Mexico City, Mexic). Exemplarul de voucher cu numărul 4532 a fost depus în herbarul Școlii Naționale de Științe Biologice a IPN.

Frunzele au fost deshidratate și măcinate fin. Frunzele uscate au fost macerate cu metanol la temperatura camerei, filtrate prin filtre de celuloză (Whatman, Maidstone, Marea Britanie) și uscate folosind un evaporator rotativ cu vid (BUCHI Rotavapor R{{{0}}, Elveția) la 45 de grade până la da o gumă verde (95,0 g/kg frunze uscate).Cistanche anti-imbatranireSME-ul a fost depozitat la întuneric la 4 grade până la utilizare. Pentru toate testele, extractul a fost reconstituit în apă distilată[11].

2.2. Teste in vitro ale activității antiglicație SME

2.2.1. Formarea produselor finale de glicație avansată derivate din albumina serică bovină (BSA-AGEs)

Testul BSA-AGEs a ​​fost efectuat, așa cum a fost descris anterior [31]. Pe scurt, 10 mg/mL BSA (fracțiunea V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost adăugat fie în D-glucoză 0, 5 M, D-fructoză {{12 }},5 M, sau metilglioxal 2,5 mM și preparat într-o soluție 0.1 M PBS (pH 7,4) și 0,02% azidă de sodiu. Concentrațiile SME (5, 10, 25, 50, 100 și 200 mg/mL) au fost adăugate la fiecare amestec și apoi incubate la 37 de grade timp de 4 săptămâni. Ulterior, zaharurile nereacționate au fost îndepărtate prin dializă împotriva apei distilate timp de două zile la 4 grade. Nivelurile BSA-AGE au fost determinate prin spectrofotometrie de fluorescență (Ex370/Em 440 nm; model LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, Marea Britanie) [32]. Glicarea proteinei BSA prin reducerea zaharurilor și MGO a fost un control pozitiv (BSA glicat), în timp ce incubarea BSA glicat cu aminoguanidină (1 mg/mL) a fost utilizată ca control negativ (BSA glicat-AG). Testele au fost efectuate în trei exemplare.

2.2.2. Test de fructosamină

Nivelul de fructozamină a fost determinat prin testul de tetrazoliu nitro albastru (NBT) [33], care se bazează pe capacitatea fructozaminei de a reduce NBT, formând formazan, un produs final colorat în condiții alcaline. Zece microlitri din oricare dintre martori sau concentrații de SME incubate cu BSA glicat (BSA-SME) au fost adăugați la 90 μL de NBT la 2,5 mM, preparat într-un tampon carbonat (0,1 M; pH 10,3); toate au fost incubate la 37 grade C timp de 30 de minute. S-a măsurat absorbanța la 530 nm. Concentrațiile de fructosamină (nmol/mg) au fost calculate conform unei curbe standard a formazanului.

2.2.3. Determinarea formării grupelor carbonil și epuizării grupărilor tiol în BSA-AGE

Concentrația grupului carbonil a fost măsurată în probele BSA-SME și martori, conform Levine și colab. [34]. O soluție de 2,4-dinitrofenilhidrazină (DNPH;10 mM) în 400 μL de 2,5 M HCI a fost adăugată la 100 μL fiecare probă și incubată în întuneric timp de 60 de minute la temperatura camerei.cistanche benefíciosApoi, s-au adăugat 500 μL de acid tricloracetic (20% g/v) și s-au ținut pe gheață timp de 5 minute. Probele au fost centrifugate la 4000 rpm timp de 15 minute, iar peletul de proteine ​​a fost spălat de trei ori cu acetat de etil/etanol (1:1 v/v). Ulterior, probele au fost suspendate în 250 μL clorhidrat de guanidină la 6 M. Concentrația grupărilor carbonil (nmol/mg proteină) a fost calculată prin spectrofotometrie la absorbanță de 370 nm (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, SUA) folosind coeficientul de absorbție al DNPH (22.000 M-1 cm{-1).

Conform metodei lui Ellman, a fost efectuată determinarea epuizării grupării tiol în probele BSA-SME și martor. Pe scurt, 10 μL de 5,5'-Disulfanediilbis ({2-acid nitrobenzoic) (DNTB; 10 mM, preparat în PBS) cu 50 μL de probe glicate a fost incubat timp de 15 minute la temperatura camerei, apoi a fost măsurată absorbanța la 410 nm. Nivelul grupelor de tiol liber a fost calculat folosind o curbă standard de L-cisteină (0.4-11 μM) și exprimat în nmol/mg proteină [34].

2.3. Efectul SME asupra retinei șobolanilor diabetici 2.3.1.Inducerea diabetului la șobolani

S-au folosit șobolani masculi Wistar cântărind 250± 10 gr(N=40) postați timp de 8 ore. A fost administrată o doză intraperitoneală de streptozotocină (60 mg/kg) în tampon citrat (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, SUA) [35]. Trei zile mai târziu, nivelul glucozei a fost măsurat (glucometru; ACCU-CHEK activ; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germania) prin colectarea unei picături dintr-o probă de sânge din coadă. Pentru studiu au fost recrutate animale cu niveluri glicemice mai mari de 350 mg/dL. Glucoza din sânge a fost măsurată săptămânal timp de 12 săptămâni.

2.3.2. Design experimental

Șobolanii diabetici induși de streptozotocină (STZ) au fost împărțiți aleatoriu în următoarele grupuri (n =10): STZ tratată intragastric cu 2 ml de apă de băut (STZ); STZ tratat cu SME la 400 mg/kg (STZ-SME); șobolani normoglicemici (NG); şi STZ tratată cu 50 mg/kg aminoguanidină (AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG). STZ-AG a fost utilizat ca grup de referinţă anti-AGE. Dozele atribuite au fost administrate la fiecare 24 de ore (9:00 am) timp de 12 săptămâni. Nivelul glicemic în toate grupurile a fost monitorizat săptămânal. Regimul de dozare SME la 400 mg/kg s-a bazat pe următoarele: 7 g de SME se obțin din 100 g de spanac proaspăt (datele nu sunt prezentate). Această cantitate este echivalentă cu consumul zilnic al unei persoane medii de 70 kg în dieta americană [36], ceea ce corespunde la 100 mg extract/kg greutate corporală.Extract de Cistanche Anti RadiațiiPe de altă parte, datorită diferenței în metabolismul accelerat al șobolanilor, se recomandă creșterea consumului oricărui extract natural de până la 6,4 ori pentru studii de comparație cu oamenii [37]. Doza de 400 mg/kg pe care am folosit-o sa bazat în principal pe rezultatele obținute într-un model de necroză miocardică indusă la șobolani Wistar, care a arătat că efectul antiinflamator al SME este mai semnificativ la 300 mg/kg [12].

2.3.3. Evaluări histologice și imunohistochimice

Ochii enucleați au fost fixați în formol neutru și apoi au fost deshidratați în alcooli gradați și încorporați în parafină. Secțiuni histologice de 2 μm au fost montate pe lame electroîncărcate, deparafinate și rehidratate până la soluție de recuperare a antigenului (K035; tampon citrat 10×, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, SUA). A fost utilizat un sistem de imunodetecție pe bază de polimeri (sistem de detectare DAB PolyVuemouse/iepure, Diagnostic BioSystems). Au fost utilizați următorii anticorpi primari: proteină acidă fibrilară glială (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, SUA); factor de creștere endotelial vascular (anti-VEGF; sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, SUA), proteina B care leagă calciul S100 (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, Marea Britanie) , și factorul nuclear kappa-amplificator de lanț ușor al celulelor B activate (anti-NF-kB p65;sc-8008). Toate diluțiile au fost la 1:200 și incubate peste noapte la 4 grade. Un anticorp secundar (Mouse/Rabbit PolyVueTM) a fost adăugat conform instrucțiunilor furnizorului.cistanche herbaSecțiunile au fost colorate cu substrat DAB plus/cromogen și hematoxilină. Observațiile histologice și captarea imaginilor au fost efectuate într-un microscop Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania).

Pentru colorarea prin imunofluorescență, lamele au fost incubate peste noapte la 4 grade C cu următorii anticorpi primari: carboximetil lizină (anti-LMC; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, Marea Britanie), receptor AGE (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oxidaza 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotirozină (anti-NT; ab110282) și oxid nitric sintetaza (inductibilă) (anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , STATELE UNITE ALE AMERICII). Apoi, au fost utilizaţi următorii anticorpi secundari: pentru anti-RAGE, capră anti-şoarece lgG(FITC)-conjugaţi (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); pentru anti-LMC și anti-NT, IgG-PE anti-iepure de șoarece (SC-3753); și pentru anti-iNOS și anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Toate au fost incubate la temperatura camerei timp de 60 de minute. Ulterior, secțiunile au fost montate într-un mediu care conține 4',6-Diamidin-2'-fenilindol diclorhidrat (DAPI). Anticorpii anti-LMC și anti-RAGE au fost co-hibridați în aceeași lamă. Stația de imagistică celulară FLoidTM (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, SUA) a fost utilizată pentru imagini cu fluorescență.

2.3.4.Evaluarea apoptozei

Apoptoza celulelor retiniene a fost detectată conform manualului descris de testul de deoxiuridin trifosfat (dUTP) mediat de deoxinucleotidil transferază (TdT) nick-end labeling (TUNEL) folosind kit-ul de detecție a morții celulare in situ, TMR(tetrametil-rodamină{{ 3}}dUTP) roșu, versiunea 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Pe scurt, lamelele deparafinate au fost rehidratate și clătite de două ori cu PBS. Apoi, au fost incubate cu amestecul de reacție TUNEL într-o atmosferă umidificată timp de 60 de minute la 37 C. După aceea, secțiunile au fost montate cu DAPI și observate în microscopie cu fluorescență (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD pentru TUNEL a fost calculat pentru straturile retiniene.

2.3.5. Test de peroxidare a lipidelor

Pentru evaluarea nivelurilor de malondialdehidă (MDA) în țesutul retinian, aproximativ 3 mg de țesut proaspăt (n=3) au fost omogenate și procesate așa cum sa raportat anterior [38]. Nivelurile de MDA au fost cuantificate urmând instrucțiunile furnizorului de truse (kit de analiză OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, SUA).

2.4.Analiza statistică

Pentru analiza statistică, toate micrografiile retiniene au fost capturate cu o magnitudine de 200× la 100 μm dincolo de regiunea nervului optic. Au fost analizate aproximativ 40 de imagini per grup de animale (n=7). Analiza imaginii a fost efectuată cu software-ul Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, SUA). Am folosit software-ul GraphPad Prism (La Jolla, CA, SUA; versiunea 8.0). Cifrele arată valorile reprezentate grafic în diagrame de tip box-and-whisker (mediană, prima a treia cuartilă, valoare minimă-maximă) pentru stratul de celule ganglionare (GCL), stratul nuclear interior (INL) și stratul nuclear exterior (ONL). Media și abaterea standard (media ± SD) sunt prezentate în Anexa A (Tabelele A1-A3). În toate cazurile, a fost efectuat un test ANOVA unidirecțional urmat de testul Tukey. p<0.05 was="" considered="" statistically="">