Partea 1 Efectele neuroprotectoare ale glicozidelor feniletanoide într-un model in vitro al bolii Alzheimer

Este real efectul neuroprotector al Cistanche?

JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,

SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 și JUMPING HU2

1 Departamentul de Farmacie, Primul Spital Afiliat; 2 Departamentul de Medicină Naturistă,

Colegiul de Farmacie, Universitatea Medicală Xinjiang, Urumqi, Xinjiang 830011, PR China

Primit 8 ianuarie 2016; Acceptat 6 ianuarie 2017

Abstract.

Prezentul studiu și-a propus să investigheze efectele neuroprotective aleglicozide feniletanoide(PhGs) pe H2O2- și peptida -amiloid (A)1-42-a indus leziunea celulelor PC12 ca model in vitro al bolii Alzheimer (AD). Condițiile optime de inducție au fost stabilite prin screening-ul diferiților timpi și concentrații de incubație. Celulele PC12 au fost tratate cu 0,5 pM A 1-42 şi H2O2 în prezenţă de PhG timp de 24 de ore şi viabilitatea celulei a fost apoi evaluată printr-un test MTT; Au fost măsurate, de asemenea, eliberarea de lactat dehidrogenază (LDH) și conținutul de malondialdehidă (MDA). Condițiile optime pentru stabilirea modelului AD au fost tratamentul celulelor PC12 cu 0.5 µM A 1-42 timp de 48 de ore, sau cu 25 µM H2O2 dizolvat în DMEM cu PBS. PhG la concentrații de 5, 25 și 50 µg/ml au crescut viabilitatea și au scăzut eliberarea de LDH și MDA de către celulele PC12 rănite cu A 1-42 sau H2O2. În concluzie, modelul de leziuni ale celulelor PC12 induse de A 1-42- și H2O2-a fost stabilit cu succes. S-a demonstrat că PhG au un efect neuroprotector semnificativ împotriva leziunilor celulare induse de A 1-42- sau H2O2-.

Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

Introducere

Boala Alzheimer (AD), o tulburare neurodegenerativă cu caracteristicile clinice de pierdere progresivă a memoriei și afectare a funcției cognitive (1), este cea mai frecventă cauză a demenței la nivel mondial (2). Costurile financiare sunt imense din cauza prevalenței AD (3). Prin urmare, este urgent să se dezvolte mijloace adecvate pentru managementul și prevenirea AD.

Patogenia AD este strâns asociată cu acumularea de încurcături neurofibrilare și plăci senile (SP) în regiunile cerebrale afectate (4,5). -peptida amiloid (A), componenta majoră a SP, sa raportat că are un rol cauzal în progresia AD, deoarece are un efect toxic asupra celulelor neuronale (6). Fragmentele A, inclusiv A 1-40, A 25-35 și A 1-42, au fost generate prin scindarea proteinei precursoare de amiloid (7). Sa constatat că neurotoxicitatea lui A 1-42 este semnificativ mai mare decât cea a A 25-35 și A 1-40, iar A 1-42 este capabil să inducă un model AD (1,{ {13}}). Stresul oxidativ poate fi implicat în patogeneza AD și este mecanismul major care stă la baza neurotoxicității induse de A (11-13). Mai multe studii au sugerat că A 1-42 a cauzat acumularea intracelulară a speciilor reactive de oxigen (ROS), ducând la oxidarea lipidelor și proteinelor, deteriorarea ADN-ului și activarea semnalizării punctului de control al ciclului celular (1,14,15). Cantitățile excesive de H2O2 pot duce la deteriorarea oxidativă și pot induce apoptoza celulelor PC12 (16). Prin urmare, țintirea stresului oxidativ poate fi o abordare promițătoare pentru dezvoltarea strategiilor terapeutice pentru inhibarea neurotoxicității induse de A în AD. Herba (H.)Cistanche, un medicament pe bază de plante chinezești folosit în mod obișnuit în China continentală pentru hrănirea rinichilor și completarea esenței și sângelui, a fost folosit pentru a trata pierderea memoriei și constipația senilă (17).Glicozid feniletanoid(PhG), unul dintre constituenții majori ai H.Cistanche, îmbunătățește afectarea apoptozei neuronale cauzată de A 25-35 prin efectele sale antioxidante (18,19). Un studiu anterior a identificat cinci componente majore din totalul PhG, și anumeacteozid, 2'-acetillacteozidă, echinacozid, cistanozide șiizoacteozidă(20). Dintre aceste componente,acteozidșiechinacozids-a raportat că au efecte neuroprotectoare asupra neurotoxicității induse de A 25-35- sau H2O2- (21-23). De exemplu, Wu et al (24) au sugerat căacteozidșiechinacoziddisfuncția cognitivă ameliorată cauzată de A 1-42. Prezentul studiu și-a propus să investigheze efectele protectoare ale PhG într-un model de celule de șobolan in vitro de AD.

Materiale și metode

PregătireadePhGs. PhG-urile totale au fost extrase dinH. Cistancheașa cum s-a descris anterior (25). Tulpina uscată la aer aH. Cistanche a fost pulverizat și extras prin percolare cu 80% EtOH. Percolatul a fost evaporat sub reducere

presiune, urmată de resuspendare într-o cantitate adecvată de H₂O₂(100 µmol/l). Amestecul a fost izolat pe o coloană de rășină macroporoasă SP-825 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japonia) și a fost eluat cu 0, 30, 50, 70 și 90% EtOH în apă. Pentru a obține fracția bogată în PhG, 30-50 procente de eluanți EtOH au fost concentrați și uscati la presiune redusă. Spectrofotometria ultravioletă (UV) a fost efectuată pentru a determina PhG-urile totale. Conținutul deechinacozidșiacteozida fost determinată prin cromatografie lichidă de înaltă presiune conform unui protocol anterior (26). O coloană Hypersil ODS-2 (4,6x250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, China) a fost utilizată și menținută la temperatura camerei. Fazele mobile au fost cianuri de metil și apă care conține 0,4% acid fosforic (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Debitul a fost de 0,75 ml/min și lungimea de undă a fost setată la 333 nm.

Cultură de celuleșitratament medicamentos.Linia celulară de feocromocitom de șobolan PC12 a fost furnizată de Dr. He Chunhui, Facultatea de Medicină, Universitatea Medicală Xinjiang (Urumqi, China). Celulele au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco cu conținut ridicat de glucoză (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SUA) care conține 10% ser fetal bovin (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, China), 100 U/ml penicilină și 100 U/ml de streptomicine într-un incubator la 37°C care conține 5% CO₂și 95 la sută aer. La atingerea unei confluențe de 80 procente, celulele au fost tratate cu 0,25 procente de tripsină și trecute.

Pentru a elimina interferența medicamentului în sine asupra creșterii celulelor PC12, a fost efectuat un experiment de toxicitate. Pe scurt, celule PC12 (3x10⁴celule/ml) au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri la 100 µl/godeu și incubate la 37°C peste noapte. După eliminarea supernatantului, s-au adăugat 200 µl DMEM complet în grupul martor, în timp ce celulele din grupurile de intervenție au fost tratate cu PhG în diferite doze (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 și 200 µg/). ml). După incubarea celulelor la 37°C timp de 48 de ore, în fiecare godeu s-au adăugat 20 pl de soluție MTT (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). După incubare timp de 4 ore, supernatantul a fost aruncat și s-au adăugat 150 ui dimetilsulfoxid per godeu, urmat de agitare timp de 10 min. Valorile densității optice (OD) la 490 nm au fost detectate utilizând un cititor de plăci ELISA.

A 1‑ 42-indusePC12leziuni celulare.O peptidă 1-42 achiziționată de la Bioss Biotech (Beijing, China) a fost dizolvată în apă (100 ug/ml). Ulterior, amestecul a fost incubat la 37°C timp de 4 zile și păstrat la 4°C înainte de utilizare.

Celulele PC12 au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri (3xl0⁴celule în 10{0 µl per godeu). După cultură timp de 24 de ore pentru aderență, 50 µl A 1-42 la diferite concentrații finale (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 sau 2 µM) s-au dizolvat în DMEM fără ser sa adăugat, urmat de incubare timp de 24, 48, 72 sau 96 de ore. Viabilitatea celulară a fost evaluată printr-un test MTT. Concentrația optimă A 1-42 a fost de 0,5 determinată a fi µM. Celule PC12 (3xl0⁴celule per godeu) au fost tratate cu diferite doze de PhG ({{0}}, 0.5, 5, 25 sau 50 µg/ml) în prezența a 0,5 µM A {{8 }} timp de 24 de ore. Viabilitatea celulară a fost evaluată printr-un test MTT.

H₂O₂-indusePC12leziuni celulare. Celulele PC12 au fost placate, însămânțate în 96-plăci de godeuri (3xl0⁴celule în 100 µl per godeu). După cultivare

timp de 24 de ore pentru aderență, 100 µl H₂O₂la diferite concentrații finale ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 și 500 uM) s-a adăugat dizolvat în DMEM cu sau fără PBS (0,01 mol/l), urmat de incubare pentru 24 h. Viabilitatea celulară a fost evaluată printr-un test MTT. H. optim₂O₂concentrația și solventul au fost determinate pentru a stabiliin vitromodel de AD.

celule PC12 (3xl0⁴celule per godeu) au fost tratate cu diferite doze de PhG ({{0}}, 0,5, 5, 25 și 50 pM). După cultivare timp de 24 de ore pentru aderență, celulele PC12 au fost tratate cu 100 ui H₂O₂dizolvat în DMEM cu PBS în prezența PhG timp de 24 de ore. Viabilitatea celulară a fost evaluată printr-un test MTT.

lactatdehidrogenaza (LDH)testul de eliberare. Leziunea celulară a fost evaluată prin măsurarea activității LDH în supernatantul celulelor PC12 folosind un kit LDH conform protocolului producătorului (nr. cat. 20150604; Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng, Nanjing, China). Pe scurt, H. dublu distilat₂O, {{0}},2 µmol/ml acid piruvic, tampon de matrice și tampon de coenzimă I au fost adăugate în secvență la 48 de ore după tratamentul medicamentos. După incubare la 37°C timp de 15 minute, s-a adăugat 2,4-dinitro-fenilhidrazină. Ulterior, s-au adăugat în fiecare godeu 250 ui dintr-o soluție de NaOH 0,4 M. Supernatantul a fost colectat după incubare timp de 30 de minute la temperatura camerei. Absorbanța la 450 nm a fost apoi măsurată cu un cititor de microplăci.

Măsuraredemalondialdehidă(MDA). MDA a fost măsurat în supernatantul celulelor PC12 folosind un kit comercial (nr. cat. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) conform protocolului producătorului Pe scurt, alcool deshidratat și alți reactivi au fost adăugate în ordine, urmate de incubare într-o baie de apă. la 95˚C timp de 40 min. Amestecul a fost centrifugat la 1006 xg și 25°C timp de 10 minute după răcire. Supernatantul a fost apoi utilizat pentru a determina conținutul de MDA. Absorbanța a fost ulterior măsurată cu un cititor de microplăci la 532 nm.

Evaluare de de protecţie efecte de echinacozid și actozid împotriva ANUNȚ în vitro. Celulele PC12 au fost însămânțate la o densitate de 3xl0⁴celule/godeu în plăci cu {{{0}}godeuri (100 µl/godeu). Celulele au fost incubate cu medicamente, inclusiv echinacozidă (cat. nr. 111670-200503; National Institutes for Food and Drug Control, Beijing, China) și acteoside (cat. nr. 111530-200505; National Institutes for Food and Drug Control). ) la diferite concentrații (0,5, 25 și 50 pg/ml). Ulterior, celulele au fost tratate cu A 1-42 sau H₂O₂timp de 24 de ore și viabilitatea celulei a fost măsurată printr-un test MTT.

Statistic analiză. Valorile sunt exprimate ca medie ± abaterea standard. Testul t al elevului a fost utilizat pentru comparații între grupuri. Analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultate

Cuantificarea PhG din H. Cistanches.Spectrele UV ale PhG-urilor extrase, precum și soluțiile standard deechinacozidau fost înregistrate și acteozide, iar rezultatele au arătat că spectrele UV au fost consistente (Fig. 1). spectrofotometrie UV

a arătat că conținutul de PhG a fost de 87,6 la sută. Rezultatele HPLC au arătat că conținutul de echinacozidă și actozidă a fost

37,7 și, respectiv, 17,8 la sută (Fig. 2).

DeterminaredecelidealPhGconcentraţie. În comparație cu grupul martor, PhG la 75, 100, 125, 150, 175 și 200 ug/ml a avut un efect inhibitor semnificativ asupra celulelor PC12 (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 la sută (Fig. 3). Astfel, PhG-urile la concentrația de 5, 25 și 50 pg/ml au fost utilizate pentru tratarea celulelor PC12 în experimentele ulterioare, deoarece nu afectează viabilitatea celulei.

A 1‑42-indusePC12leziuni celulare.În comparație cu cea din grupul de control, viabilitatea celulelor în grupul cu leziuni 0,5 µM A 1-42 a fost de 63 la sută (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitroModel AD.

S-a determinat, de asemenea, activitatea celulelor PC12 tratate cu 0,5 pM A 1-42 în prezența unor doze sigure de PhG (5, 25 și 50 pg/ml) timp de 24 de ore. Comparativ cu grupul de modele (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H₂O₂-indusePC12leziuni celulare. Viabilitatea celulelor PC12 tratate cu 25 pM H₂O₂dizolvat în DMEM cu PBS a fost de 56,43 la sută. Viabilitatea celulelor PC12 tratate cu 200 pM H₂O₂dizolvat în DMEM fără PBS a fost de 71,64 procente (Tabelul I). Astfel, celulele PC12 tratate cu 25 pM H₂O₂dizolvate în DMEM cu PBS au fost selectate drept condiție optimă pentru stabilirea modelului AD.

În comparație cu grupul de control, viabilitatea celulelor în grupul model a fost de 48,8 la sută (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhG și viabilitatea celulelor PC12 tratate cu PhG la concentrații de 5, 25 și 50 pg/ml au fost de 54, 57 și, respectiv, 64 la sută (Tabelul II).

PhG-urile inhibă eliberarea LDH indusă de leziuni de către celulele PC12. Comparativ cu grupul de control, conținutul de LDH al supernatantului celulelor PC12 lezate a fost crescut, care a fost inhibat de PhG într-o manieră dependentă de concentrație. Acest rezultat a indicat că PhG-urile au un efect neuroprotector semnificativ asupra celulelor PC12 (Fig. 6).

inhibată de PhG într-o manieră dependentă de concentrație. Acest rezultat a indicat că PhGs are un efect neuroprotector semnificativ asupra celulelor PC12 (Fig. 7). PhG și componentele sale echinacozidul și acteozidul salvează viabilitatea celulelor PC12 rănite. În comparație cu grupul model, tratamentul cu acteozidă a crescut semnificativ viabilitatea celulelor PC12 lezate cu A 1-42-într-o manieră dependentă de doză. PhGs și echinacozidul au crescut, de asemenea, în mod semnificativ viabilitatea celulelor PC12 rănite cu A 1-42-la toate concentrațiile testate (Fig. 8A).

În comparație cu grupul model, acteozidul a crescut semnificativ viabilitatea celulelor PC12 tratate cu H₂O₂. PhG-urile au crescut, de asemenea, viabilitatea celulelor PC12 tratate cu H₂O₂, în timp ce efectul nu a fost semnificativ la concentrații de 5 și 25 pg/ml (Fig. 8B). În plus, echinacozidul a crescut viabilitatea celulelor la 25 pg/ml.

În concluzie, actozidul, PhG și echinacozidul au exercitat efecte neuroprotectoare semnificative asupra celulelor PC12 supuse lezării cu A 1-42 sau H₂O₂.