Obacunonul atenuează fibroza hepatică prin îmbunătățirea efectelor antioxidante ale GPx-4 și inhibarea EMT

Vă rog contactațioscar.xiao@wecistanche.compentru mai multe informatii

Abstract:Obacunone, un triterpenoid de limonină extras din Phellodendronchinense Schneid sau din planta Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, provoacă o varietate de efecte farmacologice, cum ar fi cele antiinflamatorii, anti-neoplazice, antioxidare și anti-fibroză pulmonară. Cu toate acestea, efectul anti-fibrotic al oba-conului și mecanismul detaliat subiacent în fibroza hepatică rămâne neclar. Fibroza hepatică este o boală debilitantă care amenință sănătatea umană. Factorul de creștere transformator (TGF)-/P-Smad este o cale majoră de fibroză caracterizată prin transformări epiteliale-mezenchimale (EMT) și depuneri de colagen, însoțite de radicali liberi de oxigen excesivi. Nrf-2 acționează ca un regulator antioxidant cheie care conduce expresiile diferitelor gene legate de antioxidanți. Glutation peroxidaza-4(GPx{-4) este un membru al familiei glutation peroxidaza care inhibă direct oxidarea fosfolipidelor pentru a atenua stresul oxidativ. În studiul de față, ne-am propus să explorăm rolul coloanei vertebrale în modelul de fibroză hepatică de șoarece indus de tetraclorura de carbon (CCl4) și în celulele stelate hepatice (linia celulară LX2) provocate cu TGF-. Obacunona a demonstrat efecte de ameliorare puternice asupra fibrozei hepatice atât în ​​LX2 activat, cât și în țesuturile hepatice de șoareci, cu niveluri reduse de -SMA, colagen1 și vimentină. Obacunone a suprimat, de asemenea, în mod remarcabil semnalele TGF-/P-Smad și procesul EMT. Între timp, obacunona a exercitat un efect puternic anti-oxidare prin reducerea nivelurilor de specii reactive de oxigen (ROS) în ambele modele. Efectul antioxidant al coloanei vertebrale a fost atribuit activării GPx-4 și Nrf{-2. În plus, efectul terapeutic al coloanei vertebrale asupra celulelor LX2 a fost eliminat semnificativ in vitro plus cu antagonistul GPx-4 RSL3, în paralel cu nivelurile re-ridicate de ROS.puritani vitamina cAstfel, demonstrăm că coloana vertebrală este capabilă să atenueze fibroza hepatică prin îmbunătățirea semnalului GPx-4 și inhibarea căii TGF-/P-Smad și a procesului EMT.

Cuvinte cheie:coloană vertebrală;fibroză hepatică; EMT;celule stelate hepatice; GPx-4;TGF-;stres oxidativ

Vă rugăm să faceți clic aici pentru a afla mai multe

1. Introducere

Hepatita cronică este de obicei cauzată de hepatita virală, steatoza nealcoolică, hepatita alcoolică și hepatita autoimună. Leziunile hepatice persistente pot duce la fibroză hepatică sau chiar cancer hepatic, care a afectat fatal sănătatea umană [1]. Fibroza hepatică este un tip de răspuns de nevindecare a plăgii sub factorii continui de leziune caracterizat prin acumularea exagerată de matrice extracelulară (ECM) și formarea de cicatrici [2]. Celulele stelate hepatice (HSC) sunt de obicei într-o stare de repaus în condiții normale, ele s-au activat în mod aberant sub leziuni hepatice cronice și au o proliferare și secreții mari de ECM [3], denumite miofibroblaste [4]. Înțelegerea mecanismului de activare a HSC este de mare valoare pentru dezvoltarea de noi terapii pentru tratarea fibrozei hepatice.

Factorul de creștere transformator (TGF-) promovează răspunsurile inflamatorii prin stimularea expresiei interleukinei-1 (IL-1) și interleukinei-6(IL{-6) în monocite [5]. Mai mult, induce metastazele cancerului prin transformarea epitelial-mezenchimală (EMT) și scăparea imună a tumorii [6-8]. EMT se referă la un proces fiziologic dinamic în care celulele epiteliale își pierd polaritatea și se transformă în celule mezenchimale, cum ar fi fibroblaste și miofibroblaste, ducând astfel la dezvoltarea fibrozei [9]. Apariția EMT este întotdeauna asociată cu reglarea în jos a E-cadherinei și cu reglarea în sus a markerilor de celule mezenchimale, cum ar fi N-caderina și melcul [10]. Activarea TGF- -Smad este una dintre principalele căi intracelulare în EMT, precum și formarea miofibroblastelor [11].

Stresul oxidativ este considerat una dintre cauzele primare ale fibrozei cu supraproducția de specii reactive de oxigen (ROS)[12]. Nivelul ridicat de ROS cauzează daune structurale biomoleculelor, cum ar fi proteinele, lipidele și ADN-ul, ducând în cele din urmă la leziuni celulare și promovarea fibrozei [13]. Sub stres oxidativ, dimerul de Nrf-2-Keep-1 este disociat, factorul respirator-2(Nrf{-2) este transportat în nucleu și a indus expresia diferitelor enzimele antioxidante prin legarea cu elementele de răspuns antioxidant (ARE) reduc nivelurile de ROS[14]. Glutation peroxidaza-4 (GPx{-4) ​​acționează ca o proteină antioxidantă cu activitate glutation peroxidază, fiind în principal responsabilă de inhibarea oxidării fosfolipidelor și a producției de ROS în procesul de ferroptoză [15].sistancheStudiile pe șoareci au arătat că fibroza este agravată după pierderea fie a Nrf-2, fie a GPx{-4 [16,17].

Cistanche poate anti-imbatranire

În prezent, există câteva medicamente disponibile pentru tratamentul fibrozei hepatice, inclusiv cele cu proprietăți de antiinflamație [18], antioxidant [19] și agonist al receptorilor activați de proliferarea peroxizomilor (PPAR) [20]. Într-un studiu recent, prof. Yu a descoperit că pacienții cu ciroză hepatică au niveluri mai mari de oxidare a lipidelor în comparație cu martorii sănătoși din probele clinice [21]. Mai multe medicamente antioxidante, cum ar fi resveratrolul[19] și acidul ursolic |13], au demonstrat efecte bune asupra fibrozei. Aceste dovezi sugerează în mod cumulativ că antioxidarea este o strategie promițătoare pentru tratarea anti-fibrozei.

Pirfenidona (PFD) este un medicament piridinic pentru fibroza pulmonară idiopatică (IPF), în timp ce manifestă, de asemenea, un efect terapeutic bun asupra fibrozei hepatice în studii multiple [22,23]. Astfel, PFD este selectat ca medicament de control pozitiv în acest studiu. Obacunona (Oba) este un compus limonoid natural extras din plante rutacee precum Phellodendri și Dictamnus-dasycarpus [24], care posedă diferite proprietăți biologice, cum ar fi antiinflamație |25, antioxidare [26] și cele antitumorale [27]. Rapoarte recente au arătat că Oba este un agonist Nrf-2 puternic, care a atenuat eficient fibroza pulmonară prin inducerea CCL4 și deteriorarea oxidativă a celulelor MDA-MB{-231 cauzată de H,O2. Mai important, Oba este netoxic pentru șoareci [28]. Cu toate acestea, nu sunt raportate rapoarte privind efectul Oba asupra fibrozei hepatice, în special asupra oxidării antifosfolipide care mediază GPx-4, semnalelor TGF- -Smad și a procesului EMT. Aici, intenționăm să explorăm efectele Oba asupra fibrozei hepatice și să definim mecanismele moleculare care stau la baza.

2. Rezultate

2.1. Activare TGF- -Indusă de Lx-2 inhibată Oba

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Interesant este că odată cu creșterea concentrației de Oba, efectul de inhibare a a-SMA nu a crescut semnificativ (Figura 1B).ce este cistancheAstfel, am selectat o concentrație de 20 μM pentru următorul experiment, cu PFDserving ca control pozitiv. Oba a inhibat eficient nivelurile de proteine ​​de -SMA, colagen-1, vimentină și factor de creștere a țesutului conjunctiv (CTGF) (Figura 1C), în aHSCs[3,4]. În plus, Oba a redus nivelurile de expresie ARNm de -SMA, colagen -1 și vimentină (Figura 1D). Rezultatele imunofluorescenței au verificat în continuare că semnalele de colorare pozitive ale -SMA au fost în mod evident reduse de Oba (față de cea din grupul TGF-, deoarece numărul de celule roșii a scăzut după tratamentul cu Oba) în Lx-2 (Figura 1E). Aceste rezultate sugerează că Oba exercită un efect de inhibiție bun asupra activării Lx-2.

2.2. Semnalele TGF-/Smad inhibate Oba, procesul EMT și efectul antiinflamator exercitat

Pentru a defini mecanismele moleculare care stau la baza efectelor anti-fibroză de mai sus, au fost observate nivelurile de exprimare a proteinei ale receptorului TGF, P-Smad și -SMA, care au fost inhibate semnificativ de Oba în aHSC (Figura 2A). În plus, proteina nivelurile de expresie ale N-caderinei și melcului au fost reduse, în timp ce nivelul de exprimare a proteinei al E-caderinei a fost promovat (Figura 2B), indicând că și calea EMT a fost blocată [3]. În plus, am constatat că Oba a indus un nivel redus de IL-6 (Figura 2C).Cistanche anti-imbatranirePentru a evalua în continuare efectul Oba asupra inflamației, am stimulat mai întâi celulele HepG-2 (un tip de linie celulară de carcinom hepatocelular uman) cu 20 nmol CCl4, urmată de tratamentul cu 20 uM Oba. Aceste rezultate au arătat că Oba ar putea reduce nivelurile de exprimare a ARNm și proteinelor IL-6 în HepG-2stimulată cu CCl4-(Figura 2D). În general, oba a afișat multiple efecte anti-fibroză prin inhibarea semnalelor TGF-/Smad și a procesului EMT, precum și antiinflamator.

2.3. Efectele anti-fibroză ale Oba au fost dependente de capacitatea antioxidantă îmbunătățită prin activarea GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}},75 μM, viabilitatea celulară a Lx-2 a fost semnificativ scăzută; prin urmare, 0.75-μM RLS a fost selectat pentru a interveni în exprimarea GPx-4. Rezultatele Western blot au arătat că atunci când RSL3 a fost adăugat în aHSC-uri, expresia proteinei GPx-4 a fost redusă și markerii profibrotici, inclusiv -SMA și vimentin, au fost toți inversați semnificativ, indicând importanța GPx-4 în medierea efectelor anti-fibroză ale Oba (Figura 3D). Între timp, Oba a redus în mod evident nivelul ROS al aHSC-urilor de către detectoarele fluorescente ROS, iar acest efect a fost aparent blocat de RSL3 (Figura). Aceste date au indicat că nivelul scăzut de fosfolipide ROS mediat de GPx-4 a fost principalul anti-fibroză. semnalul lui Oba.

2.4. Oba atenuează fibroza hepatică de șoarece indusă de CCl4-

Fibroza hepatică indusă de CCl4-este unul dintre modelele de șoarece cel mai frecvent utilizate pentru a studia fibroza hepatică [3]. La nivel histologic, Oba a atenuat semnificativ patologia hepatică, evidențiată prin ameliorarea depunerilor de colagen indicate cu colorație Masson și colorație anti-SMA. (Figura 4A-D). Apoi, nivelurile serice ale alanin transaminaze (ALT)/aspartat transaminaze (AST) au fost determinate pentru a testa nivelurile de afectare a ficatului, în comparație cu șoarecii CCL4, grupul Oba cu doză mică și grupul PFD au scăzut semnificativ nivelurile ALT (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba a îmbunătățit expresia GPx-4, a scăzut inflamația, expresiile proteinelor legate de EMT și a redus nivelurile de oxidare a lipidelor în fibroza hepatică indusă de CCl4-

După cum se arată în Figura 5A, Oba a inhibat expresiile proteice ale IL-6 și apariția EMT la ficatul fibrotic de șoareci, cu niveluri reduse de melc și N-cadherină, dar cu niveluri mai ridicate de E-cadherină. În plus, expresiile proteice ale Nrf-2 și GPx{-4 au fost în mod evident crescute după tratamentul cu doze medii și mari de Oba (Figura 5B).cistanche benefíciosRezultatele colorării imunohistochimice (IHC) au demonstrat că, în comparație cu grupul model, numărul de celule pozitive GPx-4 (maro) din grupurile de Oba cu doze mari și medii a fost semnificativ crescut (Figura 5C, E). Apoi am testat nivelurile de stres oxidativ la ficatul de șoareci și am constatat că, în comparație cu controlul, intensitatea fluorescenței ROS a grupului model a fost aparent mai mare. Pe de altă parte, nivelul ROS a scăzut semnificativ după tratamentul cu Oba (Figura 5D, F).

3. Discuție

Fibroza este o boală intimatoare în lume. Indiferent de etiologia, inclusiv infecția cu virus, hepatita alcoolică sau nonalcoolică și răspunsurile autoimune, toate ajung la fibroză din cauza leziunilor hepatice cronice [1]. Activarea HSC este evenimentul central care stă la baza fibrozei hepatice. HSC-urile sunt activate cu producții aberante ale unei varietăți de factori fibrogenici și depuneri de ECM [2,3]. Semnalizarea canonică de activare Smad legată de TGF- -, procesul EMT, precum și inflamația cronică legată de IL-6-se raportează că sunt implicate în procesele de mai sus [3,4]. Pentru a evalua efectele anti-fibroză ale Oba asupra fibrozei hepatice, în primul rând ne concentrăm pe definirea efectelor sale asupra activării Lx-2 induse de TGF- , iar apoi pe verificarea efectelor sale anti-fibroză in vivo prin utilizarea Modelul de șoareci cu fibroză hepatică indusă de CCl4-în final.

Oba este un compus limonoid natural [24], iar efectele sale biologice includ în principal funcții antiinflamatorii [25], antioxidante [26] și antitumorale [27]. Recent, s-a descoperit că Oba este un agonist Nrf-2 puternic și eficient și exercită efecte anti-fibroză pulmonară la șoareci [28]. Cu toate acestea, dovezile încă lipsesc în ceea ce privește efectele sale anti-fibroză hepatică și mecanismele moleculare aferente. Aici, supraexpresiile de -SMA, colagen 1 și CTGF au fost toate inhibate de Oba în modelele Lx-2 stimulate cu TGF-. Semnalizarea EMT îmbunătățită este, de asemenea, suprimată eficient de Oba.

S-a confirmat că stresul oxidativ este un contributor important la fibroză [12]. Speciile reactive de oxigen (ROS) este un termen umbrelă pentru moleculele sau ionii oxidați cu activitate biologică, iar supraproducția diferitelor ROS în hepatocite poate duce la moartea acestuia și poate provoca fibroză hepatică [13]. Dimpotrivă, HSC-urile în repaus sunt activate în urma leziunii celulelor hepatice și ROS excesiv amplifică activarea HSC-urilor și termină cu fibroză hepatică [12]. Prin urmare, atenuarea stresului oxidativ exagerat devine un tratament eficient pentru fibroză.

Nrf-2 este un regulator critic al stresului antioxidant, Nrf-2 fosforilat activat este translocat în nucleu pentru a conduce la reglarea în sus a proteinelor antioxidante din aval, GST, HO1[15]. Mulți activatori chimici naturali ai Nrf2 au efecte anti-fibroză, cum ar fi terț-butilhidrochinona și curcumina. Dintre toate proteinele antioxidante, glutation peroxidaza-4(GPx{-4) este un membru al familiei glutation peroxidază (GPx{1-8) și facilitează echilibrul redox prin reducerea glutationului [ 30-32]. Este dovedit că expresiile mai mari ale glutation peroxidazei-7 au inhibat boala hepatică grasă nealcoolică prin scăderea producției de ROS [33]. GPx-4 a redus peroxidul de fosfolipide pe membrana lipidică pentru a proteja celulele de leziuni oxidative J15]. Kazuya Tsubouchi și colab. a constatat că expresia GPx-4 este redusă în țesuturile de fibroză pulmonară de șoarece induse de bleomicină, iar fibroza este mai severă atunci când gena GPx-4 este eliminată. În plus, peroxidarea lipidelor și calea TGF-/P-Smad sunt îmbunătățite semnificativ în fibroblastul pulmonar atunci când gena GPx-4 este epuizată [17]. Recent, mai multe dovezi au susținut că ROS derivate din fosfolipide sunt implicate în moartea celulelor speciale, numită ferroptoză. Inhibitorul GPx-4, RSL3, este aplicat și ca inductor de ferroptoză [21,34].

În experimentele noastre, am descoperit că Oba și-a exercitat capacitatea antioxidantă prin reglarea în sus a Nrf-2 și GPx{-4 și prin reglarea în jos a Nox-2. În special, efectul anti-fibroză al Oba a fost slăbit semnificativ, când gena GPx-4 a fost inhibată de RSL3, inhibitorul GPx{-4. În mod constant, nivelul redus de ROS prin tratamentul cu Oba a fost de asemenea luminat. Aceste observații in vitro au susținut foarte mult faptul că ROS antifosfolipide mediate de GPx-4-au fost esențiale pentru efectele protectoare ale Oba.

Pentru a valida rezultatele tratamentului anti-fibroză de mai sus cu Oba în celulele LX2, a fost examinată și fibroza hepatică indusă de CCl4-la șoareci. CCl4 este un tip de otravă hepatotropă, degradarea mediată de enzima microzomală P450 a produs radicali liberi extrem de reactivi pentru a distruge integritatea membranei celulare, la rândul său, declanșând o serie de disfuncții și leziuni hepatice, evoluând în cele din urmă în fibroză hepatică [35]. În experimentul nostru, Oba a prezentat efecte curative bune asupra fibrozei hepatice induse de CCl. A atenuat leziunile hepatice cu un nivel mai scăzut de AST, zona fasciculelor de fibre de colagen a devenit mai mică, iar expresiile proteice ale a-SMA, CTGF, colagen-1, melc, N-cadherină și IL{{10} }} au fost toate reduse. În timp ce semnalizarea anti-oxidantă, expresiile proteice ale Nrf-2 și GPx{-4 au fost toate crescute, nivelurile mai ridicate de ROS au scăzut. Aceste rezultate au confirmat în continuare efectele anti-fibroză in vitro ale Oba și semnalizarea asociată, în special inhibarea EMT și efectele antioxidante de către Nrf-2 și GPx{-4.

În rezumat, am ajuns la concluzia că Oba a atenuat activarea HSC indusă de TGF- -și fibroza hepatică indusă de CCl4-prin mai multe mecanisme. În primul rând, Oba a inhibat calea clasică de TGF-/Smad, EMT și producția de IL-6. În al doilea rând, a afișat o capacitate antioxidantă excelentă prin îmbunătățirea expresiilor Nrf-2 și GPx{-4. ROS antifosfolipide mediate de GPx-4au contribuit în principal la efectele sale anti-fibroză. Prin urmare, Oba poate servi ca regent chimic candidat pentru prevenirea și tratamentul fibrozei.

Oba a arătat un anumit efect de vindecare asupra fibrozei hepatice induse de CCl4-la șoarecii C57. Oba ar putea regla în jos expresia biomarkerilor proteinei de fibroză, cum ar fi: -SMA, CTGF, etc. Între timp, Oba a redus expresia proteinei I-6, E-caderinei etc. A fost interesant faptul că Mid-Oba prezintă semne de rezultate mai bune față de Oba scăzut și Oba ridicat în ceea ce privește expresia relativă a acestor proteine, deși nu este semnificativ statistic. Cu toate acestea, a indicat că doza optimă ar putea fi un factor critic în acest proces și vom explora acest fenomen în următorul experiment. Mai mult, am constatat că ROS și gradul de fibroză hepatică scad cu expresii de reglare ascendentă a Nrf-2 și GPx-4. Deci, credem că Oba ar putea ameliora fibroza hepatică prin reglarea Nrf-2 și GPx{-4. Cu toate acestea, PFD ar putea avea o acțiune terapeutică mai bună decât Oba atât in vivo, cât și in vitro. Cu toate acestea, Oba a fost mai bun decât PFD în ceea ce privește efectul antioxidant, este favorabil pentru creșterea posibilității de a găsi un nou medicament pentru efectul anti-fibrogenic din partea anti-oxidantă și să contribuie puțin la sănătatea umană.

4. Materiale și Metode

4.1. Produse chimice și reactivi

Oba (nr.B20553, puritate mai mare de sau egală cu 98 la sută) și RSL3 (nr. S81241, puritate mai mare de sau egală cu 98 la sută) au fost achiziționate de la YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) și dizolvate în dimetil sulfoxid (DMSO) (nr.R21950; YUANYE) la o concentrație de 72,64 mg/mL și, respectiv, 6 mmol. După sterilizarea pe filtru, soluția rezultată a fost păstrată la -20 grade C. Soluția a fost adăugată în mediul de cultură pentru a obține o concentrație finală de DMSO de<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Culturi celulare și design experimental

Linia de celule stelate hepatice umane Lx-2 și linia de celule de cancer hepatic uman Hepg-2 (toate provenite de la Departamentul de Farmacie, Universitatea de Medicină Militară a Patra, China) au fost cultivate în mediu de vultur modificat de la Dulbecco ( DMEM) suplimentat cu 10% ser fetal bovin și 1% penicilină (Thermo Fisher Scientific) și streptomicina (Thermo Fisher Scientific), și apoi menținut la 37C într-o atmosferă umidificată de 5% CO2 și 95% aer. Pentru a evalua efectul Oba asupra viabilității celulelor Lx-2, Lx-2 a fost plăcută cu 1×10* celule/godeu într-o placă de 96-godeuri și incubată timp de 24 de ore înainte de adăugare. din Oba. Apoi, Lx-2 au fost tratați cu diferite concentrații de Oba (10,20, 40,80 și 160 wM și cultivate timp de 24,48 sau 72 de ore. Viabilitatea celulară a fost testată de CCK8. Pentru a evalua efectul Oba asupra activării Lx-2, Lx-2 a fost pre-cultivat cu un mediu fără ser timp de 12 ore, urmat de stimulare cu TGF- (10ng/mL, 24 ore) și tratament cu Oba sau PFD. Pentru a evalua efectul Oba asupra inflamației, Hepg-2 a fost stimulat de CCl4(20 nm,8 h) și tratat cu 20 μM Oba. La sfârșitul culturii, celulele au fost colectate și supuse la Western blot și analiză qPCR în timp real.

4.3. Animale și design experimental

Șoarecii masculi C57 cântărind 20± 0,5 g (Centrul pentru animale de laborator al Universității de Medicină Militară a IV-a) au fost găzduiți în condiții adecvate de temperatură de 25 grade ± 2 grade și un ciclu lumină/întuneric de 12-h cu acces gratuit la apă și hrană. Fiecare experiment din acest studiu a fost efectuat în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul al IV-lea al Universității Medicale Militare pentru îngrijirea animalelor. Șoarecii c57 au fost distribuiți aleatoriu în 6 grupuri (n=6 în fiecare grup), după cum urmează: i) grup de control simulat, i) grup model, ii) grup cu Oba ridicat (CCl4 plus 6 mg/kg Oba), io )grup Oba mediu (CCl4 plus 3 mg/kg Oba）, ø）grup Oba scăzut （CCl4 plus 1,5 mg/kg Oba） și vi） Grupul PFD (CCl4＋ PFD). Grupul model a fost tratat cu CCl4 (30 procent CCl4/ulei de măsline, 5 ml/kg injecție intraperitoneală) de trei ori pe săptămână timp de o perioadă de 6-săptămână pentru a induce fibroza hepatică. Celelalte grupuri au fost hrănite cu diferite doze de Oba sau PFD și volume egale de infecție intraperitoneală CCil4 pentru o perioadă de 6-săptămână. Un volum egal de ulei de măsline în loc de CCl4 a fost administrat la C57 de către ipas un control simulat. Fiecare experiment din acest articol a fost efectuat în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul pentru animale al IV-lea al Universității Medicale Militare Îngrijire.

4.4.Western Blotting

Ficatul C57 sau celulele cultivate au fost omogenizate sau lizate în tampon RIPA utilizând aparatul de lipire a țesuturilor sau răzuirea celulelor (Service, KZ-2). Concentrația de proteine ​​a fost măsurată utilizând kitul de testare a proteinelor BCA. Lizatul a fost centrifugat (4 grade, 12, 000 rpm, 5 min), iar supernatantul a fost colectat. Etapele operaționale au fost urmate așa cum a fost raportat anterior [14]. Probele au fost scanate cu un sistem de analiză și imagistică chimiluminiscentă (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Analiză qPCR în timp real

Ficatul C57 sau celulele cultivate au fost omogenizate sau lizate în reactiv Trizol cu ​​ajutorul aparatului de lepătură a țesuturilor pentru a extrage ARN total. ARN-ul total a fost transcris invers în ADNc utilizând kitul de sinteză RevertAid First Strand cADN. -actina a fost folosită pentru referință internă. RT-qPCR a fost efectuată pe sistemul qPCR în timp real 7500 (Applied Biosystems) cu reactivii SYBR Premix Ex Taq. Primerii genelor umane utilizați au fost enumerați în Tabelul 1.

Acest articol este extras din Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules