Oligozaharidele ameliorează leziunea renală acută prin atenuarea grupului de diferențiere 44-Răspunsurile imune mediate în celulele tubulare renale

Abstract:Leziune renală acută (AKI)este un episod brusc deafectarea rinichilorcare apare frecvent la pacientii internati in spitale. Până în prezent, nu a fost dezvoltat niciun tratament ideal pentru a reduceSeveritatea AKI. Oligo-fucoidan(FC) interferează cu grupul de proteine ​​de suprafață a celulelor tubulare renale de diferențiere 44 (CD44) pentru a preveni fibroza interstițială renală; cu toate acestea, influența oligozaharidelor asupra AKI rămâne necunoscută. În acest studiu, FC, galacto-oligozaharida (GOS) și fructo-oligozaharida (FOS) au fost selectate pentru a investiga influența oligozaharidelor asupra AKI. S-a dovedit că toate cele trei oligozaharide sunt parțial absorbite de intestin. Am descoperit că oligozaharidele au redus în funcție de doză antigenitatea CD44 și au suprimat expresia indusă de hipoxie a CD44, fosfo-JNK, MCP-1, IL-1 și TNF- în NRK-52E celule tubulare renale. Între timp, transfecția siARN CD44 și inhibitorul JNK SP600125 au redus expresia indusă de hipoxie a fosfo-JNK și a citokinelor. Ligandul CD44, hialuronanul, a contracarat influența oligozaharidelor asupra CD44 și fosfo-JNK. La 2 zile după intervenția chirurgicală pentru leziuni de ischemie-reperfuzie, oligozaharidele au redus inflamația rinichilor, creatina serică, MCP-1, IL{-1 și TNF- la șoarecii AKI. La 7 zile postoperator, a fost promovată recuperarea rinichilor. Aceste rezultate indică faptul că FC, GOS și FOS inhibă cascada CD44/JNK indusă de hipoxie și citokinele din celulele tubulare renale, ameliorând astfel AKI și inflamația rinichilor la șoarecii AKI. Prin urmare,Suplimentare oligozaharidăeste o strategie potențială de asistență medicală pentru pacienții cu AKI.

O NOUĂ PLANCĂ PENTRU BOLILE DE RINCHI

Cuvinte cheie: leziune renală acută; cluster de diferențiere 44; fructo-oligozaharidă; galactooligozaharidă; oligo-fucoidan; inflamaţie

1. Introducere

Leziuni renale acute(AKI) se caracterizează printr-o scădere bruscă a ratei de filtrare glomerulară și o creștere consecutivă a creatininei serice. Această afectare este frecventă la pacienții internați în spitale și secții de terapie intensivă, în special la vârstnici. Ischemia, sepsisul și nefrotoxicitatea sunt principalele cauze ale AKI care coexistă adesea și, astfel, complică diagnosticul și tratamentul [1]. AKI severă pune pacienții externați la risc de evenimente adverse, cum ar fi boli renale cronice, evenimente cardiovasculare, cancer și infecții [2]. AKI are o dezvoltare rapidă și nu este disponibil niciun tratament eficient pentru a evita sau a reduce severitatea acesteia. Aportul de nutrienți specifici poate reduce leziunea tubulară renală în AKI [3]. Prin urmare, studierea influenței nutriției specifice asupra AKI va ajuta la ameliorarea AKI și a riscurilor însoțitoare cu care se confruntă pacienții externați.

Inflamația și recrutarea leucocitelorsunt mediatori cheie ai AKI. Rinichii, în special celulele tubulare renale, genereazăcitokine inflamatoriiîn timpul AKI, cum ar fi IL-1, IL-6, proteina chemoatractantă a monocitelor-1 (MCP-1) și factorul de necroză tumorală- (TNF-) [4,5] . Aceste citokine induc în continuare inflamația sistemică și recrutarea leucocitelor. Deși mai multe subseturi de leucocite exercită efecte protectoare asupra AKI (cum ar fi celulele T-regulatoare), majoritatea neutrofilelor, monocitelor și celulelor dendritice sunt dăunătoare pentru recuperarea AKI [6]. Inflamația sistemică este, de asemenea, dăunătoare pentru recuperarea din AKI din cauza nivelurilor ridicate de citokine [7]. Dintre citokinele secretate de rinichi, MCP-1 este responsabilă în principal de recrutarea leucocitelor, răspunde la diferite citokine, inclusiv IL{-1 și TNF- [8,9] și joacă un rol important în patogeneză. a diferitelor leziuni renale [10]. În celulele tubulare proximale umane HK-2, expresia MCP-1 indusă de hipoxie este mediată de calea c-Jun NH2- kinazei terminale (JNK) [11]. Calea p38 este, de asemenea, implicată în exprimarea MCP-1 indusă de albumină în celulele epiteliale tubulare renale [12]. Prin urmare, reglarea căilor JNK și p38 poate influența inflamația și recrutarea leucocitelor în AKI.

Oligozaharidele sunt polimeri zaharide care conțin 3-10 monozaharide care nu sunt digerabile și constituie o componentă majoră a prebioticelor totale disponibile ca aditivi dietetici [13]. Majoritatea fructo-oligozaharidelor (FOS) ingerate în corpul uman sunt complet fermentate de flora colonică, iar o mică parte este recuperată în urină [14]. Galacto-oligozaharidele (GOS) pot fi absorbite în sânge și ulterior excretate în urină [15]. Aceeași situație se aplică fucoidanului din algele marine brune [16]. Oligozaharidele absorbite pot influența reacțiile biochimice și recunoașterea celulelor [17]. Studiul nostru anterior dezvăluie că oligo-fucoidanul (FC) interferează cu interacțiunea dintre proteina CD44 de suprafață a celulei tubulare renale și liganzii săi extracelulari, prevenind astfel fibroza interstițială renală [18]. Interacțiunea dintre CD44 și liganzii săi extracelulari promovează calea de semnalizare JNK [19]. Prin urmare, ingestia zilnică de oligozaharide ar putea reduce inflamația rinichilor la pacienții cu AKI. Cu toate acestea, influența acestor polimeri asupra AKI rămâne necunoscută. Acest studiu a investigat efectul FC, FOS și GOS asupra celulelor tubulare renale tratate cu hipoxie și șoarecilor AKI cu leziuni de ischemie-reperfuzie (IRI). Rezultatele au arătat că cele trei oligozaharide au suprimat răspunsurile imune renale mediate de CD44-și au redus severitatea post-AKI. Prin urmare, utilizarea acestor polimeri ca supliment nutritiv prezintă o nouă strategie de tratament AKI

2. Materiale și Metode

2.1. Materiale

FOS (grad mediu de polimerizare < 10), GOS (grad mediu de polimerizare < 8) și FC (grad mediu de polimerizare < 5) au fost obținute de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA, Cat. Nr. F8052), Carbosynth (Berkshire, Marea Britanie, Cat. Nr. OG32134), respectiv Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan). Oligozaharidele au fost dizolvate în H2O dublu distilat și filtrate folosind filtre sterile de 0,22 um (Merck Millipore, Darmstadt, Germania). Hialuronan (HA) și toate celelalte substanțe chimice de calitate reactiv au fost obținute de la Sigma. Anticorpi împotriva JNK (sc-7345), fosfo-JNK (sc-6254), MCP{-1 (sc{-52701), IL{-1 (sc{{17} }}) și TNF- (sc-52746) au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SUA). Anticorpii împotriva p38 (9212) și fosfo-p38 (9211) au fost obținuți de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SUA). Anticorpii împotriva Ly6G (ab25377) și F4/80 (ab100790) au fost achiziționați de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie). Anticorpii împotriva HIF-1 (NB100-105) au fost achiziționați de la Novus Biologicals (Centennial, CO, SUA).

2.2. Cultura celulară

Celulele tubulare renale proximale de șobolan (NRK-52E) și linia de macrofage de șoarece RAW264.7 au fost achiziționate de la Institutul de Cercetare și Dezvoltare în Industria Alimentară (Hsinchu, Taiwan); cultivat în DMEM suplimentat cu soluție antibiotic/antifungică și ser fetal de vițel 10%; și păstrat la 37 ◦C și 95% umiditate într-un incubator cu CO2. După atingerea confluenței de 70%, celulele au fost cultivate într-un mediu fără ser și incubate peste noapte înainte de experiment. Pentru experimentul de hipoxie, celulele NRK-52E și Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, New York, NY, SUA) au fost depuse în borcane dreptunghiulare (Mitsubishi Gas Chemical America), iar întreaga instalație a fost plasată într-un 37 ◦C incubator timp de 4 ore. Celulele au fost apoi cultivate peste noapte în condiții normale.

2.3. Analiza Western Blot

Pe scurt, 15 µg de lizat de proteină NRK-52E au fost aplicate pe fiecare bandă, iar rezultatele au fost analizate prin Western blot. Nivelurile relative ale benzilor de proteine ​​au fost cuantificate din cinci experimente independente prin software-ul Quantiscan de la Biosoft (Cambridge, Marea Britanie).

2.4. Scurtă interferență (si)ARN-ului de transfecție a CD44

ARNsi CD44 de șobolan (4390771) a fost achiziționat de la Thermo Scientific (Waltham, MA, SUA). După ce au crescut la o confluență de 70%, celulele au fost transfectate cu siRNA folosind reactivul de transfecție Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) prin instrucțiunile Facturerului Manu.

2.5. Test de proliferare celulară

După ce celulele hipoxice NRK-52E au fost cultivate timp de 24 de ore, același mediu a fost folosit pentru a cultiva celule RAW264.7 într-o placă de 96-godeuri (2000 celule/godeu). După 24 de ore de incubare, proliferarea celulelor RAW264.7 a fost analizată utilizând un kit de testare SRB (Abcam, Cat. Nr. ab235935) conform instrucțiunilor producătorului.

2.6. Teste de antigenicitate CD44

CD44 recombinant de șobolan a fost obținut de la R&D Systems (Minneapolis, MN, SUA, Cat. Nr. 6577-CD) și a fost folosit pentru a produce o reacție de legare cu HA conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 20 ng/mL CD44 recombinant de șobolan a fost amestecat cu diferite concentrații de FC, FOS sau GOS timp de 10 minute pentru a investiga influența oligozaharidelor asupra antigenității CD44. Amestecuri au fost analizate folosind un kit ELISA CD44 (Abcam, Cat. Nr. ab213928) conform instrucțiunilor producătorului.

2.7. Animale experimentale și IRI renal

Șoarecii masculi 129S1/SvImJ în vârstă de opt săptămâni au fost achiziționați de la Lasco Technology (Taipei, Taiwan). Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor Experimentale ale Universității Medicale din Taipei (nr. aprobare LAC-2019-0511) și formate de Ghidul NIH pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator. Pentru inducerea IRI, șoarecii (cu o greutate de 21-23 g) au fost supuși la clamparea bilaterală a pediculului renal timp de 30 de minute prin efectuarea unei incizii de flanc [20]. Șoarecii au fost anesteziați prin anestezie prin inhalare cu izofluran preoperator. Șoarecii operați de simulare au suferit o operație similară, cu excepția prinderii pediculilor renali. Toți șoarecii au fost hrăniți cu oligozaharide prin gavaj oral cu 1 zi înainte până la 2 zile după intervenția chirurgicală IRI. Șoarecii experimentali au fost împărțiți în următoarele cinci grupuri cu n=8 pentru rezultatele în ziua 3 și ziua 7: (1) grup simulat; (2) grupa AKI; (3) grup AKI hrănit cu FC (10 mg/kg/zi); (4) grup AKI hrănit cu FOS (10 mg/kg/zi); și (5) grup AKI hrănit cu GOS (10 mg/kg/zi). Șoarecii au fost sacrificați la 3 sau 7 zile după operație și sângele a fost colectat și analizat folosind un analizor biochimic și truse ELISA. Nivelul creatininei serice al fiecărui șoarece a fost analizat pentru a evalua dezvoltarea AKI. Morfologia rinichilor a fost examinată prin colorare periodică cu acid Schiff (PAS) și colorare imunohistochimică (IHC) în secțiuni de parafină de 2 µm fixate cu formol.

2.8. Colorarea imunohistochimică

Țesuturile renale au fost fixate cu paraformaldehidă tamponată 4%, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 2 µm pentru colorare cu kiturile UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific, Fremont, CA, SUA) și hibridizare cu anticorpul principal conform instrucțiunilor producătorului. .

2.9. Colorarea PAS

Secțiunile de rinichi au fost colorate cu un kit de colorare PAS (Abcam, Cat. nr. ab150680) în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

2.10. Test ELISA

Mediul de cultură de celule NRK-52E și probele de ser ale șoarecilor experimentali au fost colectate și analizate folosind kitul ELISA MCP{-1 (Abcam, Cat. nr. ab208979) și IL-1 Kit ELISA (Abcam, Cat. Nr. ab197742). Probele de ser au fost, de asemenea, analizate utilizând un kit ELISA TNF (R&D Systems, Cat. Nr. MTA00B) și un kit ELISA cu lipocalină asociată gelatinazei neutrofile (NGAL) (R&D Systems, Cat. Nr. MLCN20) de către instructiunile producatorului.

2.11. Teste statistice

Diferențele semnificative între cele două grupuri au fost determinate folosind testul t Student. Diferențele au fost considerate semnificative pentru valorile p<0.05

3. Rezultate

3.1. Oligozaharidele inhibă creșterea CD44 și a citokinelor în celulele hipoxice NRK-52E

Expresia CD44 în celulele NRK-52E tratate cu FC, FOS și GOS a fost mai întâi monitorizată pentru a evalua influența oligozaharidelor asupra celulelor tubulare renale. Expresia CD44 indusă de hipoxie a fost inhibată de toate cele trei oligozaharide în intervalul 0.{05–0,5 mg/mL (Figura 1A). Prin urmare, doza de oligozaharidă de 0,1 mg/mL a fost utilizată în următoarele experimente cu celule. În sistemul pregătit, tratamentul cu hipoxie a indus în mod remarcabil expresia markerului de hipoxie HIF-1 în celulele NRK-52E, indicând faptul că celulele se aflau într-o stare de hipoxie (Figura 1B). Hipoxia a reglat în creștere nivelurile de JNK fosforilat, MCP-1, IL{-1 și TNF-, dar nu și în celulele tratate cu oligozaharide (Figura 1B, C). Expresia JNK a crescut în celulele hipoxice, dar nu și în celulele tratate cu FC sau tratate cu FOS. GOS nu a afectat expresia JNK în celulele hipoxice, dar a suprimat reglarea în sus a JNK fosforilată. Prin urmare, oligozaharidele pot inhiba transducția semnalizării JNK indusă de hipoxie și exprimarea citokinelor în celulele tubulare renale. Deși FC și GOS au suprareglat fosforilat p38 în celulele hipoxice, expresia acestei proteine ​​nu a crescut în celulele hipoxice. Această constatare indică faptul că p38 nu joacă un rol cheie în răspunsurile induse de hipoxie în celulele NRK-52E.

3.2. CD44 și JNK joacă un rol critic în creșterea citokinelor în celulele hipoxice NRK-52E

Expresia CD44, JNK fosforilată și citokinele în celulele tubulare renale au fost toate afectate de oligozaharide, dar asocierea lor rămâne de elucidat. Pentru a investiga rolul CD44 în transducția semnalizării JNK și exprimarea citokinelor în celulele hipoxice, celulele NRK-52E au fost transfectate cu diferite doze de siARN CD44. CD44 siRNA la 50 și 100 PM a blocat eficient expresia CD44 crescută de hipoxie și a inhibat semnificativ creșterea indusă de hipoxie a nivelurilor de JNK fosforilat, MCP- 1, IL-1 și TNF- (Figura 2A). Influența blocării CD44 asupra expresiei JNK a fost legată de dozele de siARN. Expresia JNK în celulele hipoxice a fost indusă de ARNsi CD44 la 50 pM dar inhibată la 100 pM. Ambele doze au suprimat reglarea în sus a JNK fosforilată. Inhibitorul selectiv pentru JNK, SP600125, a redus semnificativ expresia MCP-1, IL{-1 și TNF- în celulele hipoxice NRK-52E (Figura 2B). Aceste rezultate sugerează că efectul inhibitor al transfecției siARN CD44 asupra citokinelor induse de hipoxie este atribuit unei reduceri a JNK fosforilată.

Figura 1. Efectul inhibitor al oligozaharidelor asupra transducției semnalului CD44 în celulele hipoxice NRK-52E. Celulele au fost pretratate cu FC, FOS sau GOS timp de 30 min și apoi supuse culturii hipoxice. Expresia proteinei a fost analizată prin Western blot. (A) Efectele dependente de doză ale oligozaharidelor asupra expresiei CD44. (B) Efectul oligozaharidelor asupra semnalelor legate de CD44-. Concentrația de oligozaharide a fost stabilită la 0,1 mg/mL. Creșterile relative ale benzilor de proteine ​​sunt, de asemenea, prezentate sub formă de diagramă cu bare (C). Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SD (n=4).

Figura 2. Rolul CD44 și JNK în răspunsurile inflamatorii induse de hipoxie în celulele NRK-52E. Expresia proteinei a fost analizată prin Western blot. (A) Efectul inhibitor al transfecției siARN CD44 asupra JNK și citokinelor fosforilate. (B) Efectul inhibitor al SP600125 asupra citokinelor. Celulele au fost pretratate cu 20 pM SP600125 timp de 30 min înainte de tratamentul hipoxiei. Creșterile relative ale benzilor de proteine ​​sunt, de asemenea, prezentate sub formă de diagramă cu bare. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SD (n=4).

3.3. Secreția de citokine indusă de hipoxie în celulele tubulare renale promovează proliferarea macrofagelor

Inflamația este un mediator al leziunii renale în AKI. Prin urmare, a fost examinată influența plimbărilor cu oligozac asupra leucocitelor. Figura 3A arată că FC, FOS și GOS nu au influențat proliferarea celulelor macrofage RAW264.7. Proliferarea celulelor RAW264.7 a fost promovată de mediul de cultură 24- pentru celulele hipoxice nrk -52 E (Figura 3B), dar nu de mediu pentru hipoxic NRK -52 E celule tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele NRK -52 e tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu celulele tratate cu cu oligozaharide. Primul a avut niveluri MCP-1 și IL-1 mai mari decât cel din urmă (Figura 3C, D). Toate cele trei oligozaharide au redus semnificativ MCP-1 și IL{-1 în mediul de cultură al celulelor hipoxice NRK{-52E. Prin urmare, FC, FOS și GOS pot reduce expresia și secreția de citokine în celulele tubulare renale hipoxice și, în consecință, diminuează inflamația cauzată de celulele tubulare renale rănite.