Alterarea frecvenței optogenetice a oscilațiilor teta hipocampului disociază recuperarea memoriei de lucru din codurile spațio-temporale hipocampice Partea 3

Stimularea optogenetică a neuronilor MS duce la o sincronie non-fiziologică theta

În mod surprinzător, stimulările optogenetice de 8 Hz care sunt asociate cu ritmul oscilațiilor theta au condus la scăderea performanței atunci când sunt aplicate fie în timpul codificării, fie regăsării memoriei episodice în sarcina NPOR, precum și regăsirea memoriei de lucru spațiale în sarcina DNMTS. Pentru a înțelege în continuare efectele ritmului theta asupra fiziologiei hipocampului, am analizat blocarea de fază a oscilației theta înainte și în timpul stimulărilor optogenetice de 8 Hz (Figura suplimentară 7a) și am descoperit că o astfel de stimulare a condus la creșterea sincroniei de fază între epocile de stimulare (Figura suplimentară 7b). În plus, am analizat corelația încrucișată a oscilațiilor theta de-a lungul CA1 dorsal (~ 1 mm distanță între electrozi de-a lungul axei septotemporale (Figura suplimentară 7c) și am constatat că ritmurile theta de stimulare la 8 Hz au condus la o corelație încrucișată crescută între cei doi electrozi ( Suplimentar Fig. 7d).

Genetica este știința care studiază moștenirea și variația genetică, iar memoria este un aspect de mare îngrijorare. Deci, ce legătură are genetica cu memoria? Acest articol va explora problemele legate de memorie dintr-o perspectivă genetică.

În primul rând, știm că genele genetice sunt baza dezvoltării fizice și intelectuale umane și dacă aceste gene sunt superioare va afecta memoria oamenilor. Cele mai recente cercetări arată că IQ-ul și memoria oamenilor sunt afectate de factori genetici. Cercetările arată că genele genetice joacă un rol crucial în inteligență și memorie. Prin urmare, unii oameni se nasc cu amintiri mai puternice, în timp ce alții trebuie să muncească din greu și să se antreneze pentru a-și îmbunătăți memoria.

În al doilea rând, factorii de mediu sunt, de asemenea, factori importanți în dezvoltarea memoriei. Nu avem nevoie doar de sprijinul genelor genetice, dar trebuie și să ne îmbunătățim memoria prin pregătire științifică și obiceiuri bune de viață. De exemplu, putem insista să facem exerciții în fiecare zi, să dormim suficient, să respectăm principiile de potrivire a mesei etc., ceea ce ne poate ajuta la îmbunătățirea funcției creierului și a memoriei.

În cele din urmă, oamenii obișnuiți, nu prea subliniază influența factorilor genetici asupra dezvoltării memoriei. Deoarece factorii genetici nu sunt absoluti, memoria și inteligența oamenilor se pot îmbunătăți în continuare prin îmbunătățirea eforturilor și antrenamentului lor. Ar trebui să menținem întotdeauna o atitudine pozitivă și continuă de învățare și să ne explorăm și să ne dezvoltăm în mod constant potențialul de memorie. Cred că numai așa putem deveni mai deștepți și putem avea un sentiment mai mare de împlinire. În concluzie, relația dintre genetică și memorie este foarte strânsă, dar nu ar trebui să subliniem prea mult factorii genetici, ci ar trebui să ne îmbunătățim constant memoria și inteligența prin auto-îmbunătățire și antrenament.

Se poate observa că trebuie să ne îmbunătățim memoria. Cistanche deserticola poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche deserticola este un material medicinal tradițional chinezesc cu multe efecte unice, dintre care unul este îmbunătățirea memoriei. Eficacitatea cărnii tocate vine din diferitele ingrediente active pe care le conține, inclusiv acid, polizaharide, flavonoide etc. Aceste ingrediente pot promova sănătatea creierului în diferite moduri.

Faceți clic pe cunoaște 10 moduri de a îmbunătăți memoria

Discuţie

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 de neuroni în timp ce efectuează stimularea optogenetică a neuronilor MS cu o rezoluție sub-secundă pentru a controla ritmurile theta și a evalua rolul lor în fiziologia și memoria hipocampului. Foarte important, folosind o opsină excitatorie și stimulări amestecate sau de 8 Hz, am reușit să desființăm sau, respectiv, să stimulăm în mod consecvent și robust teta hipocampului.

În comparație cu inhibarea MS folosind fie o opsină inhibitoare, fie compuși farmacologici (de exemplu, muscimol), abordarea noastră permite o comparație în cadrul subiectului a două stări opuse (ritmul vs abolit theta) menținând în același timp nivelurile de activitate în celulele MS-PV. Am combinat sarcina de urmărire liniară bazată pe atone care, împreună cu abordările teoretice informaționale, ne-au permis să descurcăm codurile hipocampale spațiale și temporale. Această metodă atenuează necesitatea unor praguri arbitrare, permițând o abordare standardizată a analizei imagistice a calciului. În timp ce o mare parte a neuronilor piramidali CA1 exprimau un amestec de coduri spațio-temporale, ne-am concentrat analizele asupra neuronilor atonați în mod specific la locul, timpul sau distanța parcursă.

În timp ce codificarea spațială a fost investigată pe larg în CA1, codurile temporale și de distanță au câștigat recent mai mult interes. Codurile temporale28,35–37 și distanță37 au fost extrase prin fixarea indicațiilor vizuale spațiale sau extrase analitic folosind modele liniare generalizate în paradigmele realității virtuale26,27,38. Aici, propunem o abordare pentru a dezlega codurile spațiale, temporale și de distanță folosind o abordare teoretică a informațiilor care, împreună cu sarcina noastră de alternanță indicată, permite analiza codurilor spațio-temporale și multiplexate din lumea reală la animalele care se mișcă liber. O cantitate mare de neuroni piramidali CA1 codifică informații multiplexate despre locație, distanță și timp, așa cum a fost raportat anterior26,27,38, în plus față de semnalele de auto-mișcare, cum ar fi accelerația, viteza și orientarea60.

Am constatat că amestecul de frecvență și stimulările optogenetice de 8 Hz au abolit drastic sau, respectiv, au stimulat ritmurile theta și au condus la scăderea activității generale într-o subpopulație de celule piramidale CA1, fără a provoca modificări semnificative în activitatea celulelor locului, similar cu rapoartele anterioare folosind fie inhibarea farmacologică36, 46,47 sau stimularea optogenetică9,48 a SM sau intrări septale în hipocamp. Deoarece neuronii MS sunt cunoscuți a fi motorul principal al oscilațiilor hipocampice, ne așteptam ca stimularea MS să fie asociată cu activitatea celulară întreruptă în timp sau la distanță în condiții de ritmuri theta reduse, dar nu au avut loc modificări atunci când theta a fost abolit sau stimulat. În plus, ritmul oscilațiilor hipocampului la 8 Hz nu a condus la modificări ale calității codurilor spațiale raportate anterior9 și nu a modificat codurile temporale, așa cum s-a observat în paradigma noastră comportamentală.

Deși s-a raportat că celulele de timp (dar nu de loc) ar putea depinde direct de intrările cortexului entorrinal medial (MEC)61, dovezile experimentale recente sugerează că leziunile MEC nu duc la nicio modificare în fiziologia celulelor temporale a hipocampului62. În special, o investigație mai recentă a constatat că ritmul optogenetic al MS nu a perturbat codurile spațiale ale celulelor grilă din cortexul entorinal63, sugerând în continuare că activitatea MS nu este direct implicată în codurile spațiale din formarea hipocampului. Împreună cu rezultatele noastre, acest lucru indică faptul că codurile temporale ar putea fi fie rezultatul calculelor dependente de MS în cortexul entorinal63 (1) fie generate intrinsec în hipocampus în sine (2).

În timp ce studiile timpurii au descoperit că MS a jucat un rol esențial în menținerea celulelor timpului și în susținerea memoriei de lucru36, dovezile recente experimentale arată că contribuția exactă a celulelor timpului la performanța memoriei de lucru ar putea fi mai mică decât se credea anterior62. Deoarece neuronii MS-PV mențin probabil niveluri semnificative de activitate în timpul stimulării optogenetice cu frecvență (spre deosebire de abordările de inhibiție), rezultatele noastre susțin puternic rolul activității septului cronometrat cu precizie în susținerea memoriei de lucru, ipotetizat anterior. Deși am observat o performanță redusă a memoriei la utilizarea stimulării optogenetice în timpul recuperării, stimularea în timpul fazei de codificare a sarcinilor DNMTS nu a fost asociată cu o memorie redusă în sarcina DNMTS. Stimularea taoscilațiilor la 8 Hz fie în timpul fazei de codificare, fie în timpul fazei de recuperare a sarcinii NOPR a dus la o recuperare afectată de memorie. Analizele noastre electrofiziologice arată în continuare că o astfel de stimulare a determinat ca regiunile îndepărtate ale CA1 dorsal să fie antrenate în aceeași fază, cu blocare non-fiziologică. Deși nu am investigat în mod direct relația cauzală dintre schimbările de fază și performanța memoriei, s-a constatat că spiketiming și precesia de fază sunt, de asemenea, asociate cu funcția modificată a memoriei de lucru, în ciuda faptului că a lăsat codul intact64. Mai mult, blocarea de fază a neuronilor piramidali la taoscilații s-a dovedit anterior a fi un predictor al performanței memoriei65.

În special, o limită a abordării noastre de a stabili proprietățile de reglare temporală și distanță este că necesită o eșantionare de patru ori mai mare decât o pistă liniară obișnuită, ceea ce crește șansele de fotoalbire atunci când se adaugă condiții de stimulare la cronologia experimentală. În timp ce am descoperit că codurile spațiale au rămas neafectate de stimulările optogenetice în cadrul aceleiași sesiuni, hardware-ul de imagistică mai recent, care include senzori cu sensibilitate crescută, ar putea ajuta la prevenirea albirii foto și ar permite sesiuni de înregistrare mai lungi, astfel eșantionarea celulelor temporale și la distanță împreună cu stimulările. De asemenea, am constatat că grupul de neuroni care codifică în mod semnificativ și specific doar o variabilă este mic în comparație cu numărul de neuroni conjunctivi, ceea ce face ca cerințele de eșantionare pentru acești neuroni foarte specifici să fie mult mai mari.

Oferim dovezi experimentale că manipularea MS nu modifică viteza locomotorii și că, dimpotrivă, viteza locomotorii dictează frecvența theta. Chiar dacă codurile de loc și de timp au fost păstrate în timpul stimulărilor noastre cu MS, o parte (~ 6%) din celule au fost modulate direct și ar putea explica tulburările de memorie observate în testele noastre comportamentale. S-a raportat anterior că interneuronii PV din hipocampus fac parte dintr-un microcircuit esențial în reglarea consolidării memoriei66,67, iar manipulările noastre optogenetice ar putea fi asociate cu atenuarea unei părți din aceste celule. Mai mult decât atât, deși nu am observat modificări în benzile de frecvență, altele decât teta, nu putem exclude faptul că sincronizarea vârfului neuronului piramidal CA1 ar putea fi modificată drastic la amestecarea oscilațiilor theta, în timp ce stimularea de 8 Hz s-a dovedit că nu duce la creșterea activității hipocampului18, ceea ce ar putea explica efectele diferențiale ale acele modele de stimulare a performanței memoriei de lucru. Deficiențele de memorie pe care le-am observat au fost probabil non-colinergice: în primul rând, în experimentele noastre imunohistologice, nu am găsit practic nicio expresie a lui ChrimsonR în neuronii ChAT ai MS. În al doilea rând, stimulările noastre optogenetice nu au fost asociate cu modificări ale ondulațiilor hipocampale, în timp ce rapoartele anterioare indică faptul că stimularea Neuronii ChAT sunt asociați cu o frecvență de ondulare redusă45,57. Transfecția ChrimsonR a neuronilor MS VGLUT2 este, de asemenea, puțin probabilă, deoarece activarea acestor neuroni este asociată cu o creștere directă a activității locomotorii 68, pe care nu am observat-o.

Deși aranjarea temporală precisă a vârfurilor piramidale CA1 ar putea explica, cel puțin parțial, efectele stimulării MS asupra memoriei, ar trebui luate în considerare mecanismele alternative. În special, pe lângă hipocamp și cortexul entorrinal, MS PVneuroni se proiectează în cortexul retrosplenial3 și ar putea fi responsabili pentru unele dintre deficiențele de memorie observate aici.

În rezumat, folosind imagistica cu calciu, optogenetică și electrofiziologie, am constatat că ritmurile theta pot fi stimulate sau eliminate folosind stimularea SM. O astfel de stimulare a afectat recuperarea memoriei episodice și de lucru. Aceste efecte au fost non-colinergice și nu au perturbat activitatea de ondulare a hipocampului. În cele din urmă, în timp ce o mică parte a neuronilor hipocampali au răspuns direct la stimularea optogenetică a MS, celulele de loc, timp și distanță nu au fost perturbate de manipulările oscilațiilor theta. Împreună, aceste rezultate sugerează că, în timp ce intrarea MS în hipocamp joacă un rol esențial în memorie, codurile multiplexate din neuronii piramidali CA1 ar putea să nu fie substratul direct pentru astfel de funcții.

Metode

Animale

Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea McGill și de Consiliul canadian pentru îngrijirea animalelor (protocolul 2015-7650). Un total de n=41 masculi (n=20) și femele (n=21) cu vârsta de 8-16 săptămâni, B6;129P2 PV-Cre șoareci (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) au fost utilizate în acest studiu. n=5 șoareci au fost folosiți pentru combinarea optogenetică cu imagistica cu calciu; n=3 șoareci au fost implantați pentru controlul imagistic cu calciu, optogenetică și controale electrofiziologice; n=4 șoareci au fost utilizați în studii electrofiziologice; n=29 șoareci au fost transfectați și implantați pentru teste comportamentale. Șoarecii au fost găzduiți individual pe un ciclu lumină/întuneric de 12-h la 22 de grade și 40% umiditate cu hrană și apă la liber. Toate experimentele au fost efectuate în timpul porțiunii de lumină a ciclului lumină/întuneric.

Vectori virali adeno-asociați

Virusul adeno-asociat AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene # 100834, obținut de la Universitatea din Pennsylvania Vector Core) a fost utilizat în toate experimentele de imagistică cu calciu. Virusul adeno-asociat (AAV) al serotipului dj (capsidă hibridă creată din opt serotipuri AAV diferite) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato au fost obținute de la Vector Core Facility de la Oregon Health and Science University din Portland, Oregon. Deși este o genă de menaj, nu am observat transfecția în celule colinergice (a se vedea „Rezultate” și Fig. 2b-e). Un construct eYFP fără secvența ChrimsonR a fost folosit ca control (denumit control YFP în acest manuscris).

Proceduri chirurgicale

Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (5% inducție, 0.5-1% întreținere) și plasați într-un cadru stereotaxic (David Kopf Instruments). Temperatura corpului a fost menținută cu un tampon de încălzire, ochii au fost hidratați cu gel (Optixcare) , iar Carprofen (10 ml/kg) a fost administrat subcutanat. Craniul a fost complet curățat de tot țesutul conjunctiv și s-au efectuat mici craniotomii folosind un burghiu dentar pentru injecția ulterioară sau implant.

Injecții virale. Toate injecțiile virale au fost efectuate folosind o pipetă de sticlă conectată la un injector Nanoject III (Drummond). 500 nl de AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (sau control eYFP) au fost livrate în MS la o rată de 1 nL/s, la următoarele coordonate bazate pe atlasul stereotaxic al șoarecelui de referință69 (distanța de Bregma în mm): anteroposterior (AP) 0,85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) -4,50 folosind un unghi de 5 grade în planul ML. După operație, animalele au fost monitorizate până la recuperare.

Implant de fibra optica. La două săptămâni după injectare, șoarecii au fost anesteziați pentru implantare urmând aceeași procedură chirurgicală. Fibră optică cu diametrul de 200 μm cu ferulă ceramică (Thorlabs) a fost implantată la aceleași coordonate. Implanturile au fost cimentate la loc folosind C&B-Metabond® (Patterson dental). Lacul de unghii negru a fost aplicat peste cimentul dentar pentru a bloca emisia de lumină în timpul stimulării optogenetice.

Implanturi cu electrozi. O serie de 7 microelectrozi de wolfram (~ 1 MΩ impedanță) a fost coborâtă în CA1 dorsal care se întinde prin stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad) și stratum lacunosummoleculare (lm). Șuruburile plasate în os deasupra cortexului frontal și cerebelului au servit drept bază și, respectiv, referință. După plasarea electrodului, împământului și de referință, a fost aplicat ciment dentar pentru a fixa permanent implantul pe craniu.

Implant pentru imagistica cu calciu. Am injectat virusul AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL la 1 nl s-1) în hipocampul CA1 folosind următoarele coordonate: anteroposterior (AP) - 1.86 mm din bregma, mediolateral (ML) 1.5 mm, dorsoventral (DV) 1,5 mm. La două săptămâni după injectare, șoarecii au fost anesteziați cu izofluran și craniul a fost curățat. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Imagistica de calciu și înregistrări electrofiziologice simultane. Pentru a controla efectele implanturilor GRIN asupra tetei hipocampice, precum și interacțiunea între mini-scop și luminile de excitație optogenetice, am atașat micro-electrozi de tungsten la lentilele GRIN. În acest scop, am plasat lentilele GRIN pe orizontală sub un microscop cu mărire redusă într-un mediu fără praf. Un microelectrode tungsten a fost plasat ușor pe marginea superioară a lentilei GRIN folosind un micromanipulator. Am folosit diametrul cunoscut al lentilei GRIN ca unitate de referință pentru a estima proeminența dorită a electrodului (~ 50 µm, evaluată în continuare digital după realizarea unei microfotografii a preparatului) după coordonatele noastre de implantare planificate. Cantități mici (~50 µL) de superglue au fost depuse pe marginea superioară a lentilei GRIN cu electrodul în poziție și lăsate să se usuce timp de ~10 minute, înainte de a aplica următorul strat de adeziv. Au fost folosite cinci straturi subțiri pentru a menține electrodul atașat lentilei GRIN. După implantarea acestor ansambluri de electrozi GRIN folosind protocolul descris mai sus, firele proeminente au fost ușor îndoite și ascunse sub un capac de protecție (1-1,5 cm înălțime) extras din pera pipetei de aspirație manuală ca înlocuitor pentru Kwik-Sil.

Proceduri comportamentale in vivo

Obișnuirea. Șoarecii au fost manipulați ușor timp de aproximativ 5 minute într-o săptămână, cu o obișnuință progresivă cu procedura de conectare (fibră optică, miniscop și dispozitive electrofiziologice preamplificate). Animalele au fost apoi programate cu apă (acces de 2 ore pe zi).

Înregistrări cu miniscop. Miniscoapele (V3) au fost asamblate folosind instrucțiuni open-source (miniscope.org). Datele de imagistică au fost achiziționate folosind un senzor de imagine CMOS (Aptina, MT9V032) și multiplexate printr-un cablu coaxial ușor. Datele au fost achiziționate utilizând o cutie de achiziție de date (DAQ) conectată printr-un controler gazdă USB (Cypress, CYUSB3013). Comportamentul animalului a fost înregistrat folosind o cameră web de calitate pentru consumatori (Logitech) montată deasupra mediului. Calciul și datele comportamentale au fost înregistrate folosind miniscope.org, software-ul de achiziție personalizat DAQ sursă. DAQ-ul a dobândit simultan fluxuri de imagini comportamentale și celulare la 30 Hz ca fișiere necomprimate.avi de 1000 de cadre pentru sesiuni de înregistrare de 15-minute, împreună cu marcajele de timp corespunzătoare pentru a permite alinierea temporală precisă a datelor de imagini comportamentale și de calciu.

Înregistrări electrofiziologice in vivo. După o săptămână de recuperare postchirurgicală și o săptămână de obișnuire cu configurația de legare, a fost înregistrată LFP de la șoarecii implantați. Toate semnalele înregistrate de la electrozii implantați au fost amplificate de preamplificatorul de legătură înainte de a fi digitalizate la 22 kHz folosind un sistem de înregistrare digitală (Neuralynx, SUA). Înregistrările fiecărui semnal de canal au fost salvate împreună cu înregistrările video și semnalele TTL de la dioda laser pentru analiza ulterioară.

Stimulare optogenetică. Stimularea cu laser a fost furnizată printr-un cablu de fibră optică (200 μm diametru) folosind o sursă de lumină cu fibre cu diodă laser (lentile dorice). Intensitatea luminii a fost calibrată și lungimea de undă corectată utilizând pachetul Power Meter cu consola PM100D și S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Fiecare stimulare de stimulare (inclusiv 8 Hz) a fost efectuată folosind impulsuri pătrate de 5 ms. Pentru a aplica stimularea cu lumină amestecată, am folosit un microcontroler Arduino pentru a genera un semnal de oscilație de zgomot alb introdus direct în intrarea analogică a driverului diodei laser. Pentru a efectua stimularea cu frecvență selectată aleatoriu, am folosit un protocol standard de 5 s ON, 5 s OFF, dar pentru fiecare epocă de stimulare, am folosit un microcontroler Arduino pentru a selecta aleatoriu o frecvență de stimulare în banda theta. La aplicarea stimulării optogenetice în timpul comportamentului, o bucată liberă de tub termocontractabil a fost montată în jurul joncțiunii dintre cordonul de corecție și implantul de virolă de șoarece pentru a limita emisia de lumină vizibilă. Intensitățile luminii sunt exprimate ca putere nominală, măsurată la vârful ansamblului implant-cord de fibră optică (înainte de plasarea chirurgicală) și corectate pentru lungimea de undă corespunzătoare.

Teste comportamentale

Pistă liniară cu ton secvenţial. Șoarecii erau programați pentru apă și puteau accesa apă doar timp de 2 ore pe zi, între orele 18:00 și 20:00. Pentru a dezlega codurile spațiale, temporale și de distanță, construim o pistă liniară lungă de 134 cm folosind cărămizi Lego® de culoare gri mediu, care permite modificări și implementări ușoare fără trebuie să modifice permanent structura labirintului. Senzorii piroelectrici au fost plasați la fiecare capăt al pistei liniare și au fost conectați la un microcontroler Arduino. Fiecare detectare a declanșat un nou ton în secvență, indicând progresul către livrarea. Următoarele tonuri au fost utilizate și furnizate utilizând difuzorul apiezo: bipuri de 1 s la 2000 Hz, bipuri de 250 ms la 3000 Hz și ton continuu la 4000 Hz. Când a fost declanșat ultimul ton continuu, o recompensă (10% zaharoză în apă) a fost livrată la capătul de pornire al pistei liniare în capacul unui tub Falcon de 15 ml. Schimbările în direcția de rulare înainte de declanșarea următorului ton au fost considerate erori și nu au declanșat livrarea recompensei. Performanța a fost măsurată prin numărul de încercări corecte (fără erori) împărțit la numărul total de încercări.

Recunoașterea locului obiect nou. În prima zi, șoarecilor li s-a permis să exploreze în mod liber un câmp deschis gri închis de 45 × 45 cm care conținea semnale vizuale (rețele mari orizontale și verticale albe) pe pereții săi timp de 10 minute. În a doua zi, două obiecte identice (baza mâinii de ajutor) au fost prezentate timp de 10 minute. În a treia zi, șoarecilor li s-a permis să exploreze același câmp deschis, în timp ce locația unuia dintre cele două obiecte a fost deplasată. Pentru a controla potențialele distorsiuni ale preferințelor spațiale, atât poziția inițială, cât și poziția deplasată a obiectelor, au fost randomizate. Șoarecii au atribuit o ordine aleatorie de testare care a fost păstrată identică pe parcursul celor trei zile de testare. Comportamentul a fost înregistrat cu o cameră video (Logitech) și analizat offline. Analiza comportamentală a fost efectuată oarbă la genotip și tratament. Explorările obiectelor au fost definite ca epoci în care șoarecii își au nasul la 1 cm de un obiect. RI a fost calculat după cum urmează:

Întârzierea automată care nu se potrivește cu sarcina eșantion. Șoarecii au fost programați cu apă și antrenați într-un labirint în T continuu pentru o sarcină întârziată care nu se potrivește cu eșantionul. Pe scurt, fiecare studiu a fost împărțit în două faze: eșantion și test. În faza de probă, un braț a fost blocat și șoarecii au fost forțați să exploreze brațul opus, unde au primit o recompensă de 50 µL de apă zaharoză 10%. După finalizarea fazei de probă, șoarecii au fost supuși unei întârzieri (10 s) în compartimentul de pornire. Apoi, în timpul fazei de testare, ambele brațe au putut fi explorate, dar numai brațul opus (neexplorat) a fost momeal, astfel încât șoarecii au trebuit să alterne locații între fazele de probă și de testare. Șoarecii au fost supuși la 10 încercări (probă + test) pe zi, timp de 10 zile consecutive, iar rata zilnică de succes a fost calculată ca numărul de încercări corecte împărțit la numărul total de încercări.

Analize histologice post-mortem

După finalizarea testării comportamentale, șoarecii au fost anesteziați profund cu un amestec de ketamina/xilazină/acepromazină (100, 16, 3 mg/kg, respectiv, injecție intraperitoneală) și perfuzați transcardial cu 4% paraformaldehidă (PFA) în PBS. Creierele au fost extrase și postfixate peste noapte în PFA la 4 grade și apoi spălate în PBS pentru încă 24 de ore la 4 grade. Creierul și secțiunile au fost crioprotejate într-o soluție de 30% etilen glicol, 30% glicerol și 40% PBS până la utilizare. Fiecare creier a fost apoi secționat la 50 µm folosind un vibratom: fiecare secțiune a fost colectată secvenţial în 4 tuburi diferite de 1,5 ml pentru a permite analize diferite. (localizarea electrozilor, imunohistochimia).

Imunohistologie. Folosind un tub cu secțiuni de creier colectate (25% eșantionare) pentru fiecare analiză, secțiunile au fost spălate timp de 3 × 5 minute în PBS pentru a îndepărta soluția crioprotectoare. Secțiunile au fost incubate peste noapte cu PGT (0.45% gelatină și 0.25% Triton în PBS) la 4 grade. În continuare, feliile au fost incubate cu anticorpi primari: fie 1:200 de capră-colină-acetil -transferaza de la Millipore sau 1:500 IgG1 anti-PVmonoclonal de șoarece de la Sigma-Aldrich în PGT la temperatura camerei timp de 48 ore sau, respectiv, 2 ore. După spălări de 10, 20 și 30 de minute, secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpi secundari [1:2000 magar anti-capră cuplat cu Alexa 488 sau 1:500 capră anti-șoarece IgG1 cuplat la Alexa 488 (Life Technologies)] în PGT pentru 45 min. După spălări de 10, 20 și 30 de minute în PBS, secțiunile au fost apoi montate pe lame de sticlă și acoperite permanent cu mediu de montare Fluoromount care conținea DAPI. Doar șoarecii cu plasarea implanturilor confirmată histologic au fost incluși în acest studiu. Pentru GRINlenses, suprafața lentilei trebuia să fie<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Analiza datelor

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 pe traseul liniar).

Urmărirea automată a comportamentului. Pentru a extrage informații despre poziția, viteza și direcția capului șoarecilor, am folosit DeepLabCut70,71. Pe scurt, am antrenat un model pentru a detecta urechile, nasul, corpul și baza cozii șoarecilor. Direcția capului a fost estimată folosind unghiul dintre fiecare ureche sau nas și corp, în funcție de disponibilitatea măsurătorilor. Datele de locație au fost interpolate la frecvența de eșantionare a imaginilor de calciu folosind interpolarea liniară. Viteza a fost extrasă prin calculul Δd/Δt unde d este distanța și t timpul și ulterior a netezit rezultatul prin aplicarea unui filtru gaussian cu sigma=33 ms pentru a elimina artefactele de detectare. Semnalele de viteză au fost utilizate pentru a identifica perioadele de activitate locomotorie și pentru a calcula modularea locului, timpului și distanței a activității în mod specific pentru acele perioade.

Analiza imagistică a calciului. Analiza datelor imagistice de calciu a fost efectuată utilizând MATLAB 2020a și Python 3.8.4. Înregistrările video au fost analizate folosind pipeline Miniscope Analysis (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Pe scurt, corecția rigidă a mișcării (rotație și translație) a fost aplicată folosind NoRMCorre72, iar videoclipurile au fost eșantionate spațial (3×) înainte de concatenare. Urmele de calciu au fost extrase folosind CNMFe51 utilizând următorii parametri: gSig=3 pixeli (lățimea nucleului gaussian), gSiz=20 pixeli (diametrul aproximativ al neuronului), fundal_model=„ring”, algoritm_spațial=„hals”, min_cor=0,8 (pragul minim de corelare a pixelilor), min_PNR {{17 }} (pragul minim al raportului vârf-zgomot).

Urmele de calciu brut au fost filtrate pentru a elimina fluctuațiile de înaltă frecvență și au fost binarizate: pe scurt, neuronii au fost considerați activi atunci când amplitudinea semnalului de calciu normalizat a depășit două abateri standard, iar derivata de ordinul întâi a fost peste 0 (a se vedea ref. 52 pentru detalii suplimentare). asupra metodologiei52). Pentru a extrage ajustarea neuronilor la variabile specifice, locația, timpul și distanța au fost împărțite (locație: bins de 3 cm; timp: bins de 1 s; distanță: bins de 3 cm). Din semnale binarizate, am calculat probabilitatea marginală ca celulele să fie active P Að Þ pe care le folosim ca proxy pentru activitatea neuronală. Mai important, deducem probabilitatea de activitate sau „probabilitatea de a fi activ având în vedere starea variabilă” PA j Si utilizând variabile binate:

unde M este numărul total de stări comportamentale posibile și P(Si∩Aj) este probabilitatea comună ca animalul să se afle în bin I concomitent cu nivelul de activitate j (0 sau 1). Pentru a evalua semnificația valorii MI obținute, am generat apoi 1000 de surogate amestecate folosind permutări circulare aleatorii. Am ales permutările circulare deoarece elimină relația temporală dintre activitatea neuronală și comportament, păstrând în același timp structura temporală a tranzitorilor de calciu și conduc astfel la rezultate mai conservatoare (spre deosebire de randomizarea completă a fiecărui punct de date, ceea ce mărește valoarea semnificației rezultatelor). Deoarece surogații amestecați nu au fost distribuiti în mod sistematic în mod normal, am folosit o abordare neparametrică în care valoarea p (pN) corespunde numărului de puncte de date din distribuția amestecată care este mai mare decât datele reale pentru fiecare bin, împărțit la numărul de permutări52, 73.

Pentru a determina modularea celulelor prin stimulări optogenetice, am folosit o abordare similară, dar am calculat IM între activitatea neuronală și semnalele de stimulare binarizate (tratate astfel ca stare comportamentală). Aceeași procedură de amestecare circulară a fost apoi utilizată pentru a extrage semnificația statistică.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, a fost generat un set de date de antrenament folosind 90% din date. Restul de 10% din date au fost folosite pentru testare. O eroare de decodare a fost calculată utilizând 50 de surogate bootstrapped și un grup de 160 de celule utilizând puncte de date alese aleatoriu cu înlocuire. Se presupune că fiecare neuron este independent unul de celălalt, ceea ce în practică nu este cazul și duce la erori de reconstrucție mai mari, dar scade timpul de calcul. Probabilitatea posterior a populației a fost derivată din următoarea ecuație:

Urmărirea celulelor pe mai multe zile. Neuronii au fost urmăriți pe parcursul mai multor zile folosind CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Pe scurt, amprentele spațiale au fost aliniate folosind o aliniere rigidă pentru a corecta rotațiile și translațiile. După aliniere, am considerat seturile candidate de celule ca fiind același neuron dacă distanța lor maximă a fost<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Analiza electrofiziologică. Analiza datelor electrofiziologice a fost efectuată utilizând MATLAB 2020a utilizând atât procesarea semnalului, cât și cutia de instrumente wavelet. Convoluția wavelet a fost aplicată semnalelor LFP folosind wavelete Morlet complexe („cmor1–1,5” în MATLAB) atunci când a fost necesară precizia atât în ​​domeniul timpului, cât și al frecvenței. Movingwindow Convoluția Fourier (2 s fereastră în banda theta, 5 s fereastră în banda gamma, 10 ms pași de mișcare) a fost utilizată atunci când acuratețea domeniului de frecvență a fost privilegiată față de acuratețea domeniului timp (de exemplu, frecvența dominantă toplot la ritmul folosind optogenetica). Analiza densităților spectrale de putere a fost efectuată atunci când șoarecii alergau la 5 cm s-1 sau mai mult, dacă nu este descris altfel.

Forța de oscilație. OS a fost calculat ca raportul dintre densitatea spectrală a puterii cumulate în jurul frecvenței de oscilație de vârf ± 1 Hz la puterea cumulată a benzii în banda theta (4-12 Hz). Această măsurătoare devine 1 atunci când toată densitatea spectrală a puterii se încadrează în frecvența de oscilație de vârf (de exemplu, 8 Hz dacă se stimulează la acea frecvență).

Detectarea și analiza SWR-urilor. Pentru a monitoriza SWR, șoarecilor li s-a permis să exploreze liber un câmp deschis timp de 10 min în timpul înregistrării. Stimulările (scrambled sau 8 Hz) au fost efectuate cu o paradigmă 5 s ON, 5 s OFF. Doar perioadele de odihnă liniștită au fost luate în considerare pentru analiză. În acest scop, am calculat raportul punctaj z al puterii theta/delta după filtrarea pentru fiecare bandă de frecvență, efectuând o transformare Hilbert și am luat în considerare doar perioadele în care valoarea rezultată a fost sub 0. Pentru a detecta SWR-urile, am filtrat semnalele LFP în intervalul 150-250. Banda de frecvență Hz și, ulterior, punctaj z. Ondulurile au fost detectate folosind funcția findpeaks din MATLAB, cu următorii parametri: prag=4 sd,minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0.03 s.

Referințe

1. Colgin, LL Ritmurile rețelei hipocampice. Nat. Pr. Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Dezinhibarea celulelor hipocampalpiramidale de șobolan prin aferente GABAergice din sept. J. Physiol.500, 463–474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Țintele sinaptice ale proiecțiilor septului medial în hipocamp și cortexele extrahipocampale ale șoarecelui. J. Neurosci. 35,15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Proprietățile de ardere ale neuronilor identificați anatomic în septul medial al șobolanilor reținuti anesteziați și neanesteziați. J. Neurosci. 26, 9038–9046 (2006).

5. Scotty, F. şi colab. Proprietăți electrofiziologice distincte ale neuronilor septohipocampali de șobolan glutamatergic, colinergic și GABAergic: implicații noi pentru ritmicitatea hipocampului. J. Physiol. 551.927–943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. O rețea funcțională de neuroni glutamatergic în zona septului medial și a benzii diagonale. J.Physiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. et al. Interneuronii parvalbuminei ai hipocampului activitatea tunepopulării la frecvența teta. Neuron 86, 1277–1289 (2015).

8. Etter, G. şi colab. Stimularea optogenetică gamma salvează tulburările de memorie într-un model de șoarece cu boala Alzheimer. Nat. comun. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. et al. Circuitele neuronale hipocampale răspund la stimularea optogenetică a frecvențelor theta prin generarea de frecvențe de oscilație accelerate. Curr. Biol. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. şi colab. Oscilațiile theta reglează viteza de locomoție printr-o cale de la hipocamp către sept lateral. Nat. comun. 6.8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com