Inhibarea optogenetică a intrărilor cortexului entorinal medial la hipocamp într-o perioadă scurtă de timp, imediat după învățare, perturbă formarea memoriei fricii contextuale

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstract

Formarea asocierii temporalememorieși frica specifică contextuluimemoriese crede că necesită intrări ale cortexului entorrinal medial (MEC) cătrehipocampusîn timpul evenimentelor de învățare. Cu toate acestea, dacă intrările MEC sunt implicate și în formarea memoriei în timpul unei perioade de post-învățare nu a fost încă testat direct. Pentru a examina această posibilitate, am inhibat optogenetic axonii și terminalele care provin din neuronii excitatori MEC dorsali bilaterali din zona dorsală.hipocampustimp de 5 minute imediat după condiționarea fricii contextuale (CFC). Șoarecii care exprimă eNpHR3.0 au prezentat îngheț semnificativ mai puțin în comparație cu șoarecii martor care exprimă EGFP singur în timpul testului de recuperare în context condiționat, la 1 zi după învățare. În schimb, aceeași inhibare optogenetică a intrărilor MEC efectuată cu 30 de minute înainte de testul de recuperare nu a afectat înghețarea în timpul testului de recuperare, excluzând posibilitatea efectului dăunător nespecific al inhibiției optice asupra procesului de recuperare. Aceste rezultate susțin că formarea contextuală a memoriei fricii necesită intrări MEC la hipocamp în timpul unei perioade de post-învățare.

Cuvinte cheie: cortexul entorrinal medial, hipocampus, condiționarea fricii contextuale

Min Soo Kang și Jin-Hee Han

Sistemul hipocampus-cortex entorinal este crucial pentru episodicmemorieformarea [1]. Dovezile sugerează că intrarea din stratul III al cortexului entorrinal medial (MECIII) cătrehipocampus, în principal pentru subcâmpul CA1, este crucial pentru învățarea asociativă temporală, cum ar fi condiționarea fricii de urmărire, dar nu pentru condiționarea fricii contextuală și întârziată [2, 3]. În schimb, inhibarea optogenetică a celulelor din stratul II al cortexului entorrinal medial (MECII) care se proiectează spre gyrusul dentat (DG) și CA3, dar nu și celulele care se proiectează către CA1, în timpul CFC afectează formarea memoriei [4]. Prin urmare, se consideră că contribuția de la MECII către DG sau CA3 este necesară pentru învățarea fricii contextuale. Nu numai în învățare, ci și intrarea MEC în hipocamp este implicată și în modelele unice de activitate fiziologică observate în hipocamp în timpul repausului și al somnului, cum ar fi ondulațiile și vârfurile dintate care sunt asociate cumemorieprocesul de consolidare [5–10]. Prin urmare, intrarea MEC lahipocampuspoate avea un rol în formarea memoriei în timpul unei perioade de post-învățare. Cu toate acestea, această posibilitate nu a fost încă testată. Pentru a testa dacă intrarea MEC în hipocamp este necesară în timpul perioadei de post-învățare, am adoptat o abordare optogenetică pentru a reduce activitatea de intrare a MEC la șoarecii hibrizi 129/C57Bl/6 [11, 12]. Pentru a manipula intrarea MEC, virusul adeno-asociat (AAV) care conține gene care codifică eNpHR3.0 fuzionat cu proteina fluorescentă EYFP sub promotorul CaMKII (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP) a fost injectat în bilateral. MEC direcționare către stratul II și III (0.5 µL pe parte; AP: – 4,65 mm; ML:±3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (Fig. 1a). Ca control, am injectat AAV lipsit de eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), care exprimă doar proteina fluorescentă. Expresia AAV a fost limitată la straturile II și III MEC, care trimit proiecție către hipocamp (Fig. 1b). În hipocamp, proiecțiile axonale MEC care exprimă EYFP au fost detectate în DG și CA3, care provin din MECII, și, de asemenea, în CA1, care provin din MECIII (Fig. 1a). La trei săptămâni după operația de injecție cu AAV, șoarecii au fost din nou anesteziați pentru operația cu implant de fibră optică.

Cistanchese poate îmbunătățimemorie

Fibrele optice au fost implantate în hipocampul dorsal (AP: - 2,0 mm; ML: ± 1,3 mm; DV: - 1,5 mm) pentru suprimarea optică a intrărilor MEC dorsale cu un laser 561- nm. Vârfurile fibrelor optice erau situate chiar deasupra stratului lacunoză-molecular din stratul CA1 și, prin urmare, laserul 561-nm ar putea acoperi atât aferentele MECII din stratul molecular DG/stratul radiatum CA3, cât și aferentele MECIII din stratul lacuno-molecular din stratul CA1 ( Fișier suplimentar 1: Fig. S1). În timpul perioadei de recuperare de o săptămână după operația de implant, șoarecii au trecut prin obișnuința cu fibrele timp de 3 zile. Aceștia au fost conectați la un cablu de plasture optic cu eliberare de lumină și plasați în cușca de obișnuință timp de 5 minute fără livrare de lumină. După 3 zile de obișnuire, șoarecii EGFP și eNpHR3.0 au fost dresați pentru CFC.

Șoarecii au intrat în camera de condiționare și au primit un șoc la picior ({{0}},5 mA, 2 s) 3 minute mai târziu. La un minut după șoc, șoarecii au fost transferați imediat în cușca obișnuită și au primit lumină continuă de 561- nm (5 mW la vârful fibrei) timp de 5 minute (Fig. 1b). După inhibiția post-învățare, șoarecii s-au întors în cuștile lor de acasă. Pentru a testa dacă memoria contextuală a fost formată corect, a fost testată memoria pe termen lung (LTM). Șoarecii au reintrat în camera de condiționare la 24 de ore după CFC. Nivelurile de îngheț au fost măsurate ca indice LTM, monitorizate timp de 3 minute. Șoarecii din grupul eNpHR3.0 au prezentat o înghețare semnificativ mai mică în comparație cu șoarecii din grupul de control EGFP (Fig. 1c), indicând deficit de 24-h LTM prin inhibarea post-învățare a intrărilor MEC în hipocamp. Această reducere a înghețului nu sa datorat unui efect dăunător nespecific al procesului de inhibare optică. Când aceeași inhibare optică a fost furnizată cu 30 de minute înainte de testul LTM, nu a existat nicio diferență semnificativă în înghețare între grupuri (Fig. 1d, e).

Majoritatea dură a aferente MEC vizează hipocampul, este cunoscut că MEC trimite proiecții către zonele corticale prefrontale mediale, cum ar fi cortexul prelimbic și infralimbic [13]. Deoarece expresia AAV a fost aleatorie în MEC, este posibil ca inhibarea noastră optică să fi afectat axonii MEC care trec prin hipocamp, dacă există, pentru a-și produce efectul asupra formării contextuale a memoriei fricii. Pentru a exclude această posibilitate, am etichetat retrograd neuronii MEC care se proiectează în hipocamp. Am injectat virusul CAV2-Cre în hipocamp, care este absorbit retrograd de neuronii care se proiectează în hipocamp prin terminalele axonilor (Fig. 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP sau AAV-Ef1 -DIO-EYFP a fost injectat în MEC, astfel încât neuronii MEC care au absorbit CAV2-Cre pot expres eNpHR3.0-EYFP sau EYFP (Fișier suplimentar 1: Fig. S2). Zece, am reușit să inhibă intrările MEC în hipocamp imediat după CFC. Similar cu rezultatele anterioare, inhibarea optică a perturbat formarea memoriei fricii de context (Fig. 1g, h) în această stare. Astfel, aceste date întăresc și mai mult concluzia noastră că intrările MEC în hipocamp sunt cruciale pentru formarea memoriei contextuale în timpul unei perioade de post-învățare. O limitare a acestui studiu este lipsa de specificitate spațială în inhibarea optică utilizată.

Astfel, nu este clar în ce măsură și exact unde în circuitul hipocampal au fost suprimate intrările MEC pe scară largă cu inhibarea optică în starea noastră. Inhibarea precisă a intrărilor MEC care vizează un subcâmp specific, cum ar fi CA1 sau DG al hipocampului, ar putea fi necesară pentru a elucida mecanismul prin care intrările MEC contribuie la formarea memoriei fricii contextuale în studiul viitor. Deși nu am testat efectul inhibării optice a intrărilor MEC în hipocamp în diferite momente după condiționarea fricii contextuale în acest studiu, studiile anterioare raportează un rol dependent de timp al activităților creierului post-învățare pentru consolidarea amintirilor dependente de hipocamp, cum ar fi condiționarea fricii contextuale. De exemplu, folosind o strategie optogenetică, un studiu anterior a manipulat artificial inducerea somnului cu unde lente (SWS) în diferite momente de timp în urma diferitelor sarcini de învățare și s-a părut că există o fereastră de timp critică (în 30 de minute) în care SWS a indus prin lumină poate îmbunătăți amintirile dependente de hipocamp [14].

Fig.1 inhibarea intrării MEC în hipocamp imediat după câștig afectează formarea memoriei fricii contextuale pe termen lung. o Reprezentare schematică a site-ului de implantare a ferulei optice și a AAViniecției bilaterale (eft). Imagini reprezentative de conkocalmikroscopk care împing expresia EGFP și eNpHR0-EYFP în MEC de sus) și în hipocamp (jos). Asteriscul indică poziția aproximativă a vârfului fibrei optice. b Schema comportamentală.histograma care arată nivelul de îngheț în timpul testului NpHR30 în jur de（3589主 3,21 la sută, n=】1】 a arătat semnificativ mai puțină bijuterie de simțire în comparație cu grupul de control EGFP (53,13±265 la sută, n=12) în test LTM.**p<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Testul elevilor.nu este semnificativ, f strategia de inițiere CAV și AAV sau etichetarea retrogradă a neuronilor MEC care se propagă la hipocamp (f) Reprezentare schematică a injecției bilaterale CW Injecția AW și schema comportamentului locului implantului ferulei optice (dreapta). h Histograma care arată nivelul de îngheț în timpul testului. Grupul eNpHR3.0 (33,71±4,06 la sută, n=11) ​​a arătat un nivel de îngheț semnificativ mai mic comparativ cu grupul de control EYFP (50,13±3,18 la sută, n{=12) în testul LIM .**p<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Interesant, un alt studiu la șobolani a arătat că leziunile electrolitice selective ale proiecției entorinale directe (temporoamonice, TA) în zona hipocampului CA1 24 h, dar nu la 3 săptămâni după antrenamentul labirintului cu apă Morris, au perturbat formarea memoriei spațiale la distanță. timp, sugerând că interacțiunea MEC-hipocampus prin calea de intrare TA în această perioadă de timp este necesară pentru consolidarea sistemelor [15]. Având în vedere aceste constatări, este foarte probabil ca intrările MEC la hipocamp să aibă un rol dependent de timp în formarea memoriei fricii contextuale recente și îndepărtate.

Este interesant în studiul nostru că o perioadă atât de scurtă (5 minute) de inhibare optogenetică post-antrenament a fost suficientă pentru a afecta formarea memoriei de context. O interpretare este că rezultatele noastre pot reflecta un bloc parțial de evenimente de consolidare care sunt necesare pentru formarea normală a memoriei. În conformitate cu acest cont, memoria a fost parțial afectată în starea noastră. O altă posibilitate este că ar putea avea loc un eveniment critic în acest scurt punct de timp necesar pentru formarea memoriei fricii contextuale. O posibilitate este că intrarea MEC poate fi crucială pentru declanșarea ondulațiilor sau vârfurilor dintate în hipocamp care sunt corelate cu o reluare a evenimentelor experimentate anterior [7, 9, 10, 16] și inhibarea optogenetică a intrării MEC ar putea perturba astfel de modele de activitate. Alternativ, inhibarea scurtă a intrării MEC poate să fi afectat somnul cu unde lente ulterioare, care are, de asemenea, o fereastră de timp crucială în ceea ce privește consolidarea memoriei dependentă de hipocamp [14].

Referințe

1. Eichenbaum H. Un sistem cortical-hipocampal pentru memoria declarativă. Nat Rev Neurosci. 2000;1(1):41–50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Intrarea stratului III de cortex entorinal la hipocamp este crucială pentru asocierea temporală

3.memorie. Ştiinţă. 2011;334(6061):1415–20.Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, et al. Celulele insulare controlează memoria de asociere temporală. Ştiinţă. 2014;343(6173):896–901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Celulele oceanice corticale entorinale codifică contexte specifice și conduc memoria fricii specifică contextului. Neuron. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Rețea de înaltă frecvență

6.oscilatii in hipocamp. Ştiinţă. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Spikes EEG Dentate și exploziile interneuronale asociate populației în regiunea hilară a hipocampului a șobolanului. J Neurofiziol. 1995;73(4):1691–705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Modele fiziologice în sistemul cortexului hipocampal-entorinal. Hipocampul. 2000;10(4):457–65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Hipocampal ripples and memory consolidation. Curr Opin Neurobiol. 2011;21(3):452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Intrarea directă a cortexului entorrinal medial către CA1 hipocampal este crucială pentru reluarea prelungită a treazului și liniștit. Neuron. 2017;96(1):217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Stimularea electrică a hipocampului perturbă învățarea asociativă atunci când este vizată de vârfurile dintate. J Physiol-Londra. 2017;595(14):4961–71.

11. Wehner JM, Silva A. Importanța diferențelor de tulpini în evaluările proceselor de învățare și memorie la mutanții nuli. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996;2(4):243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman PE, Parkinson J și colab. Interogarea chemogenetică a unei rețele de memorie a fricii la nivelul creierului la șoareci. Neuron. 2017;94(2):363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter MP. Cortexul entorinal al șobolanului: subdiviziunile citoarhitectonice și originea și distribuția aferentelor corticale. Hipocampul. 1997;7(2):146–83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X și colab. O fereastră de timp critică pentru inducerea selectivă a consolidării memoriei hipocampului printr-un episod scurt de somn cu unde lente. Buletinul de neuroștiințe. 2018;34(6):1091–9.

15. Remondes M, Schuman EM. Rolul inputului cortical în zona hipocampului CA1 în consolidarea memoriei pe termen lung. Natură. 2004;431(7009):699–703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Superficial layers of the medial entorinal cortex replay independently of the hipocampus. Ştiinţă. 2017;355(6321):184–8.