Stresul oxidativ, metabolismul energetic disfuncțional și neurotransmițătorii destabilizatori au modificat profilul metabolic cerebral într-un model de șobolan de scufundare simulată cu saturație heliox la 4.0 MPa Ⅱ

Procedura de extracție a țesuturilor

Procedura de extracție a metaboliților polari din probele de țesut a fost o modificare minoră așa cum sa raportat [18]. Probele de țesut precântărit înghețate au fost dezghețate pe gheață și apoi supuse omogenizării mecanice într-un sistem de solvenți metanol-cloroform-apă de calitate HPLC rece ca gheață (400 μL, 400 μL și, respectiv, 285 μL per 100 mg țesut cerebral) folosind un omogenizator de țesut (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Franța). Omogenatele rezultate au fost reținute pe gheață pentru o perioadă de 30 de minute și apoi centrifugate la 12,000 xg pentru o perioadă de 10 minute la 4˚C. Supernatantul fiecărei probe a fost apoi îndepărtat și liofilizat pentru a obține o pulbere care conține metaboliți polari într-un uscător prin congelare (FD-1A{-80, BIOCOOL, China). Fiecare probă de pulbere a fost ulterior reconstituită cu 550 μL tampon PBS având 0,1% TSP, iar toate probele au fost apoi bine amestecate prin rotație și centrifugate la 12,000 xg pentru o perioadă de 20 de minute la 4 °C. O parte alicotă de 500 μL de supernatant a fost apoi transferată într-un tub RMN cu diametrul de 5,0 mm (Norrel, Marea Britanie). Principiul de extracție a proteinei din proba de cortex a fost descris anterior, fără modificări. Cantitatea exactă de probe de cortex a fost turnată într-un tampon de omogenizare (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmol/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1% Triton X-100, aprotinină, pepstatina A și leupeptină 10 ug/ml fiecare) și omogenizate manual într-o baie de gheață. Amestecul a fost centrifugat la 1,000 xg pentru o perioadă de 10 minute la 4°C, iar supernatantul a fost utilizat pentru concentrațiile de proteine ​​cuantificate folosind testul Bradford.

Faceți clic aici pentru a cunoaște funcția antioxidare Cistanche

Test biochimic

Un test imunosorbent legat de enzime (ELISA) sensibil, competitiv a fost aplicat cu truse de analiză pentru cuantificarea enzimelor metabolice Na-KATPază și AChE și a neurotransmițătorilor DA, E, NE, 5HT și GABA. ELISA a determinat, de asemenea, nivelurile de SOD, MDA și GPx în țesutul cortical cu truse de testare conform instrucțiunilor producătorului.

măsurarea RMN

Cuantificarea eficientă a metaboliților tisulari a fost realizată utilizând o platformă analitică bazată pe un spectrometru lichid RMN Bruker Avance-III de înaltă rezoluție echipat cu o sondă criogenică de înaltă sensibilitate care funcționează la o frecvență de 600. 17 MHz pentru observație de 1 H la 298 K. O secvență de impulsuri 1 H ZGPR unidimensională suprimată cu apă (TOPSPIN versiunea 3.0, Bruker Biospin) (RD-90˚-ACQ) a fost aplicată la obțineți date RMN pentru fiecare probă. Patru scanări fictive și 128 de tranzitorii au fost înregistrate într-un domeniu temporal de 32 K puncte de date utilizând o lățime spectrală de 20 ppm cu o întârziere de relaxare de 10,0 s și un timp de achiziție de 2,73 s. O funcție exponențială de lărgire a liniei de 0,3 Hz și umplere zero la 64 K puncte de date au fost aplicate tuturor dezintegrarilor de inducție liberă (FID) înainte de transformarea Fourier. Tehnici RMN bidimensionale suplimentare cu spectroscopie de corelație cu gradient de câmp pulsat (gCOSY) și spectroscopie de corelație totală homonucleară 2D (TOCSY) au fost utilizate utilizând programe standard de impulsuri pe probe selectate pentru a confirma atribuirile de schimbare chimică. Un schimbător automat de probe pentru livrarea continuă a probelor a fost utilizat în achiziția tuturor spectrelor.

Identificarea și confirmarea metaboliților

Semnalele RMN bazate pe locația rezonanțelor individuale pe spectre au fost identificate în pachetul software Chenomx NMR Suite v. 8.4 (versiunea de evaluare). Confirmările unor atribuiri de metaboliți au fost efectuate luând în considerare deplasările chimice, constantele de cuplare și modelele de multiplicitate ale metaboliților ca informații despre cuplările scalare extrase din 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, baze de date publice RMN precum COLMAR și Human Metabolome. Baza de date (HMDB) și literatura de specialitate [18, 19].

Analiza statistică multivariată

Protocolul de preprocesare utilizat pentru preprocesarea fiecărui spectru RMN 1D1H a fost același cu cel descris în lucrarea noastră anterioară [20]. Spectrele 1H RMN au fost fazate și corectate la linia de bază folosind MestReNova (Mestrelab Research, SL, Spania), iar regiunea spectrală a fiecărui metabolit a fost integrată într-o găleată. Rezonanțele semnalului de solvent organic și regiunea semnalului H2O/HOD rezidual au fost îndepărtate în toate spectrele 1D1H RMN. O procedură 0.{{30}}03 Hz și normalizarea la suma intensității spectrale înmulțite cu 10000 au fost aplicate în toate spectrele. Doar cele mai mari valori ale găleții dintr-un vârf au fost selectate pentru analiza pasului următor pentru a evita interpretarea greșită a metaboliților discriminanți din cauza semnalelor suprapuse. Ulterior, găleți integrale de 47 de metaboliți au fost extrase și supuse analizei datelor univariate și multivariate. Analiza indiscriminării prin analiza componentelor principale (PCA) și analiza discriminării prin analiză discriminantă parțială cu cele mai mici pătrate (PLS-DA) și analiza discriminantă a proiecțiilor ortogonale la structurile latente (OPLS-DA) a fost efectuată folosind pachetul software SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics). , Umeå, Suedia) scalate la datele de varianță unitară. Graficele scor PCA și PLS-DA au fost ilustrate cu prima și a doua componentă principală (t[1], t[2]), în timp ce graficul scor OPLS-DA a folosit t[1] și componenta ortogonală (la[1] ]). Parametrii Q2 (cum), R2Y (cum) și R2X (cum) au fost calculați pentru a testa robustețea modelelor de discriminare împotriva supraajustării [21]. După cum s-a descris anterior, o valoare de evaluare a calității de Q2 � 0,4 este considerată un model de încredere. Strategia de validare încrucișată de șapte ori și testul de permutare de 200 de ori cu prima componentă au fost aplicate pentru a proteja împotriva supraadaptării modelului și pentru a valida în continuare fiabilitatea și credibilitatea modelelor. Dacă linia de regresie Q2 a avut o intersecție negativă și valorile Q2 ajustate în punctul cel mai din stânga au fost mai mari decât toate valorile Q2 ale punctelor din dreapta în testul permutat, modelul OPLS-DA stabilit a fost robust [22]. Strategia implicită de validare încrucișată 10-fold a fost aplicată pentru a se proteja împotriva supraadaptării modelului. În general, o statistică de evaluare a calității (Q2) � 0,4 este considerată un model de încredere, așa cum a fost descris anterior. Coeficienții de corelație (r) și valorile VIP extrase din modelele OPLS-DA au fost utilizate pentru a identifica metaboliții care au contribuit semnificativ la separarea dintre cele două grupuri. În plus, modificările de ori ale metaboliților între grupuri au fost calculate folosind o funcție. IA/IB, unde IA și IB reprezintă valorile medii pentru integrala metabolitului în grupele A și, respectiv, B. Harta termică și diagramele cu casete au fost reprezentate pentru a facilita înțelegerea variațiilor metaboliților între grupuri.

Statistica univariată a integralelor metaboliților

Media grupului de metaboliți din fiecare grup este exprimată ca medie ± abaterea standard (SD). Analiza univariată a fost de asemenea efectuată utilizând ANOVA (analiza varianței). Diferențele semnificative statistic între grupuri au fost evaluate printr-un test t neîmperecheat de două cozi după conversia log în software-ul GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Diferențele semnificative statistic au fost definite prin valorile p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Analiza statistică a corelației metabolice a sistemului și analiza clusterului ierarhic

Calculul coeficientului de corelație al lui Pearson și analiza clusterului ierarhic au fost efectuate pe baza integralelor relative ale metaboliților din R Studio (Versiunea 1.4.1717) cu scripturi mici. Pentru fiecare pereche de grup, matricea de corelație a fost ilustrată într-o hartă de pixeli așa cum este descris în literatură [21]. Pe scurt, pentru fiecare variabilă dintr-un grup, corelațiile cu valori p mai mici de 0.05 au fost considerate corelații statistice semnificative și au fost păstrate pentru a construi rețeaua de corelație finală pentru a ilustra relațiile latente ale metaboliților din cadrul grupului. grup și relațiile metabolice perturbate dintre grupuri. Pătratele mai roșii indică o corelație pozitivă mai semnificativă. Pătratele mai albastre indică o corelație pozitivă mai semnificativă. Pătratele albe indică corelația fără semnificație. Analiza celor mai relevante căi și rețele metabolice cerebrale invocate ca respondenți la HSD a fost efectuată folosind instrumentul MetaboAnalyst 3.0. Pentru analiza topologiei căii efectuată, a fost selectată biblioteca de căi de mamifere Rattus norvegicus (șobolan). Această abordare a fost, de asemenea, utilizată pentru a furniza estimări ale impactului căii, ratei de descoperire falsă (FDR) și valorilor p.

Rezultate Indici biochimici corticali din grupele HSD și CON

Pentru a valida efectele de alterare metabolică ale HSD asupra țesuturilor creierului, parametrii biochimici, inclusiv activitățile enzimatice metabolice legate de metabolismul energetic ale Na-KATP, AChE și LDH, neurotransmițătorii DA, E, NE, 5HT și GABA și celproteine ​​legate de stresul oxidativdeGAZON, MDA, și Gpx în țesuturile cortexului ipsilateral ale șobolanilor HSD și CON au fost, de asemenea, determinate (Tabelul 1). În comparație cu grupul de control, nivelurile de DA, E, NE și MDA au fost crescute semnificativ, în timp ce conținutul de Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD și Gpx a fost scăzut în modelul HSD. Limita de detecție a truselor de testare utilizate în prezenta lucrare a fost enumerată în Tabelul S3 din dosarul materialelor suplimentare.

Tabelul 1. Cuantificarea parametrilor biochimici a fost măsurată în țesutul cortexului CON și animale HSD prin ELISA cu kiturile de analiză. (media ± SD). indică semnificația statistică.

Metaboliți identificați în spectrele 1H RMN ale probelor de țesut cerebral

Fig. 3 prezintă trei spectre 1H RMN reprezentative din cortex (Fig 3A), hipocamp (Fig 3B) și striat (Fig 3C) ale unui șobolan HSD. O gamă largă de metaboliți proeminenți au fost identificați conform datelor 1H RMN ale probelor de țesut cerebral și sunt anioni de acid organic (lactat (Lac), malonat (Maln), succinat (Suc), malat (Mal), fumarat (FMA). ), 2-hidroxibutirat (2-HB), acetat (Ace), formiat (For), taurină (Tau), ascorbat (Asc), 2-hidroxibutirat (2HIB)), aminoacizi (leucină (Leu), izoleucină (Ile), valină (Val), alanină (Ala), glicină (Gly), tirozină (Tyr), fenilalanină (Phe), aspartat (Asp), glutamină (Gln), glutamat (Glu) , treonină (Thr), serină (Ser), lizină (Lys), asparagină (Asn)), neurotransmițători (-aminobutirat (GABA)), metaboliți legați de energie (creatina (Cre), adenozin trifosfat (ATP), adenozin monofosfat ( AMP)), metaboliți înrudiți cu fosfolipide (Ofosfoetanolamină (PEA), O-fosfocolină (Pcho), sn-glicero-3-fosfocolină (GPC)) și alții (mio-inozitol (MI), nicotinamidă adenin dinucleotidă (NAD plus) ), acid nicotinic (Nic), N-acetilaspartat (NAA), nicotinamidă-adenină-dinucleotidă fosfat (NADP plus ), UDP-N-galactoză (UDPGa), uridină (Uri), uracil (Ura), cistidină (Cyt) , uridină 5'-monofosfat (UMP), inozină 5'-monofosfat (IMP), inozină (Ino), colină (Cho), car nitină (Car), glutation (GSH). Tabelul S1 prezintă informații detaliate despre atribuirea metaboliților.

Modificări ale profilului metabolic relevate de analiza metabolomică

PCA, o abordare de analiză exploratorie și imparțială a spectrelor 1H RMN din toate extractele creierului din diferite regiuni ale creierului, a fost realizată pentru a dezvălui principalele tendințe metabolice determinate de expunerea hiperbară la o 400 msw. mediu de saturație heliox. O diagramă de împrăștiere PC1 vs. PC2 obținută din PCA (S1A–S1C Fig) de date integrale ale găleților a evidențiat o anumită discriminare cu o oarecare suprapunere între cele două clasificări. Investigațiile supravegheate ale modelelor PLS-DA (S1A’–S1C’ Fig) și OPLS-DA (Fig. 4A–4C) au prezentat discriminări clare de clasă ale profilurilor metabolice între grupuri. Fig. 4 prezintă graficele de scor ale modelului OPLS-DA pentru regiunea cortexului (A), regiunea hipocampusului (B) și regiunea striatumului (C), arătând o discriminare clară între grupurile HSD și controale. Variația mare explicată și bunătatea predicției reflectate de valorile R2X și Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig. 4A–4C) și graficele de testare a permutației (Fig 4'-4C'A) au indicat robustețea modelelor supravegheate generate. Coeficientul de corelație (r) extras din graficele S-line, importanța variabilă în proiecție (VIP) și valoarea p din testele neparametrice univariate au fost colectate pentru a evalua metaboliții semnificativi responsabili pentru modelele de discriminare de clasă. Prin urmare, îndeplinind oricare dintre cele trei criterii (valoarea absolută a lui r mai mare de 0,50, valoarea VIP mai mare de 1,0, împreună cu valoarea p mai mică de 0,05), am selectat un panou de metaboliți semnificativi statistic (Tabelul 1) responsabil pentru separarea dintre grupurile CON și HSD. În Tabelul 1, valorile de schimbare a ori mai mari decât 1 indică un nivel crescut în grupul HSD, în timp ce valorile de schimbare a ori mai mici de 1 indică un nivel scăzut în grupul HSD. Valorile medii SD ale metaboliților discriminatori sunt enumerate în tabelul S2. Folosind analiza grupului ierarhic a metaboliților și metoda de legătură medie, harta termică generată (Fig. 5A-5C) cu dendrograme permite o mai bună vizualizare a modificărilor metabolice a trei regiuni ale creierului cauzate de expunerea hiperbară într-un mediu saturat cu heliu de oxigen.

Tulburări metabolice observate în diferite regiuni ale creierului la șobolani HSD

Analiza multivariată și analiza univariată menționate mai sus folosind înălțimea găleții de metaboliți din diferitele grupuri au oferit un tub de lucru excelent pentru a identifica metaboliții discriminatori care dezvăluie potențialele modificări metabolice neurologice asociate cu evenimentele HSD. AMP, FMA, Nic și Phe crescute și o scădere a Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura și Uri au fost găsite în țesutul cortex al HSD. grupul comparativ cu grupul CON (Fig 5A, Tabelul 1). Între timp, în hipocamp, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr și Ura au scăzut, de asemenea, iar AMP a crescut în grupul HSD, așa cum au făcut și în cortex. Mai mult, Thr reglat în sus și Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc și DMA reglați în sus au fost exprimate în extractele de hipocamp din grupul HSD în raport cu controalele (Fig 5B, 5D, Tabelul 1). În comparație cu grupul CONS, conținutul de Cyt, GABA, Ura, Cho și Thr a scăzut, de asemenea, așa cum a făcut-o în cortex și hipocamp. În plus, niveluri crescute de aminoacizi cu lanț ramificat (BCAA, inclusiv Leu, Ile, Val) și Lys și niveluri scăzute de Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, o serie de metaboliți ai ATP, Tau, IMP, și Suc, care a scăzut, de asemenea, în hipocamp, și alți doi metaboliți, Ino și Pcho, care au scăzut și în cortex, au fost observați în țesuturile striatum ale șobolanilor din grupul HSD (Fig 5C, 5D, Tabelul 1). Atât de mulți metaboliți indică întotdeauna căi moleculare implicate cu complexitate și diversitate. Valorile integrale ale metaboliților discriminanți au fost cuantificate și modificările semnificative statistic ale concentrațiilor lor între grupurile expuse cu heliox-saturație-hiperbaric și martor sunt rezumate în Tabelul S2 și Tabelul 2 pentru cele trei regiuni ale creierului.

Fig. 4. Diagrame cu scoruri ale analizei discriminante ale celor mai mici pătrate parțiale ortogonale (OPLS-DA) și grafice ale testului de permutare care discriminează efectul expunerii la 400 msw la heliox-saturație asupra spectrelor 1H RMN de la grupurile de control din cortex (CONC, n=8, HSDC, n=8, A și A') (R2X=0,38; Q{2=0,46), hipocamp (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B și B') (R2X=0.37; Q{2=0.43) și striatul (CONS, n=8, HSDS, n=8, C și C') (R2X=0.39; Q{2=0.40). Valorile parametrului Q2 din diagramele cu scorul OPLS-DA, care au fost egale sau mai mari de 0,40, cuplate cu valorile Q2 ale punctului cel mai din stânga din modelele permutate, au fost mai mari decât toate valorile Q2 ajustate ale punctelor din dreapta (permutare). test de 80 de ori), indicând că modelele OPLS-DA stabilite erau valabile.

Pcho, care a scăzut și în cortex, a fost observat în țesuturile striatum ale șobolanilor din grupul HSD (Fig 5C, 5D, Tabelul 1). Atât de mulți metaboliți indică întotdeauna căi moleculare implicate cu complexitate și diversitate. Valorile integrale ale metaboliților discriminanți au fost cuantificate și modificările semnificative statistic ale concentrațiilor lor între grupurile expuse cu heliox-saturație-hiperbaric și martor sunt rezumate în Tabelul S2 și Tabelul 2 pentru cele trei regiuni ale creierului.

Fig 5. Harta termică și diagrame de corelație statistică derivate din valorile grupului de metaboliți discriminatori din cortex (A, A', probele HSDC se află în panoul superior și CONC se află în panoul inferior), hipocamp (B, B', HSDH). grupul se află în panoul superior și CONH se află în panoul inferior), iar țesuturile de șobolani HSD și CON se află striatum (probele C, C', HSDS se află în panoul superior și CONS se află în panoul inferior). Metaboliții de pe harta termică sunt organizați prin grupare ierarhică bazată pe asemănarea generală a tiparelor de nivel. Diagrama Venn (D) care ilustrează suprapunerea metaboliților între comparațiile HSDC-CONC, HSDH-CONH și HSDS-CONS.

Analiza corelației metaboliților

Relația dintre sau între metaboliți a fost atât de complexă în Fig 5A'-5C'. Pentru metaboliții energetici, corelațiile pozitive pentru Lac vs Ala în HSDC, AMP vs IMP în HSDH, ATP vs Pcho în HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA în HSDS și corelațiile negative pentru Lac vs Thr și GSH vs. Suc în HSDH, Suc vs Val în HSDS au fost prezente în graficele de corelare a metaboliților. Pentru neurotransmițători, corelațiile pozitive pentru GABA vs Car în HSDC, GABA vs Cho în CONH și GABA vs Suc/Ino/Gln în HSDS au fost prezente în graficele de corelare a metaboliților. Corelațiile negative pentru GABA vs FMA în CONC și GABA vs NAA/Ura/NADP plus în CONS au fost prezente în graficele de corelare a metaboliților. Pentru metaboliții înrudiți custresul oxidativ, celcorelații pozitivepentru GSH vs Asn în HSDC și CONC, Tau vs Lac în HSDH, Tau vs Suc/Ala în CONH, corelațiile negative pentru GSH vs Suc în HSDH, Tau vs Thr în HSDH au fost prezente în corelația metabolitului parcele.

Analiza căii metabolomice

Analiza cantitativă a căii constând în analiza îmbogățirii căii și impactul căii din topologia căii a relevat modulații induse de HSD extrem de semnificative statistic la o serie de căi metabolice. Scorurile impactului căilor, împreună cu rata de descoperire falsă (FDR) și valorile p, sunt descrise în Fig 6. Căile au fost considerate semnificativ îmbogățite dacă valorile p erau mai mici decât 0.05; metaboliții profilați (hits) în raport cu metaboliții totali ai căii (starea de potrivire) au fost mai mari decât 1; iar scorurile de impact (care indică impactul metaboliților afectați în mod semnificativ în calea bazată pe măsura topologiei rețelei a centralității relative a intermediei) au fost mai mari decât 0. Căile din cortex (Fig 6A) cu cea mai mare valoare a impactului metabolic au fostFenilalanină, tirozină, șibiosinteza triptofanului>metabolismul fenilalaninei> metabolismul pirimidinei > metabolismul alaninei, aspartatului și glutamatului. Căile din hipocamp (Fig 6B) cu cel mai mare impact metabolic au fost biosinteza fenilalaninei, tirozinei și triptofanului > metabolismul glutationului > metabolismul glicinei, serinei și treoninei > metabolismul purinei > metabolismul pirimidinului > metabolismul alaninei, aspartatului și glutamatului > metabolismul butanoatului . Căile din striat (Fig 6C) cu cel mai mare impact metabolic au fost metabolismul alaninei, aspartatului și glutamatului > metabolismul nicotinatului și nicotinamidei > metabolismul purinelor.

Cere mai mult:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950