Partea 1: Efectul antifibrotic al 6-bromo-indirubinei-3 ′-oximei (6-BIO) prin reglarea proteinei activatoare-1 (AP-1) Și factorii de transcripție ai proteinei de specificitate-1 (SP{-1) în celulele renale

Efectul antifibrotic al 6-bromo-indirubinei-3 ′-oximei (6-BIO) prin reglarea proteinei activatoare-1 (AP{-1) și a proteinei de specificitate -1 (SP-1) factori de transcripție în celulele renale

Pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Cuvinte cheie:rinichi, Fibroză,SMAD,Antifibrotic

ABSTRACT

PAI-1 și CTGF sunt supraexprimate înrinichibolisi cauzafibrozăa plămânilor, ficatului șirinichi. Am folosit un model de șobolan al obstrucției ureterale unilaterale (UUO) pentru a investiga dacă6-BIO, un inhibitor al glicogen sintazei kinazei-3, atenuatfibrozăprin inhibarea PAI-1 și CTGF in vivo. În plus, celulele induse de TGFfibrozăa fost observat in vitro folosind omrinichicelule epiteliale tubulare proximale (HK-2) și fibroblaste interstițiale de șobolan (NRK49F). Expresia afibrozăproteinele înrudite și moleculele de semnalizare, cum ar fi PAI-1, CTGF, TGF, SMA,SMADși MAPK au fost determinate în celulele HK-2 și NRK49F utilizând imunoblot. Pentru a identifica factorii de transcripție care reglează expresia PAI-1 și CTGF, activitățile promotoare ale AP-1 și SP{-1 au fost analizate folosind teste de luciferază. Microscopia confocală a fost utilizată pentru a observa co-localizarea AP-1 și SP-1 la PAI-1 și CTGF. Expresia PAI-1, CTGF, TGF și -SMA a crescut în modelul UUO, precum și în celulele HK-2 și NRK49F tratate cu TGF. În plus, tratamentul cu UUO și TGF a indus activarea P-SMAD2/3, SMAD4, căile de semnalizare P-ERK 1/2, P-P38 și P-JNK MAPK. Activitatea promotorului PAI-1, CTGF, AP-1 și SP-1 a crescut ca răspuns la tratamentul cu TGF. Cu toate acestea, tratamentul cu6-BIOa scăzut expresia proteinelor și a căilor de semnalizare asociate cufibrozăîn modelul UUO, precum și în celulele HK-2 și NRK49F tratate cu TGF. Mai mult, tratamentul cu 6-BIO a atenuat expresia PAI-1 și CTGF, precum și activitățile promotoare ale AP{-1 și SP{{-1, reglând astfelSMADși căile de semnalizare MAPK și, ulterior, exercităantifibroticefecte asuprarinichicelule.

Faceți clic pe Cistanche herba pentru boli de rinichi

1. Introducere

Rinichifibroza este cauzată de diverși factori, inclusiv diabet, hipertensiune arterială, glomerulonefrită și cronice legate de vârstă.rinichiboala [1–3]. Scleroza glomerulară și tubulointerstițialăfibrozăsunt caracteristicile patologice finale alerinichiboli [4,5]. Producția și depunerea excesivă de proteine ​​din matricea extracelulară (ECM) cauzează daune structurale și funcționale alerinichi, rezultând o pierdere treptată a funcției sale, care culminează în stadiul finalrinichiboala [5]. Therinichiau o structură complexă care este împărțită în glomeruli, tubulointerstițiali și vasculare; fiecare compartiment are un tip diferit de matrice extracelulară și poate fi afectat defibroză[6,7]. ECM-ul celulelor tubulare interstițiale conține diverse componente, inclusiv colagen, glicozaminoglican, elastină, laminină și glicoproteine. Celulele tubulare proximale activate pot activa tubulointerstițial [6–10]. Glicogen sintaza kinaza (GSK3) promoveazărinichifibrozăprin activarea semnalizării TGF- în celulele tubulare și tubulointerstițiale proximale [11]. În acest studiu, ne-am propus să determinăm efectele inhibitorului GSK3,6-BIO, asupra celulelor fibroblaste tubulare și interstițiale proximale prin țintirea inhibitorului activatorului plasminogenului-1 (PAI{-1) și a factorului de creștere a țesutului conjunctiv (CTGF), care joacă un rol esențial în progresiarinichiafectare și tubulointerstițialăfibroză.

6-BIOeste un derivat permeabil la celule al unui analog al indirubinei, 6-bro-indirubina, care este izolat din moluștele marine și are specificitate și selectivitate ridicate pentru GSK-3 [12,13].6-BIOeste un inhibitor competitiv al ATP și prezintă similitudini cu domeniul de legare a ATP al proteinei kinazei dependente de ciclină (CDK) care reglează activitatea antitumorală [14-16]. Activitatea anormală a GSK3 este asociată cu mai multe boli umane, inclusiv diabet, inflamație, boli neurodegenerative și psihoză [17,18]. S-a demonstrat în studii anterioare că inhibitorii GSK3 pot repara tubii deteriorați și pot reduce răspunsurile inflamatorii, tranziția epitelial-mezenchimală (EMT) asociată cu semnalizarea TGF 1 și acumularea de fibronectină în celulele intermediare glomerulare cultivate [11,19-21]. În plus,6-BIOpoate exercita efecte terapeutice potențiale în mai multe boli, inclusiv diabet, tulburări neurodegenerative și cancer prin reglarea inflamației, stresului oxidativ, supraviețuirea celulară, precum și proliferarea și moartea celulelor [22-24]. Cu toate acestea, efectele terapeutice potențiale ale6-BIOperinichifibrozăasociate cu afectarea tubulară proximală și interstițială tubulară sunt încă necunoscute.

PAI-1, o glicoproteină multifuncțională dinrinichi, este un inhibitor de serin protează, care inhibă activatorul de plasminogen al urokinazei (uPA) și activatorul de plasminogen tisular (tPA) care descompune plasminogenul în plasmină [25,26]. Supraexprimarea PAI-1 inhibă fibrinoliza și degradarea ECM, crescând astfel acumularea de ECM [27]. În plus, PAI-1 reglează MAPK (protein kinaze activate de mitogen),SMADși căile de semnalizare RhoA/ROCK (protein kinaza asociată Rho) în diabet și cronicrinichiboala [28–30]. Factori de transcripție, cum ar fi AP-1, SP-1,SMAD3/4, USF2 (factor de transcripție 2 în amonte) și CTF/NF (familie de legare ADN specifică locului)

proteine), sunt, de asemenea, activate de MAPK șiSMADsemnalizare [30,31]. Activarea combinată a acestor căi de semnalizare și a factorilor de transcripție crește expresia PAI-1 și duce la acumularea de ECM. CTGF este o proteină care leagă heparina legată de ECM și include domenii, cum ar fi proteina de legare a factorului de creștere asemănător insulinei (IGFBP), repetițiile de tip C von Willebrand (VWC), repetarea trombospondinei de tip 1 (TSR) și un terminal C-terminal. domeniu (CT) cu un motiv de nod de cisteină. Dintre aceste patru domenii, domeniul CT interacționează cu superfamilia TGF, fibronectina și perlecanul [32-34]. În consecință, CTGF crește MAPK,SMADsemnalizarea , PI3K și YAP prin inducerea TGF , iar aceste căi de semnalizare activează factorii de transcripție, cum ar fi AP-1, SP-1, NF-kB șiSMAD2/3. Astfel, reglarea în sus a CTGF induce migrarea, proliferarea și inflamația celulelor, provocând astfel acumularea de ECM [35-37].

Pe baza acestor rezultate ale studiilor anterioare, am speculat că MAPK șiSMADsemnalizare, precum și factorii de transcripție AP{-1 și SP{-1, poate legăturile comune dintre PAI-1 și acumularea de ECM indusă de CTGF în mod progresivrinichiboala si tubulointerstitialafibroză. Astfel, am investigat dacă6-BIOar putea preveni progresia cronicărinichiboală prin reglarea PAI-1 și CTGF.

2. Material și metode

2.1. Anticorpi și reactivi

Anticorpii primari utilizați au fost anticorpi anti-iepure împotriva PAI-1 (11907), TGF (3711), fosforilațiSMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454), ERK fosforilat (P-ERK) (9101), P38 fosforilat (P-P38) (4631), JNK fosforilat (P-JNK) (9251), C-JUN fosforilat (PC-JUN) (3270) , C-FOS fosforilat (PC-FOS) (5348) și histona H3 (9715), toate obținute din Tehnologia de semnalizare celulară. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),SMAD6 (sc-25321) au fost obținute de la Santa Cruz Biotechnology. Anticorpi -actină de șoarece (a5316) și (2'Z,3'E)-6-Bromo indirubin-3-oximă (6-BIO) (B1686) au fost obținute de la Sigma-Aldrich.

2.2. Experimente pe animale

Toate experimentele pe animale au fost efectuate urmând ghidurile și reglementările relevante. Protocolul experimental a fost aprobat de Comitetul pentru Reglementările privind îngrijirea animalelor (ACR) al Școlii de Medicină a Universității Naționale Chonnam (CNUH IACUC-18010, 19 aprilie 2019). Experimentele au fost efectuate folosind șobolani Sprague-Dawley masculi (180–200 g, Samtako, Coreea) [38]. Șobolanii au fost ținuți la temperatură controlată (21 ± 2 ◦ C) într-un ciclu de 12 ore lumină-întuneric. Șobolanii au fost împărțiți în trei grupuri: control (n=6), obstrucție ureterală unilaterală (UUO, n=6) și UUO cu6-BIOtratament (n=6).6-BIO({{0}},2 mg/kg/zi) a fost injectat intraperitoneal (ip) timp de 6 zile. Pentru a dezvolta un model de șobolan cu nefropatie obstructivă, operația a fost efectuată după cum urmează: UUO a fost indusă prin ligatura ureterului stâng timp de șapte zile. Cavitatea abdominală a fost deschisă și a fost plasată o ligatură de mătase 2-0 la ureterul proximal stâng. Grupul de control a primit același tratament timp de șapte zile, cu excepția ligaturii. Șobolanii au avut acces liber la hrana standard pentru șobolani și apă de la robinet și au fost sacrificați în ziua 7 după operație. Therinichiau fost îndepărtate rapid și prelucrate pentru imunohistochimie și western blot.

2.3. Histologie

Rinichițesuturile au fost fixate cu 4% paraformaldehidă, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 5 um grosime. Au fost efectuate proceduri de colorare cu hematoxilină și eozină (H&E), acid periodic Schiff (PAS), roșu Sirius și tricrom Masson (MT) pentru a evalua morfologia histologică. Colorația H&E, PAS, roșu Sirius s-a efectuat conform instrucțiunilor producătorului. Pentru colorarea MT, după deparafinizarea cu xilen, secțiunile au fost tratate cu soluție Bouin la 56 ◦ C timp de 30 de minute și spălate sub jet de apă de la robinet până când secțiunile au fost limpezi. Ulterior, secțiunile au fost colorate cu hematoxilină Weigert (A: B=1:1), urmată de colorare cu soluție de Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin timp de 10 minute și spălare cu apă distilată. Secțiunile au fost incubate cu soluție de acid fosfotungstic/acid fosfomolibdic timp de 10 minute și tratate cu soluție de albastru de anilină timp de 15 minute. Secțiunile au fost ulterior incubate cu acid acetic timp de 1 min și deshidratate cu etanol și xilen. Depunerile de colagen, nucleele și fibrele musculare au fost colorate în albastru, negru și, respectiv, roșu. Analiza cantitativă a secțiunii colorate a fost efectuată folosind software-ul ImageJ.

2.4. Analiza Western blot

Celulele au fost recoltate, spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) răcită cu gheață, resuspendate în tampon de liză și sonicate pentru scurt timp. Tamponul de extracție a proteinei a constat din 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, cocktail inhibitor de protează (GenDEPOT, P3100– 001), și cocktail inhibitor de fosfatază

(GenDEPOT, P3200–001). După centrifugare, supernatanții care conțin extractele proteice au fost colectați și concentrațiile de proteine ​​au fost măsurate folosind un kit de testare a proteinelor Pierce® BCA (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, SUA). Proteinele au fost separate pe geluri de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 12% și transferate pe membrane de nitroceluloză. Petele au fost blocate la temperatura camerei timp de 1 oră cu 5% lapte degresat în PBS care conține 0,1% Tween-20 (PBST). Blot a fost apoi incubat peste noapte cu anticorpul primar (1;2000) la 4 ◦ C, urmată de incubare cu anticorpul secundar (1:2500) și în final cu anticorpi anti-iepure conjugați cu peroxidază de hrean, așa cum s-a descris anterior [39]. ]. Benzile de proteine ​​specifice au fost vizualizate folosind un sistem de chemiluminiscență îmbunătățit. Analiza cantitativă a

intensitatea benzii a fost efectuată folosind software-ul ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA).

2.5. doborarea siRNA

Pentru distrugerea SP-1, SP-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) și siRNA de control (Santa Cruz, sc{-37007) au fost transfectate timp de 24 de ore în celule HK-2 și NRK49F la o confluență de 60% folosind reactiv de transfecție Dhar-maFECT 1 (Dharmacon, T-2001-02) la o concentrație finală de 30 nM. Celulele au fost incubate în mediu fără ser timp de o zi într-un 37^◦ Incubator C sub o atmosferă umidificată de 5% CO 2, pretratat cu 6-BIO timp de 1 oră și stimulat cu TGF- timp de 24 de ore. Eficiența knockdown-ului a fost determinată prin analiza Western blot.

2.6. Transfecția tranzitorie a plasmidei și a constructului raportor

Celulele au fost crescute până la 60-70 la sută confluente, spălate cu mediu DMEM-F-12 (celule HK-2) sau DMEM (celule NRK49F) și apoi incubate timp de 24 de ore în mediul respectiv fără ser și antibiotice. . Celulele au fost apoi transfectate cu construct C-JUN dominant-negativ, precum și reporter PAI-1, CTGF, AP-1 și SP{-1 purtând vector pGL3 folosind reactiv FuGene HD. Concentrația plasmidei reporter utilizată în transfecția tranzitorie a fost de 2 μ g (1 μ g/ μ L). Celulele transfectate cu reporter au fost pre-tratate cu 6-BIO timp de 1 oră și incubate cu 10 ng/mL TGF timp de 16 ore.

2.7. Testul reporterului promotor

Construcțiile reporter PAI-1 și CTGF au fost produse de BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Republica Coreea). Construcțiile reporter pGL3-AP-1 și pGL{3-SP{{-1 au fost oferite cu amabilitate de profesorul Young Do Jung (Universitatea Națională Chonnam). Reglarea transcripțională a PAI-1, CTGF, AP-1 și SP{-1 a fost investigată prin transfecția tranzitorie a constructelor lor respective pGL3-promotor-reporter luciferază. Celulele HK-2 și NRK49F (5 × 10 5) au fost însămânțate și crescute până s-a atins o confluență de 60-70%. Apoi, constructele promotorului și vectorii pGL3-goalți au fost transfectate în celule folosind FuGene HD, conform protocolului producătorului. Plasmida pRL-nulă care codifică Renilla luciferaza a fost inclusă în toate probele pentru a monitoriza eficiența transfecției. La 24 de ore după transfecție, nivelurile activităților licuricilor și Renilla luciferazei au fost măsurate secvenţial dintr-o singură probă folosind sistemul de testare Dual-Glo Luciferase (Promega). Activitatea luciferazei Firefly a fost normalizată la activitatea Renilla și la cantitatea relativă de activitate a luciferazei în celulele netratate.

2.8. Microscopie laser confocală

Şobolanrinichiprobele au fost fixate în paraformaldehidă 4%, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 3- μ m grosime.Rinichisecțiunile au fost deparafinate și rehidratate, blocate, spălate cu PBS și incubate cu anti-PAI-1, anti-CTGF, anti-PC-JUN, anti-PC-FOS, anti-SP-1 și anticorpi anti-AQP1 diluați în tampon de blocare, timp de 24 ore at

4 ^◦C. După spălare, secțiunile au fost incubate cu un Alexa Fluor 488 (fluorescență verde) capră anti-iepure (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA), Cy3 (fluorescență roșie) capră anti-șoarece sau capră anti-iepure (Invitrogen). , Oregon) anticorpi timp de 2 ore. Celulele HK{-2 și NRK49F (3 ×10 5) au fost însămânțate în camere de godeuri {{{{0}}și incubate timp de 24 de ore la 37 ◦ C. Celulele au fost pretratate cu 5 μ M 6-BIO timp de 1 oră și apoi expus la 10 ng/mL TGF timp de 16 ore. După spălare cu 1X PBS, celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă la temperatura camerei timp de 15 minute și blocate timp de 2 ore la temperatura camerei cu 1X PBS care conține 1% BSA și 0,2% Triton X-100. Celulele au fost apoi incubate cu anticorpi monoclonali de iepure sau de șoarece împotriva PAI-1, CTGF, PC-JUN, PC-FOS și SP{-1 (diluate 1:200 în tampon de blocare) la 4 grade timp de 24 de grade. h. După spălare, celulele au fost incubate cu anticorpii secundari respectivi (anticorpi Cy3 capră anti-iepure și anti-șoarece, anticorpi Alexa Fluor 488 capră anti-iepure și anti-șoarece, diluați 1:200) timp de 2 ore la temperatura camerei. După spălare, lamelele au fost montate pe microlame utilizând reactiv ProLong Gold Antifade cu DAPI (Life Technologies Corporation). Imaginile au fost analizate la microscopul confocal de scanare laser Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Germania).

2.9. analize statistice

Rezultatele au fost exprimate ca medie ± SEM. Comparații multiple între grupuri au fost efectuate prin testul post hoc ANOVA unidirecțional și diferența semnificativă sinceră (HSD) a lui Tukey. Rezultatele cu p < 0.05="" au="" fost="" considerate="" semnificative="">

3. Rezultate

3.1. 6-BIO atenuează modificările morfologice și expresia markerilor asociați cu fibroză în modelul de șobolan UUO

Am evaluat efectele 6-BIO asuprafibrozăînrinichia unui model de șobolan UUO. După cum se arată în Fig. 1A, modelul UUO a prezentat o creștere semnificativărinichiafectarea tubulointerstițială, scleroza glomerulară, infiltrarea interstițială a celulelor mononucleare, depunerea de colagen interstițial șifibrozăîn comparație cu martorii, așa cum este determinat de colorarea H&E, PAS, Sirius Red și MT. În plus, proteinele legate de EMT care inducrinichifibrozăprecum și colagenul I și -IV care cresc acumularea de ECM au fost crescute în UUO comparativ cu martorii (Fig. S1A și C). Cu toate acestea, aceste modificări au fost atenuate de tratamentul 6-BIO. Fig. 1B arată că după 7 zile de obstrucție, expresia proteinelor PAI-1, CTGF, -SMA și TGF a crescut în rinichii șobolanilor model UUO în comparație cu cea a martorilor, iar această creștere a fost atenuată de tratament cu 6-BIO. Expresia luifibroticmarkerii au crescut semnificativ în UUO în comparație cu martorii, ceea ce a fost contracarat de6-BIOtratament (Fig. 1C). Colorația prin imunofluorescență (Fig. 1D) a arătat că expresia PAI-1 și CTGF (fluorescență roșie) a crescut în zonele obstrucționate.rinichila zi-7 în comparație cu controalele. Cu toate acestea, expresia PAI-1 și CTGF a scăzut după tratamentul cu 6-BIO (Fig. 1D). În mod colectiv, aceste descoperiri sugerează că 6-BIO atenuează daunele tubulointerstițiale prin inhibarea expresiei PAI-1 și CTGF.

3.2. 6-BIO atenuează expresia PC-JUN, PC-FOS, SP-1 și inhibă căile de semnalizare asociate fibrozei în modelul de șobolan UUO

Apoi, am stabilit dacă6-BIOafectează căile de semnalizare legate derinichifibroză. În primul rând, am confirmat asta6-BIO, care este un inhibitor cunoscut al GSK3, inhibă fosforilarea GSK3. Fig. S1A și B arată reducerea GSK3 cu 6-BIO. Fig. 2A prezintă TGF/SMADcale de semnalizare. Analiza Western blot a arătat că expresia fosforilatăSMAD2/3 șiSMAD4 proteine ​​crescute în UUOrinichi, care a fost atenuat de tratamentul 6-BIO (Fig. 2A). In orice caz,SMAD6, care inhibă fosforilarea SMAD 2 și activitatea luiSMAD4 [40], au avut rezultate opuse. În plus, semnalizarea MAPK joacă un rol cheie înrinichifibroză [41,42]. Am efectuat o analiză Western blot pentru a determina dacă 6-BIO afectează semnalizarea MAPK. Nivelurile de ERK, JNK și P38 fosforilate au crescut în UUOrinichicomparativ cu cei de controlrinichi(Fig. 2B). Expresia ERK și JNK fosforilate a fost redusă semnificativ prin tratamentul 6-BIO, în timp ce scăderea nivelului de p38 fosforilat a fost neglijabilă (Fig. 2B).SMADși căile de semnalizare MAPK au fost reglate în sus în grupul UUO, care a fost inversat de către6-BIOtratament (Fig. 2C). Sunt implicați mulți factori de transcripțierinichifibrozăși joacă roluri cheie în reglarea expresiei genelor în aval. Fig. 2D arată că după 7 zile de obstrucție, expresia proteinelor PC-JUN, PC-FOS și SP-1 a crescut înrinichide șobolani cu UUO în comparație cu cel de la martori, iar această creștere a fost atenuată de tratamentul cu 6-BIO. În mod similar, expresia AP-1 și SP-1, factorii importanți de transcripție care regleazărinichigenele legate de fibroză, a fost semnificativ crescută înrinichide șobolani cu UUO, dar a fost atenuat la tratamentul cu 6-BIO (Fig. 2E). Fig. 2F prezintă colorarea prin imunofluorescență a PC-JUN, PC-FOS. și SP-1. Fluorescența roșie a colorației PC-JUN, PC-FOS și SP-1 a fost semnificativ crescută în zonele obstrucționate.rinichi, în comparație cu martorii și a fost scăzută de tratamentul 6-BIO. Aceste rezultate confirmă faptul că AP-1 și SP-1 sunt factori importanți de transcripție implicațirinichifibroză și6-BIOpoate scădearinichifibroză prin atenuarea activității lor transcripționale.

Pentru partea 2, faceți clicAici.