PARTEA 1 Efectele antioxidante și anticoagulante ale glicozidelor fenilpropanoide izolate din rapiță (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria și P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

o Universitatea din Ło´d´z, Departamentul de Biochimie Generală, Facultatea de Biologie și Protecția Mediului, 90-236 Ł´od´z, Polonia

b Departamentul de Biochimie și Calitatea Culturii, Institutul de Știința Solului și Cultivarea Plantelor, Institutul de Cercetare de Stat, 24-100 Puławy, Polonia

Centrul pentru Cercetare și Conservarea Biodiversității, Departamentul de Biologie a Mediului, Institutul de Biologie, Universitatea Jan Kochanowski, 25-406 Kielce, Polonia

Abstract

Plante holoparazitare ale Orobanchaceae, inclusivCistanche, Orobanche și Phelipanche spp, sunt cunoscute pentru bogăția lor de glicozide fenilpropanoide (PPG). S-a descoperit că mulți compuși PPG posedă un spectru larg de activități, cum ar fi antimicrobiene, antiinflamatorii, antioxidante și de îmbunătățire a memoriei. Pentru a explora mai bine potențialul de bioactivitate al rapițelor europene (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) și a zece constituenți fenilpropanoizi unici izolați, am investigat acțiunea lor antiradicalică, efectul protector împotriva oxidării în sistemul plasmatic in vitro. și influența asupra parametrilor de coagulare. Extractele testate au arătat o activitate de captare de 50-70% din puterea lui Trolox. Extractul OC, bogat înacteozid, a avut un potențial antiradical cu peste 20 la sută mai bun decât extractul de PR, care era singurul care conținea PPG lipsit de un fragment catecol B-ring în unitatea acil. Mai mult, s-a constatat că doar opt PPG-uri testate au demonstrat potențial antioxidant în plasma umană tratată cu H2O2/Fe; cu toate acestea, cele trei PPG testate posedau un potențial anticoagulant în plus față de proprietățile antioxidante. Se pare că structura PPG, în special prezența fragmentelor acil și catecol, este în principal legată de proprietățile lor antioxidante. Potențialul anticoagulant al acestor compuși este, de asemenea, legat de structura lor chimică. PPG-urile selectate prezintă potențialul de a trata bolile cardiovasculare asociate cu stresul oxidativ.

Pentru mai multe informații, vă rugăm contactați:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosa are multe efecte

1. Introducere

Stresul oxidativ este larg cunoscut pentru impactul său negativ asupra sănătății organismelor vii, inclusiv îmbătrânirea accelerată și unele tipuri de cancer. Apariția stresului oxidativ este asociată cu un echilibru perturbat între mecanismele oxidative și antioxidante (inclusiv apărarea enzimatică (catalază, glutation peroxidază) și non-enzimatică (glutation) în celulele corpului [1]. Supraproducția de specii reactive de oxigen (ROS), inclusiv radicali oxidanți și specii cu înveliș închis, este unul dintre principalele mecanisme din spatele formării stresului oxidativ. Cu toate acestea, efectul biologic cauzat de ROS depinde în mare măsură de concentrație, timpul de expunere și locație. În condiții normale (concentrație scăzută), radicalii oxigen/azot pot juca rolul de mesageri secundari, dar la un nivel superior, aceștia pot începe să reacționeze cu structurile biologice, cum ar fi membranele celulare [2]. Dintre toate speciile de ROS, un radical hidroxil (HO.) cauzează una dintre cele mai mari daune bio-macromoleculelor: proteine, lipide și ADN. Se știe că stresul oxidativ joacă un rol important într-o serie de boli, inclusiv cele cardiovasculare. Tulburările sistemului sanguin au fost corelate și/sau precedate de modificări ale diverșilor parametri ai hemostazei și biomarkerilor plasmatici [1,3].

Pe de altă parte, multe substanțe naturale, cum ar fi polifenolii și acizii grași polinesaturați, au fost identificate ca antioxidanți puternici capabili să prevină formarea și/sau diminuarea speciilor reactive de oxigen. Compușii cu astfel de proprietăți se găsesc în multe produse alimentare și preparate farmaceutice de origine vegetală. O dietă îmbogățită cu legume și fructe proaspete, precum și terapiile antioxidante bazate pe antioxidanți naturali, sunt, așadar, recomandate pe scară largă, deoarece pot reduce nivelul de stres oxidativ și pot preveni diferite procese fiziopatologice [4,5]. Polifenolii vegetali sunt un grup divers de metaboliți secundari, printre care acizii fenolici ocupă un loc important, deoarece sunt distribuiti pe scară largă și prezintă o varietate de efecte biologice, cum ar fi antimicrobiene, antioxidante și antiinflamatorii. Glicozidele fenilpropanoide (PPG) sunt esteri derivați ai acidului hidroxicinamic și reprezintă principala/singura clasă de metaboliți secundari prezenți în plantele holoparazitare Orobanchaceae, inclusivCistanche, Orobanche și Phelipanche spp. Mai multe specii din această familie sunt dăunători serioși ai culturilor de care fermierii doresc să scape pe câmp (exemplu de Phelipanche ramosa), puține sunt folosite în farmacologie, în timp ce majoritatea au o importanță mică pentru om. HerbaCistancheeste utilizat pe scară largă în medicina tradițională asiatică în tratamentul deficienței renale și ca agent de îmbunătățire a imunității și memoriei, anti-îmbătrânire și antioboseală [6]. Analizele fitochimice ale diferitelor grupuri de cercetare au demonstrat că glicozidele fenilpropanoide, cum ar fi acetonida, echinacozidul și partea de podium, sunt unul dintre principalele ingrediente active ale Herba Cistanche [7]. Un studiu recent al mai multor specii de mături găsite în Polonia de Jedrejek și colab. [8] a arătat că acest material vegetal are o compoziție calitativă similară (dominarea PPG), în plus, egalează sau chiar depășeșteCistanchespp. în ceea ce privește conținutul de substanțe active [8].

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

Prezentul studiu a avut ca scop evaluarea potențialului antiradical și antioxidant, precum și a influenței asupra parametrilor hemostazei a celor trei extracte de măturină (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipache Arenaria – PA și P. ramosa – PR) bogate în diferite fenil. -

prostanoizii, precum și constituenții lor unici PPG. Capacitatea antiradicalică a fost măsurată folosind acid 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonic/echivalent Trolox (ABTS/TE) și 2,2-difenil-1-picrilhibrazil (DPPH) ) teste. Stresul oxidativ în sistemul de testare cu plasmă a fost indus folosind un radical hidroxil (H2O2/Fe), apoi peroxidarea lipidelor (testul speciilor reactive la acid tiobarbituric (TBARS)) și s-a măsurat nivelul de proteine ​​carbonil și grupări tiol. Printre parametrii determinați ai hemostazei au fost: timpul de tromboplastină parțială activată (APTT), timpul de protrombină (PT) și timpul de trombină (TT).

2. Materiale și metode

2.1. Produse chimice

2,2-radical2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), acid 2,2′-azinobis{-3-etilbenztiazolin-6-sulfonic (ABTS), persulfat de potasiu, {{9} }}hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acid carboxilic (Trolox), dimetilsulfoxid (DMSO), acid tiobarbituric (TBA), acid formic (grad LC-MS), și H2O2 au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., SUA). Metanolul (grad de gradient HPLC) și acetonitril (gradul LC-MS) au fost achiziționate de la Merck (Darmstadt, Germania). zece fenil-

compuși propanoici testați în această lucrare, inclusiv 2′-O-acetilaceozidă (97 la sută), 2′-O-acetilpoliumozidă (98 la sută), 3-O-metilpoliumozidă (96 la sută), acetonidă (99 la sută), arena interior (97 la sută), crenatozidă (98 la sută), teniposidă (99 la sută), poliumozidă (99 la sută), tubulozidă A (96 la sută) și wiedemanniozidă D (96 la sută) au fost izolate anterior de noi din materialul vegetal de mai jos. 8]. Puritatea compușilor a fost evaluată utilizând o analiză UHPLC-PDA-MS. Apa ultrapură a fost preparată intern folosind un sistem de purificare a apei Milli-Q (Millipore Co.). Alți reactivi au fost de calitate analitică și au fost furnizați de furnizori comerciali interni.

2.2. Material vegetal

Plante cu flori din trei specii de mături, inclusiv Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel și P. Ramos (L.) Pomel au fost identificate de prof. Renata Piwowarczyk (Universitatea Jan Kochanowski, Kielce, Polonia) și colectate dintr-o sursă naturală din Polonia.

Exemplare voucher (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), pajiști xerotermi, parazitează Galium boreale, mai 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.3652◦N, 22.3652◦N, 22.3652◦N, 22.3652◦N, 22.3652◦N, 22.3652◦N, 22.5801) pârghie, parazitează Artemisia campestris, iunie 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), câmp, parazitează Solanum Lycopersicum, septembrie 2014) sunt depuse la Herbarul Universității Jan Kochanowski din Kielce (KTC). Materialul vegetal a fost liofilizat și măcinat fin înainte de extracție.

2.3. Prepararea extractelor de mătură

Materialul vegetal sub formă de pulbere (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g și P. ramosa (PR) – 3 g) a fost extras cu 80% MeOH la 40 ◦ C și 1500 psi (presiunea solventului) ) folosind un ASE 200 accelerat

extractor cu solvent (Dionex, Sunnyvale, CA, SUA). Extractele au fost evaporate și liofilizate (uscator de congelare Gamma 2–16 LSC, Christ, Germania). Eficiența extracției pentru OC, PA și PR a fost de 55 la sută, 37 la sută și, respectiv, 43 la sută din greutatea materialului vegetal. Datorită conținutului ridicat de carbohidrați (datele nu sunt prezentate), extractele brute au fost purificate în continuare prin extracție în fază solidă (SPE) pe micro-coloană Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, SUA). Zaharurile au fost îndepărtate cu 1% MeOH, apoi compușii de interes au fost eluați cu 80% MeOH. După îndepărtarea solventului, extractele OC, PA și PR au fost liofilizate (uscator de congelare Gamma 2–16 LSC), iar randamentele de purificare SPE au fost de 53% (OC), 67% (PA) și 51% (PR) .

2.4. Caracteristicile fitochimice ale extractelor de mătură

Analizele calitative și cantitative ale extractelor de mătură au fost efectuate utilizând un sistem ACQUITY UPLC (Waters) conectat la un detector cu matrice de fotodiode (PDA) și un spectrometru de masă cu patru poli tandem (TQD-MS/MS). Extractele liofilizate OC, PA și PR au fost dizolvate în 50 procente de metanol la o concentrație de 0,50 mg/mL și apoi

cromatografiat pe coloană BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters). Condițiile cromatografice au fost următoarele: temperatura cuptorului – 25 ◦C,

gradient liniar 10→25% din faza mobilă B (0,1% acid formic în acetonitril) în faza mobilă A ({0,1% acid formic în H2O) peste 12 min, debit – 0,4 mL/min, volum de injectare – 2 μL, interval UV – 190–490 nm (rezoluție 3,6 nm). Analiza MS a fost efectuată în modul ion negativ cu ionizare electrospray (ESI), utilizând următoarele setări: interval de scanare 100–1200 m/z; tensiune capilară 2,8 kV; tensiune de con 35 V;

temperatura sursei 150 ◦C; temperatura de dezolvare 450 ◦C; dezolvare

debit de gaz 900 L/h, iar debit de gaz conic 100 L/h. Achiziția și prelucrarea datelor au fost efectuate folosind software-ul Waters MassLynx 4.1.

Picurile de glicozidă fenilpropanoid (PPG) au fost identificate prin compararea datelor LC-MS obținute cu cele ale compușilor izolați anterior [8]. Cuantificarea PPG-urilor din extractele de rapiță sa bazat pe metoda UPLC-UV cu detectare la 330 nm și o calibrare standard externă folosindacteozid(Sigma-Aldrich, 99 la sută, HPLC) ca

standard de grup. O curbă de calibrare liniară a fost pregătită în șase concentrații în intervalul 1-200 ug/mL și a prezentat o liniaritate bună (R2

0.999). Rezultatele cantitative reprezintă valoarea medie SD a trei injecții și au fost exprimate în miligrameacteozidechivalenți (echivalenți) per gram de extract (mgacteozideq/g).

2.5. Activitate antiradicalică in vitro

2.5.1. Analiza de captare radicală ABTS

Testul antiradical ABTS a fost efectuat folosind metoda descrisă de Kontek și colab. [9], cu ușoare modificări, după cum urmează: 20% MeOH a fost utilizat pentru a prepara reactivi (7 mM ABTS și 4,9 mM potasiu per-

sulfat); soluțiile de extracte OC, PA și PR, la patru niveluri de concentrație în intervalul 100—400 ug/mL, și soluții Trolox, la șase niveluri de concentrație în intervalul 10 250 ug/mL, au fost preparate cu 50% MeOH. Proporția probei față de soluția de lucru ABTS a fost 1:25 (v/v). Absorbanța la 734 nm a fost măsurată după 30 de minute de incubare

în întuneric folosind un spectrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SUA).

Inhibarea absorbanței (procent) a fost calculată după cum urmează: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

S-au calculat echivalenții Trolox (TE) ai extractelor de mături

folosind formula TE=msample/mstandard, unde m este panta dreptei

curbe de linii (inhibarea absorbanței vs. concentrație). Valoarea TE a

eșantionul descrie activitatea sa normalizată împotriva Trolox (TEstandard =

1.0). Valorile IC50 pentru extractele OC, PA și PR și Trolox au fost

atinse experimental, apoi au fost calculate din linia lor dreaptă

curbe (inhibarea absorbanţei vs. concentraţie) şi sunt exprimate în

ug/mL.

Testul a fost efectuat în trei exemplare, iar rezultatele sunt prezentate

ca mijloace ± abateri standard (SD).

2.5.2. Testul de captare a radicalilor DPPH

Testul antiradical DPPH a fost efectuat folosind metoda descrisă de Jedrejek și colab. [8] și Brand-Williams și colab. [10], cu ușoare modificări, după cum urmează: soluțiile de extracte OC, PA și PR, la patru niveluri de concentrație în intervalul 50▽ 250 ug/mL, și soluții Trolox, la șase niveluri de concentrație în intervalul 10▽ 250 ug/ml, au fost preparate cu 50% MeOH. Proporția probei față de DPPH a fost de 1:19 (v/v). Absorbanța la 517 nm a fost măsurată după 30 de minute de incubare în întuneric folosind un spectrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio). Inhibarea absorbanței (procent) a fost calculată după cum urmează: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Valorile echivalentului Trolox (TE) și IC50 ale probelor de testat au fost calculate în același mod ca în testul ABTS (Secțiunea 2.5.1). Testul a fost efectuat în trei exemplare, iar rezultatele sunt prezentate ca mijloace ± SD.

2.6. Soluții stoc de compuși vegetali testați și extracte pentru experimente cu plasmă umană

Soluțiile stoc ale compușilor testați și extractele de plante au fost preparate în 50 procente DMSO. Concentrația finală de DMSO în probele testate a fost mai mică de 0,05 la sută și efectele sale au fost determinate în toate experimentele.

2.7. Izolarea plasmei umane

Sânge uman, sau plasmă, a fost obținut de la șase donatori obișnuiți (bărbați și femei nefumători) la o bancă de sânge (Lodz, Polonia) și la un centru medical (Lodz, Polonia). Sângele a fost colectat ca soluție CPD (citrat/fosfat/dextroză; 9:1; v/v sânge/CPD) sau soluție CPDA (citrat/fosfat/dextroză/adenină; 8,5:1; v/v; sânge/CPDA). Donatorii nu au luat nici un medicament sau substanțe care dădeau dependență (inclusiv tutun, alcool și suplimente cu antioxidanți) timp de cel puțin două săptămâni înainte de o donație. Analiza noastră a probelor de sânge a fost efectuată în conformitate cu liniile directoare ale Declarației de la Helsinki pentru cercetarea umană și aprobată de Comitetul pentru etica cercetării în experimentarea umană de la Universitatea din Lodz. Plasma a fost preparată prin centrifugare a sângelui uman proaspăt la 4500x g timp de 25 de minute la temperatura camerei. Concentrația proteinei a fost calculată prin măsurarea absorbanței probelor testate la 280 nm, conform procedurii lui Whitaker și Granum [11].

2.8. Markeri ai stresului oxidativ în plasma umană

2.8.1. Măsurarea peroxidării lipidelor

Peroxidarea lipidelor plasmatice a fost cuantificată prin măsurarea concentrației de substanțe reactive la acid tiobarbituric (TBARS). Concentrația TBARS a fost calculată utilizând coeficientul molar de extincție (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Metoda este descrisă mai amănunțit altfel au fost [12,13]. 2.8.2. Măsurarea grupelor carbonil Nivelul grupelor carbonil a fost calculat utilizând coeficientul de extincție molar (ε=22,{000 M 1 cm 1 ) și a fost exprimat ca grupe carbonil nmol/mg de proteină plasmatică, conform lui Bartosz [ 13] și Levine și colab. [14]. 2.8.3. Determinarea grupării tiol Conținutul de grupă tiol din proteinele plasmatice a fost măsurat spectrofotometric utilizând un cititor de microplăci SPECTROstar Nano (BMG LABTECH, Germania) prin absorbanță la 412 nm cu acid 5,5'-ditiol-bis-(2- nitrobenzoic). Metoda este descrisă mai detaliat în altă parte [15–17].

2.9. Parametrii hemostazei

2.9.1. Măsurarea timpului de protrombină (PT)

PT a fost determinat coagulometric folosind o coagulare optică

Literele indică rezultatele testului lui Tukey (p < 0.05), valori cu aceleași

litera dintr-un rând nu este semnificativ diferită.

2.9.2. Măsurarea timpului de trombină (TT)

TT a fost determinat coagulometric folosind un analizor de coagulare optică (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polonia), conform metodei descrise de Malinowska și colab. [18].

2.9.3. Măsurarea timpului de tromboplastină parțială activată (APTT)

APTT a fost determinat coagulometric folosind un analizor de coagulare optică K-3002 (Kselmed, Grudziadz, Polonia) conform Mali now ska et al. [18].

2.10. Analiza datelor Testul Q-Dixon a fost efectuat pentru a elimina datele incerte.

Datele au fost testate pentru distribuția normală cu testul Shapiro-Wilk și egalitatea varianței cu testul Levene. Diferențele semnificative statistic au fost identificate folosind ANOVA, urmată de testul de comparații multiple al lui Tukey sau testul Kruskal-Wallis. Comparațiile au fost considerate semnificative la p < 0,05.="" valorile="" sunt="" prezentate="" ca="" medii="" ±="">